柑橘汁中嗜酸耐熱菌的分離、鑒定以及單寧酸對其抑菌作用研究

劉穎沙， 李建科， 張 琳， 劉美慧， 宋兵兵

（1.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.楊凌職業技術學院 生物工程分院，陜西 楊凌712100）

柑橘汁中嗜酸耐熱菌的分離、鑒定以及單寧酸對其抑菌作用研究

劉穎沙1，2， 李建科*1， 張 琳1， 劉美慧1， 宋兵兵1

（1.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.楊凌職業技術學院 生物工程分院，陜西 楊凌712100）

采用酸化的凱氏培養基對柑橘中的嗜酸耐熱菌進行分離、培養純化和鑒定并與標準菌株進行對比，再用不同濃度的單寧酸對柑橘中的嗜酸耐熱菌進行抑菌試驗，確定最低的抑菌濃度。結果表明，分離得到的兩株可疑菌可在25～55℃溫度范圍以及2.4～6.0的pH值范圍，符合嗜酸耐熱菌的特點。與標準菌株在菌落形態、顯微形態、生理生化特性以及16S rDNA等方面進行比較表明，2株分離菌與標準菌株有明顯的相似性。抑菌試驗表明，單寧酸對嗜酸耐熱菌有一定的抑菌作用，單寧酸的最低抑菌濃度為1.25 mg/mL，分離菌與標準菌表現高度相似性。

嗜酸耐熱菌；柑橘；單寧酸；抑菌

酸 土 環 脂 芽 孢 桿 菌 （Alicyclobacillus acidoterrestris），俗稱為耐熱菌、嗜酸耐熱菌、耐熱耐酸菌等。嗜酸耐熱菌為非致病菌，不產生任何已知的毒素。美國NFPA（國家食品生產者聯合會）的專家Walls等作了嗜酸耐熱菌的致病性試驗，結果表明嗜酸耐熱菌及其次生代謝物（愈創木酚、鹵酚等）對豚鼠在受試范圍內無毒性作用。2000年起，國際貿易中嚴格要求每10 mL濃縮果汁中其含量小于1個，美國及歐洲大部分國家從2002年起要求在濃縮果汁不得檢出酸土環脂芽孢桿菌。目前，國內外針對蘋果汁、橙汁、橘汁等溫帶果蔬汁及混合果蔬汁中酸土環脂芽孢桿菌的研究有較多報道[1-7]。

作者以柑橘汁為材料，在分離嗜酸耐熱菌并對其形態、生理生化及16S rDNA區鑒定的基礎上，應用單寧酸對嗜酸耐熱菌進行控制，為提高橙汁加工安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

1.1.1 標準菌 Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922：購自德國菌種保藏中心。

1.1.2 凱氏培養基 （K氏培養基） 0.2 g吐溫80，0.2 g葡萄糖，0.5 g酵母粉，1.0 g蛋白胨，3.0 g瓊脂粉，溶于200 mL蒸餾水中，混勻，備用。加入0.5 g蘋果酸溶于4 mL蒸餾水調酸。

1.1.3 LB培養基 10 g胰蛋白胨，10 g酵母粉，5gNaCl，15 g瓊脂，1 L蒸餾水，混勻，備用。

1.1.4 402培養基 0.2 g（NH4）2SO4，0.25 g CaCl2·2H2O，0.5 g MgSO4，2.0 g酵母粉，5.0 g葡萄糖，5.0 g KH2PO4，溶于1 000 mL蒸餾水中，混勻，備用。用體積分數10%H2SO4調pH值至4.0。

1.2 柑橘汁中嗜酸耐熱菌的分離、純化和篩選

1.2.1 分離及保藏培養基的制備 嗜酸耐熱菌的分離及保藏均采用酸化的凱氏培養基。1×105Pa高壓滅菌25 min，冷卻至50～60℃，混入蘋果酸溶液進行酸化處理，備用。

1.2.2 柑橘汁中菌種的分離 參照美國庫克實驗室的方法對嗜酸耐熱菌進行分離[8]。

1.2.3 嗜酸耐熱菌的純化 將分離得到的嗜酸耐熱菌菌株在K氏培養基上進行平板劃線純化，45℃恒溫條件下培養。按此方法連續劃線，直至單個平板上為形態單一的菌落。挑取平板上的單菌落進行純培養，得到純菌株[9]。

1.2.4 嗜酸耐熱菌的篩選 用嗜酸耐熱菌的選擇培養基（用于果汁中嗜酸耐熱菌的檢測）對分離菌進行篩選。

1.3 嗜酸耐熱菌菌種鑒定

從嗜酸耐熱菌的檢測和篩選試驗中篩選出的2株可疑嗜酸耐熱菌的菌株。

1.3.1 嗜酸耐熱菌的耐酸耐熱特性鑒定 耐酸特性鑒定試驗：將純培養的嗜酸耐熱菌菌株劃線接種于LB平板培養基 （pH 7.0），45℃恒溫培養箱中培養48 h，保留不能在LB平板生長的菌[10]。

耐熱特性鑒定試驗：將鏡檢為純培養的嗜酸耐熱菌菌株制成菌懸液，進行熱休克處理，再采用涂布法接種于K氏平板培養基上45℃培養24 h，保留可以生長的菌落[11]。

1.3.2 菌落形態 將標準酸土環脂芽孢桿菌和分離得到的2株分離菌，分別劃線接種至K培養基平板上，每株菌3個重復，倒置平板，于45℃培養2～4d，觀察出現的單菌落的形態特征。

1.3.3 顯微形態 將標準酸土環脂芽孢桿菌和分離得到的2株分離菌分別進行革蘭氏染色，然后顯微鏡下觀察其細胞形態[12]。

1.3.4 生理生化特征 根據《伯杰細菌鑒定手冊》[13]和《常見細菌系統鑒定手冊》[14]等工具書將標準菌株和各分離菌分別進行接觸酶試驗、氧化酶試驗、V-P試驗、明膠液化試驗和淀粉水解試驗等生理生化試驗。為了保證耐熱菌生長所需要的酸性條件，一般采用蘋果酸酸化的培養基進行以上生理生化試驗。

1.3.5 分子生物學鑒定 采用DNA測序法來對耐熱菌進行鑒定，其具體操作如下

1）基因組DNA提取 取2 mL菌液至EP管中，8 000 r/min 2 min，去上清；加140 μL LTE混勻，加60 μL溶菌酶（10 mg/mL），37℃孵育10 min；加400 μL Digestion buffer，混勻后，加3 μL蛋白酶k混勻，55℃孵育5 min；加260 μL乙醇混勻，全部轉入UNIQ-10柱中，10 000 r/min 1 min，棄收集管中的廢液；加500 μL Wash Solution，10 000 r/min 30 s，重復1次；10 000 r/min 2 min甩干柱中液體。將UNIQ-10柱轉移至新的EP管中；加60℃預熱的洗脫液50 μL，室溫放置3 min。12 000 r/min 2 min，EP管中的液體即為DNA溶液；電泳：上樣3 μL。

2）PCR擴增 擴增使用引物：選用細菌16S rDNA 通用引物 27F與 1492R， 序列位于Escherichia coli的16S rDNA基因序列兩端保守區域[15]。

委托北京愛普拜生物技術有限公司合成，并進行PAGE純化。

PCR反應體系見表1。

表1 PCR反應體系Table 1 PCR reaction system

PCR擴增條件：94℃ 3 min預變性；94℃ 30 s，50℃45 s，72℃100 s，35循環；72℃延伸7 min；4℃保存。

3）DNA序列的測定 將DNA寄往英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，然后將得到的DNA序列提交到 European Molecular Biology Laboratory（EMBL）核酸數據庫。再將DNA序列通過Blast程序與Genebank中已有的核酸序列進行比較，確定菌株的分類地位。

1.4 菌株培養的生長條件確定

1.4.1 pH值的確定 采用蘋果酸溶液調整培養基的pH值，測定耐熱菌生長的pH值范圍。配制pH分別為2.0～7.0的培養基，將標準耐熱菌和各分離菌分別接種于不同pH值的培養基上，培養2～5 d觀察其生長情況，初步確定菌株生長的pH值，再將其精確到0.1，將菌接種于微調后的不同pH值培養基中，培養2～5 d觀察各菌的生長情況，最終確定各菌適宜生長的pH值。

1.4.2 生長溫度的確定 液體培養基以蘋果酸溶液酸化后分裝試管，分別接入標準耐熱菌和各分離菌的菌懸液，置于20～70℃不同溫度條件下培養2～5d，觀察培養液的濁度及液面產生的菌膜等生長特征，最初確定生長溫度范圍，再將此溫度精確到1℃，再將菌置于微調后的不同溫度下培養2～5 d觀察各菌的生長情況，確定各菌的適宜生長溫度。

1.5 標準耐熱菌、分離菌生長曲線的確定

將標準菌和分離菌接入滅菌的液體培養基中，于41℃溫度下培養，每隔2 h取樣1次，測定菌體的吸光度值，觀察30 h后，分別建立標準耐熱菌和各分離菌在41℃溫度下的生長曲線。

1.6 抑菌性的研究

1.6.1 單寧酸抑菌活性的測定 采用濾紙片法測定抑菌圈直徑[16-17]：取直徑為6 mm的滅菌濾紙片放入不同濃度的單寧酸溶液中浸泡過夜，另取濾紙片放入體積分數為20%乙醇溶液中作對比空白試驗，將嗜酸耐熱菌的菌懸液取100 μL與相應固體培養基制成含菌平板，再用無菌鑷子夾取浸有各種濃度的單寧酸溶液的濾紙片，放入含菌平皿中，同一濃度每皿3片，做3個重復試驗。按上述相應條件培養，量取抑菌圈直徑，取平均值。觀察結果確定單寧酸的抑菌效果。

1.6.2 最低抑菌質量濃度的測定 采用瓊脂二倍稀釋法[18-19]測定單寧酸對細菌的最低抑菌濃度（MIC）：另取乙醇溶液作為對照，記為0 mg/mL。每質量濃度樣品各取2 mL放入不同平皿中，然后分別加入18 mL已滅菌并融化的固體培養基，立刻混勻，待培養基冷卻凝固后，各加100 μL調至一定菌濃的菌菌懸液于對應瓊脂平板上，劃線，細菌于41℃恒溫培養24 h，肉眼觀察無細菌菌落形成的最小單寧濃度為最小抑菌濃度，每組重復3次。

2 結果與討論

2.1 菌種的分離、純化結果

通過分離、篩選及純化，得到了2株嗜酸耐熱菌，即分離菌1和分離菌2，分離獲得到的這2株菌，在酸性K氏培養基上生長良好，但無法在LB培養基上生長，表明這兩株菌均具有嗜酸性。均可經過80℃13 min的熱處理后可很好生長，表明這兩株菌具有耐熱性。初步確定兩者為嗜酸耐熱菌。

經過3次純化后的分離菌肉眼可見形態，分離菌的菌落形態為圓形，大小為1.5～3.3 mm，顏色為乳白色至淺黃色，表面光滑、有光澤、潮濕，無凸起，不透明，易挑取。兩株分離菌的菌落形態特征與酸土環脂芽孢桿菌的標準菌落形態特性類似。

2.2 菌種的篩選結果

用BSSA培養基 （用于果汁中嗜酸耐熱菌的檢測）對分離菌進行篩選，結果為兩株菌均可較好生長，進一步表明兩株分離菌為嗜酸耐熱菌。

2.3 菌種的鑒定結果

2.3.1 細胞形態鑒定結果 按1.3方法分離培養可以得到大量的耐熱菌，這些耐熱菌用通常的細菌檢測方法難以檢出，在41℃條件下常需2～3 d可形成明顯的菌落。對分離得到的2株耐熱菌進行革蘭氏染色和光學顯微鏡觀察，如圖1和表2所示，標準耐熱菌、分離菌1和分離菌2的細胞顯微形態十分相似，為桿狀。革蘭氏染色結果表明，分離菌菌均為G+菌。

圖1 各菌株繁殖體顯微鏡形態的觀察結果（10×40）Fig.1 Micro-morphology of vegetative form（10×40）

表2 標準菌與分離菌的菌落與細胞形態特征Table 2 Colony and cell of standard strains and isolated strains

2.3.2 生理生化反應結果 標準菌、分離菌1和分離菌2的生理生化反應結果如表3所示，各項生理生化特性與標準相同。由此可見，這兩株分離菌與標準菌株均由明顯的相似性。

表3 標準菌與分離菌生理生化反應分析Table 3 Results of physiological characteristics

通過對菌種的形態觀察和生理生化鑒定，可以得知2株分離菌與標準菌的各項指標相似，初步認為2株分離菌均屬于環脂芽孢桿菌屬。對分離的2株菌進行分子生物學分類鑒定，進一步確定其分類地位。

2.3.3 分子生物學鑒定 利用細菌試劑盒提取2株分離菌的DNA，電泳檢測后進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序。分離菌的DNA及PCR產物電泳圖見圖2。由圖可知，PCR產物擴增之后得到的序列長度均在1 200 bp左右。

圖2 DNA及PCR產物電泳圖Fig. 2 DNA electrophoresis and PCR product electrophoresis

將得到的DNA序列提交到European Molecular Biology Laboratory（EMBL）核酸數據庫。再將DNA序列通過Blast程序與Genebank中已有的核酸序列進行比較，得到標準菌與分離菌1，標準菌與分離菌2的序列同源性達到了99%，確定3種菌為同一種菌，為Alicyclobacillus acidoterrestris.（Alicyclobacillus acidoterrestris gene for 16S rRNA，strain：DSM 2 498下比對）

2.4 培養條件的確定

標準菌、各分離菌的培養條件見下表，各菌在25～55℃溫度范圍以及2.4～6.0的pH值范圍內均能良好生長，且生長條件基本相同。均符合酸土環脂芽孢桿菌的特有嗜酸耐熱的生長條件特性。

表4 各菌株培養的生長條件分析Table 4 Results of cultural characteristics

2.5 各菌株生長曲線結果

標準菌、各個分離菌的生長曲線見下圖所示。由下圖可見標準菌和分離菌的生長趨勢較為一致。均在12 h后由調整期進入對數期，20 h時進入穩定生長期；當生長到26 h之后菌體濁度緩慢降低，步入衰亡期，三者有較高的類似性。

2.6 單寧酸的抑菌活性

單寧酸對嗜酸耐熱菌有一定的抑菌作用，濃度越大，抑菌效果越明顯。單寧酸產生抑制作用的主要原因有破壞細胞壁結構和改變細胞膜的通透性有關系[20]。

圖3 耐熱菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of standard and isolated thermotolerant bacteria

2.7 單寧酸對嗜酸耐熱菌的最低抑菌濃度

試驗表明：單寧酸對嗜酸耐熱菌有明顯的抑菌效果，最低抑菌質量濃度為1.25 mg/mL。

3 結語

1）采用酸化的K氏培養基可以對柑橘中耐熱菌進行有效地分離培養。各分離菌形態特征、生長及生理生化特性以及通過嗜酸耐熱菌的選擇培養基來看，初步鑒定分離菌為嗜酸耐熱菌。經對所分離耐熱菌的16S rDNA序列測定，鑒定出分離耐熱菌為酸土環脂芽孢桿菌，且分離耐熱菌與標準耐熱菌的序列同源性達到了99%，分離得到的2株嗜酸耐熱菌與標準菌有明顯的相似性。

2）分離得到的兩株可疑菌可在25～55℃溫度范圍以及2.4～6.0的pH值范圍，符合嗜酸耐熱菌的特點。

3）抑菌試驗表明，單寧酸對嗜酸耐熱菌有一定的抑菌作用，單寧酸的最低抑菌質量濃度為1.25 mg/mL，單寧酸有望成為天然食品抑菌劑。

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歐盟發布黃蓍膠作為食品添加劑的安全風險評估報告

2017年6月9日，歐盟委員會發布黃蓍膠作為食品添加劑的安全風險評估報告，根據“委員會條例（EU）”第257/ 2010號（EFSA ANS Panel，2014）重新評估某些食品添加劑的風險，并得出以下結論：

1.本評估僅限于報告的用途（70個食品類別中的5個）和使用量；

2.黃蓍膠不太可能被完整的吸收，并被腸道微生物部分發酵；

3.有充足的毒理數據可用；

4.對黃蓍膠的遺傳毒性沒有任何擔憂（E413）;

5.最高劑量分別為6120和9120mg/kg，雌雄小鼠均未發現致癌作用；

6.口服每天攝入大量的黃蓍膠達2900mg（相當于每天141mg/kg體重）21天在人體中耐受性良好，沒有任何不良影響報道。

綜上，對于黃蓍膠（E413）作為報告中食品類別食品添加劑的用途和使用量評估，沒有安全問題。

［信息來源］廈門WTO工作站.歐盟發布黃蓍膠作為食品添加劑的安全風險評估報告 [EB/OL].(2017-6-13).http:// www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=54603

Isolation，Identification and Antibacterial Effect by Tannic Acid of Thermoacidiphilic Bacteria From Citrus

LIU Yingsha1，2， LI Jianke*1， ZHANG Lin1， LIU Meihui1， SONG Bingbing1
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shanxi Normal University，Xi'an 710119，China；2. College of Biological Engineering，Yangling Vocational Technical College，Yangling 712100，China）

In order to provide methods to provent Thermoacidiphilic Bacteria From juice，we study the characteristics of Thermoacidiphilic Bacteria from citrus.The Thermoacidiphilic Bacteria which was isolated from the citrus was investigated by comparison with the standard strain using Kirin-medium acidified with malic acid.Different concentrations of tannic acid were tested in Thermoacidiphilic Bacteria from citrus.The minimal inhibitory concentration was measured through the agar dilution.The results shows the two polluted bacteria isolated from citrus can grow under the temperature of 25～55℃and pH of 2.4～6.0，which was corresponded with the characteristics of the Thermoacidiphilic Bacteria.Furthermore，the cellmorphology，colony morphology，cultural characteristics，physiological characteristics and 16S rDNA tests indicated the two isolated strains of Thermoacidiphilic Bacteria have obviously similar characteristics with the standard strain.Theresults showed that tannins had good antibacterial activities on thermoacidiphilic bacteria，MIC of which is 1.25 mg/mL.Isolates show a high degree of similarity with the standard strains.

Thermoacidiphilic Bacteria，citrus，tannic acid，antibacterial

S 666

：A

：1673—1689（2017）07—0767—06

2015-07-07

劉穎沙（1990—），女，陜西西安人，工學碩士，助教，主要從事營養與食品衛生學研究。 E-mail：18709233612@163.com

*通信作者：李建科（1960—），男，陜西西安人，教授，博士研究生導師，主要從事食品營養與安全研究。E-mail：jiankel@snnu.edu.cn

劉穎沙，李建科，張琳，等.柑橘汁中嗜酸耐熱菌的分離、鑒定以及單寧酸對其抑菌作用研究[J].食品與生物技術學報，2017，36（07）：767-772.