冰提苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白及其對(duì)冷凍面團(tuán)的影響

曲 敏，李凌俐， 劉羽佳， 陳鳳蓮， 孫兆國(guó)， 鮑 歡， 莫春生

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

冰提苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白及其對(duì)冷凍面團(tuán)的影響

曲 敏，李凌俐， 劉羽佳， 陳鳳蓮， 孫兆國(guó)， 鮑 歡， 莫春生

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

以紫花苜蓿草粉為原料，采用冰結(jié)合磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白。通過(guò)對(duì)苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白提取率的計(jì)算，對(duì)提取過(guò)程中的pH值、緩沖溶液的濃度、料液質(zhì)量體積比進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)得到提取苜蓿冰潔構(gòu)蛋白的最佳工藝參數(shù)為：料液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL，緩沖液pH 8.0，磷酸鹽緩沖液濃度為61 mmol/L，其最終提取率可達(dá)到 2.87%。利用生物顯微鏡對(duì)苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，可以觀(guān)測(cè)到許多體積小、且呈現(xiàn)六棱型及多邊型的不規(guī)則形狀，說(shuō)明其對(duì)冰晶生長(zhǎng)及冰晶形態(tài)的抑制與修飾效果顯著，具有很好的抗凍活性。利用SDS-PAGE對(duì)苜蓿冰潔構(gòu)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，確定其蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為52 000，苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白應(yīng)用到冷凍面團(tuán)中發(fā)現(xiàn)可改善面團(tuán)的品質(zhì)。

苜蓿；冰結(jié)構(gòu)蛋白；冰提法；冰晶；冷凍面團(tuán)

冰結(jié)構(gòu)蛋白 （ice structuring proteins，ISPs），又稱(chēng)為不凍蛋白、抗凍蛋白 （antifreeze proteins，AFPs），是一類(lèi)由某些魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、真菌和細(xì)菌為抵御外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽，能夠有效地抑制冰晶生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)[1-5]。1992年，加拿大科學(xué)家Griffth等[6]首先在冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了植物ISPs，隨后Urrutia在多種植物中發(fā)現(xiàn)了具有抗凍活性的蛋白質(zhì)；1994年，費(fèi)云標(biāo)[7]等從沙冬青葉片中分離得到了ISPs。此外，研究人員陸續(xù)從女貞葉[8]、冬小麥麩皮[9]、胡蘿卜[10-11]、冬黑麥草[12-13]等植物中分離得得到了ISPs。近年來(lái)，ISPs作為一類(lèi)新型食品添加劑，其生物學(xué)功能備受人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，將不同來(lái)源的ISPs應(yīng)用到冷凍食品中，能夠明顯改善其感官特性[14-16]，提高冷凍食品的品質(zhì)。但迄今為止，分離得到的ISPs大多價(jià)格昂貴，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

苜蓿（Medicago sativa L.），俗稱(chēng)金花菜，屬豆科多年生牧草，是世界上分布最廣、栽培歷史最古老的優(yōu)良草，有“牧草之王”的美譽(yù)。苜蓿草多在我國(guó)東北、新疆等地有種植，具有很強(qiáng)的抗寒功能。經(jīng)極端低溫（-45℃）后，返青率仍可達(dá)到90%以上[17]。由于苜蓿草蛋白質(zhì)含量豐富，抗寒能力強(qiáng)，且苜蓿草價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，因此選用苜蓿草為研究對(duì)象。作者根據(jù)冰結(jié)構(gòu)蛋白具有能夠特異性吸附冰晶表面并阻止冰晶生長(zhǎng)的性質(zhì)[18]，采用磷酸鹽緩沖溶液浸提法[19]，結(jié)合改進(jìn)冰法提取苜蓿ISPs，優(yōu)化工藝參數(shù)，利用改進(jìn)的冰晶觀(guān)察法觀(guān)察冰晶形態(tài)確定其抗凍活性，利用SDS-PAGE確定相對(duì)分子質(zhì)量，并將提取后蛋白質(zhì)添加到冷凍面團(tuán)中，檢測(cè)其物性指標(biāo)變化，研究苜蓿ISPs的抗凍活性及對(duì)冷凍面團(tuán)的質(zhì)地及物性的影響，為拓寬植物ISPs資源、獲得廉價(jià)ISPs及其在冷凍食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花苜蓿：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所蘭西苜蓿種植基地提供；Tris-Base、考馬斯亮藍(lán)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；SDS、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉：Summus公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

721 E可見(jiàn)分光光度計(jì)：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；粉碎機(jī)：沈陽(yáng)龍騰電子秤量?jī)x器公司產(chǎn)品；TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)、SDS-PAGE電泳儀：德國(guó)哈默公司產(chǎn)品；DM750生物顯微鏡DM750：瑞士萊卡公司產(chǎn)品；JY5000電泳儀：北京市君意機(jī)電技術(shù)公司產(chǎn)品；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀：英國(guó)SMS公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 將苜蓿干草除塵，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成草粉后，草粉過(guò)80目篩備用。采用KDY-9820半自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定苜蓿干草中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 直接干燥法（GB/ T5009-2010）。

1.3.3 冰球制備 采取改進(jìn)的緩沖溶液結(jié)合冰提提取苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白。預(yù)制備一定數(shù)量冰球，冰球的規(guī)格為直徑2 cm。

1.3.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及提取率的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)比色法，通過(guò)測(cè)定不同牛血清蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用分光光度計(jì)595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光值，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及冰提苜蓿ISPs的提取率。計(jì)算方法如下：

式中：m1為冰提后溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m2為總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取5 g苜蓿草粉分成相應(yīng)份數(shù)，分別于不同料液質(zhì)量體積比、緩沖溶液pH、緩沖液濃度的磷酸鹽緩沖溶液混合攪拌，在室溫下提取不同時(shí)間，然后8 000 r/min離心機(jī)離心15 min，取離心后溶液，并記錄體積，取1 mL稀釋100倍后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)測(cè)其吸光值。將剩余液體加入提前凍好的冰球，置于-18℃冰箱中，提取2 min，待冰球吸附ISPs達(dá)到飽和濾出冰球。冰球融化后測(cè)定溶液的吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。

1.3.6 響應(yīng)曲面法確定最佳提取條件 根據(jù)單因素的分析結(jié)果，通過(guò)顯著性分析根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以苜蓿ISPs提取率為響應(yīng)值，在篩選單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取率影響顯著因素進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，由于料液質(zhì)量體積比影響效果最弱，因此綜合考慮選擇pH值、磷酸鹽緩沖溶液濃度、冰球添加量3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels in the three-factor and threelevel response surface design for protein extraction

1.3.7 冰晶觀(guān)察 將苜蓿蛋白上清液濃縮后，將苜蓿蛋白提取液冷凍干燥制成干粉，配成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的ISPs溶液，4 000 r/min離心10 min，移液槍取20 μL置加厚載玻片上，-18℃冰箱冷凍20min。于Leica DM750顯微鏡40X下進(jìn)行冰晶觀(guān)察。并與同質(zhì)量濃度氯化鈉、蔗糖溶液及水的冰晶進(jìn)行對(duì)照。觀(guān)察各溶液及水的冰晶大小與形態(tài)[20-21]，并拍照。

1.3.8 冰提苜蓿ISPs的測(cè)定 采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE電泳法。以低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)定樣品的相對(duì)分子質(zhì)量，測(cè)定冰提后的粗蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布。SDS-PAGE凝膠采用Laemmli的方法配制。采用整個(gè)電泳膠板有4 g/dL的濃縮膠（pH 6.8）和12 g/dL的分離膠（pH 8.8）組成。按表配成凝膠貯液。凝膠固定后，將樣品與上樣緩沖液混合均勻后上樣。電泳儀連接電源進(jìn)行電泳，至示蹤染料與凝膠底部相差1 cm時(shí)，表明電泳可結(jié)束[22]。用染色液染色后再對(duì)其脫色后拍照。

1.3.9 苜蓿ISPs對(duì)冷凍面團(tuán)的影響 用高筋粉制作面團(tuán)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%蒸餾水，混合均勻，在和面機(jī)中攪拌10 min，制作空白面團(tuán)。 令取高筋粉與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%苜蓿ISPs混合，在和面機(jī)中攪拌20min，將制備好的面筋蛋白分成每份25 kg，做平行試驗(yàn)，將其制作成半球狀面團(tuán)，用保鮮膜包好在常溫下穩(wěn)定1 h后，置入-36℃速凍2 h，然后置于-18℃冰箱中凍藏5 d。測(cè)定時(shí)需在室溫下解凍2 h，采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定冷凍面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)參數(shù)，測(cè)定方法：T.P.A；探頭速率：P/50；測(cè)試前速率：2.00 mm/s；測(cè)試中速率：1.00 mm/s；測(cè)試后速率：1.00 mm/s；壓縮程度：50%；停留間隔：5 s。選取硬度、內(nèi)聚性、回復(fù)性、彈性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)對(duì)添加苜蓿ISPs的冷凍面團(tuán)進(jìn)行質(zhì)地影響評(píng)價(jià)[23-26]。

2 結(jié)果與討論

2.1 苜蓿干草中蛋白質(zhì)與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，“肇東”紫花苜蓿干草中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.8%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%。

2.2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=0.008 6x+0.010 2，R2=0.997 4，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)性良好。

2.3 冰結(jié)構(gòu)粗蛋白提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對(duì)苜蓿ISPs提取率的影響 由實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)料液質(zhì)量體積比在1 g∶5 mL～1 g∶20 mL時(shí)蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì)，從 1.74%上升到2.73%，隨后提取率下降。因此最適料液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL。

2.3.2 緩沖液pH對(duì)苜蓿ISPs提取率的影響 當(dāng)pH值在6～8提取率逐漸升高。冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取率從 0.45%升到 2.79%，在 8.0時(shí)出現(xiàn)最大值2.79%，但當(dāng)pH值大于8.0時(shí)反而降低，因此最適pH為8.0。

2.3.3 緩沖液濃度對(duì)苜蓿ISPs提取率的影響 當(dāng)緩沖液的濃度從10 mmol/L到60 mmol/L時(shí)蛋白質(zhì)提取率呈上升趨勢(shì)，從1.27%上升到2.68%，隨后提取率下降。因此，緩沖溶液最適濃度為60 mmol/L。

2.3.4 冰球添加量苜蓿ISPs提取率的影響 隨著冰球數(shù)量的增加，苜蓿ISPs的提取率呈上升趨勢(shì)，從0.84%上升至2.62%，隨后下降。蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到頂點(diǎn)，但是當(dāng)冰球數(shù)量添加過(guò)多時(shí)提取率反而下降。實(shí)驗(yàn)確定添加的冰球數(shù)量為40個(gè)。

2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素進(jìn)行方差分析，可知影響冰結(jié)構(gòu)粗蛋白提取率因素的順序依次為：冰添加量C＞緩沖液pH A＞緩沖液濃度B＞料液質(zhì)量體積比。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理可以看出，選擇磷酸鹽緩沖溶液濃度、pH值、冰晶添加量等3個(gè)因素對(duì)苜蓿ISPs提取率的影響較大，因此，采用三因素三水平的響應(yīng)分析方法優(yōu)化求取優(yōu)化的工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)為17次。優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果，見(jiàn)表2與表3。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由方差分析結(jié)果可知，方程高度顯著，且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.241 2＞0.05）；響應(yīng)曲面模型的校正決定系數(shù)為R2Adj=0.959 1，說(shuō)明該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，建立的模型是合適的。二次項(xiàng)A2、B2、C2（P＜0.01）為及顯著。交互作用AB、AC、BC（P＞0.05）不顯著。回歸方程為：提取率=2.86-0.025A+ 0.064B+0.074C+0.05AB+0.015AC-0.022BC-0.39A2-0.29B2-0.54C2。各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要程度從各因素的F值反應(yīng)體現(xiàn)，即：F值越大，表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。因此可知對(duì)苜蓿冰結(jié)構(gòu)粗蛋白提取率影響程度從大到小順序?yàn)椋罕砑恿浚揪彌_液濃度＞緩沖液pH。

通過(guò)響應(yīng)曲面分析，得到冰結(jié)合緩沖溶液提取苜蓿ISPs最優(yōu)條件為：緩沖液pH為7.99，緩沖液濃度為61.06 mmol/L，冰添加量為45.33個(gè)，得到苜蓿ISPs的提取率為2.87%，雖稍低于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)值，但接近于提取條件的預(yù)測(cè)值，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相符。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.5 冰晶觀(guān)察

由圖1、圖2可知，苜蓿ISPs的冰晶呈不規(guī)則形狀，多呈四邊形、六邊型、圓形、小圓形、異形等多種形態(tài)，冰晶形態(tài)豐富，體積小數(shù)量多，排列與分布均勻。從對(duì)照可以看出，水對(duì)照的冰晶形態(tài)，體積最大，呈大圓泡型，排列致密；NaCl溶液對(duì)照的冰晶形態(tài)，體積較小，數(shù)量不多，形態(tài)單一，呈長(zhǎng)六邊形；蔗糖溶液對(duì)照的冰晶，數(shù)量多，體積小，形態(tài)單一，呈小圓形，但排列較緊密。可見(jiàn)，苜蓿ISPs對(duì)于抑制冰晶生長(zhǎng)、修飾冰晶形態(tài)具有顯著的效應(yīng)，說(shuō)明苜蓿ISPs具有較好的抗凍活性。

圖1 苜蓿ISPs與對(duì)照的冰晶觀(guān)察（40X）Fig.1 Several solution compered with water ice crystals to observe（40X）

圖2 苜蓿ISPs溶液的冰晶形態(tài)Fig.2 Moiled ISPs ice crystal morphology

2.6 苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

由圖3可知，在52 000處左右有比較清晰的條帶，在30 000到35 000處也有條帶，但不是很明顯，但是無(wú)法判斷哪一個(gè)是具有抗凍活性的蛋白，有待進(jìn)一步分離提取。

圖3 ISPs聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 SDS-PAGE tested of Alfalfa ISPs

2.7 添加苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白的冷凍面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的變化

空白組與添加ISPs的面團(tuán)分別做3組平行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出均值與標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行顯著性分析，由表3可以看出，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的ISPs與空白組相比較：硬度差異顯著（p＜0.05），硬度略有減小、內(nèi)聚性差異不顯著（p＞0.05），略有下降；彈性差異不顯著（p＞0.05），略有增大；膠黏性與咀嚼性差異不顯著（p＞0.05），略有下降；回復(fù)性差異顯著（p＜0.05），有所下降。所以總體來(lái)說(shuō)添加冰結(jié)構(gòu)蛋白的冷凍面團(tuán)可對(duì)其品質(zhì)產(chǎn)生一定量的影響。

3 結(jié)語(yǔ)

1）利用改進(jìn)的冰結(jié)合磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿ISP，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，得到提取苜蓿ISP的最佳工藝條件為料液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL、緩沖液pH 7.99、緩沖液濃度為61.06 mmol/L、冰球添加量為45.33個(gè)，最終提取率為2.87%。

表3 冷面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定Table 3 Texture properties of frozen dough

2）采用電子顯微鏡對(duì)冰提法提取的苜蓿ISPs進(jìn)行冰晶形態(tài)觀(guān)察，并以水、蔗糖、NaCl溶液等做對(duì)照進(jìn)行比較，可以看出苜蓿ISPs呈四邊形、六邊型、圓形、小圓形、異形等多種形態(tài)，冰晶形態(tài)豐富，說(shuō)明苜蓿ISPs對(duì)于抑制冰晶生長(zhǎng)、修飾冰晶形態(tài)具有顯著的效應(yīng)，具有較好的抗凍活性。

3）利用聚丙烯酰胺電泳對(duì)苜蓿ISPs進(jìn)行檢測(cè)，確定其所含蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為52 000。

4）將苜蓿ISP應(yīng)用于冷凍面團(tuán)中，測(cè)定冷凍面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)特性，發(fā)現(xiàn)添加苜蓿ISPs的冷凍面團(tuán)的硬度、彈性、內(nèi)聚性等參數(shù)均有所改善，說(shuō)明面團(tuán)品質(zhì)有所提高。

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會(huì)議名稱(chēng)(中文)：華南地區(qū)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)聯(lián)合年會(huì)

所屬學(xué)科：生物物理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)

開(kāi)始日期：2017-11-16

結(jié)束日期：2017-11-18

所在城市：廣西壯族自治區(qū) 南寧市

主辦單位：廣西生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)

聯(lián)系人：劉予嫻

聯(lián)系電話(huà)：13768318007

E-MAIL：gxswhxyfzswxxh@163.com

會(huì)議背景介紹：為促進(jìn)華南地區(qū)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)科發(fā)展，廣西生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)、廣東省生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)、海南省生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)、深圳市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)共同主辦，廣西大學(xué)承辦的“華南地區(qū)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)聯(lián)合年會(huì)”定于2017年11月中旬在廣西南寧舉行。本次學(xué)術(shù)會(huì)議將邀請(qǐng)?jiān)谏I(lǐng)域有重要影響的科學(xué)家做大會(huì)特邀報(bào)告，同時(shí)也為活躍在本領(lǐng)域的青年工作者提供學(xué)術(shù)交流的平臺(tái)。

會(huì)議論文提交：以電子郵件附件方式，提交至gxswhxyfzswxxh@163.com

Extraction of Alfalfa Ice Structuring Proteins Using Ice and Their Effect on Frozen Dough

QU Min， LI Lingli， LIU Yujia， CHEN Fenglian， SUN Zhaoguo， BAO Huan， MO Chunsheng
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

In this study，ice structuring proteins were extracted from the Alfalfa meal powder using ice of Alfalfa were optimized by calculation of extraction efficiency，single-factor experiment and response extraction with phosphote buffer solution Furthermore，the extraction conditions for ice structuring proteins surface methodology.The results revealed that the extraction yield of Alfalfa ice structuring proteins was up to 2.87%，when the extraction was carried out by suspending in 61 mmol/L phosphate buffer solution at pH 8.0 with a solid/liquid ratio of 1∶20 and 46 ice pieces were added in per 100 milliliters of crude extracts.Additionally，the observed ice crystal morphology suggested that the ice structuring proteins of Alfalfa which mostly showed six hexagons or irregular shapes were small in size，indicating that ice structuring proteins of Alfalfa are able to modify the conformations of ice crystals and significantly inhibit the growth.the protein molecular weight ofAlfalfa ice structuring proteins is about for 52 kDa，which was by SDS-PAGE.

Alfalfa，ice structuring protein，ice extraction，ice crystal，frozen dough

TS 201.1

：A

：1673—1689（2017）07—0726—07

2015-08-29

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011-24）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（LBH-Q13098）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12511128）。

曲 敏（1966—），女，黑龍江哈爾濱人，理學(xué)博士，教授，主要從事新型植物蛋白及食品添加劑研究。E-mail：qumin777@126.com

曲敏，李凌俐，劉羽佳，等.冰提苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白及其對(duì)冷凍面團(tuán)的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（07）：726-732.