β-紫羅蘭酮脂質體包封率測定方法研究

王一涵， 徐迎波， 寧 敏， 周志磊，梁 蓉，陳 羚， 徐菲菲，鐘 芳*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.安徽中煙工業有限責任公司 煙草化學安徽省重點實驗室，安徽合肥230088；3.江南大學 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

β-紫羅蘭酮脂質體包封率測定方法研究

王一涵1，2， 徐迎波2， 寧 敏2， 周志磊1，梁 蓉3，陳 羚1， 徐菲菲1，鐘 芳*1

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.安徽中煙工業有限責任公司 煙草化學安徽省重點實驗室，安徽合肥230088；3.江南大學 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

采用薄膜超聲法制備β-紫羅蘭酮脂質體，通過反透析法分離脂質體和游離物質，并以高效液相色譜法為分析手段對其包封率進行測定。在選定色譜條件下，輔料不干擾測定，β-紫羅蘭酮在5～80 mg/L的質量濃度范圍內線性關系良好（R2=0.999 8），日內和日間精密度（RSD）均小于3%；透析平衡時間為12 h，游離物回收率符合要求（99.21%～101.22%），且透析20 h內無滲漏，方法重現性好；使用此法測得β-紫羅蘭酮脂質體的平均包封率為（52.76±1.10）%。反透析法簡便，準確，經濟，適用于β-紫羅蘭酮脂質體包封率的測定。

β-紫羅蘭酮脂質體；薄膜超聲法；包封率；反透析法

β-紫羅蘭酮[4-（2，6，6-三甲基-1-環己烯基）-3-丁烯-2-酮，β-ionone]是一種重要的香味化合物，為類胡蘿卜素9，10-雙鍵斷裂形成的氧化產物。其為淺黃色液體，具有濃郁的紫羅蘭香氣，接近煙草的木香，且帶有果香[1-2]，廣泛用于香水、煙草等行業中。對香氣成分進行包埋是對其進行保護和控制釋放的有效手段。在眾多包埋方法中，脂質體技術表現出很大的優勢。脂質體不僅可以有效地包埋和轉運親水和親油性物質[3]，其還具有靶向性，可以利用溫度，pH等條件的變化控制包埋物的釋放。作者利用溫度的變化（卷煙在抽吸時濾嘴的溫度約為40℃）控制脂質體中包埋的風味物質的釋放，制備適合添加于濾嘴中的溫度敏感型脂質體（40℃），開發出新的卷煙香精微膠囊化技術和加香方法。

包封率 （Entrapment Efficiency，EE%）指被包裹在脂質體囊中的芯材占脂質體混懸液中芯材總量的比例。對于熱敏脂質體而言，包封率是評價脂質體制備工藝和質量的重要指標。其測定方法主要分為兩種：一種是直接測定，另一種是將游離藥物與脂質體分離后測定。常用的分離方法有柱層析法，離心法等[4]。由于柱層析操作繁瑣，且葡聚糖G50為水溶性凝膠，較難洗脫脂溶性芯材；而超速離心法對設備轉速要求較高，還易使脂質體中的芯材泄漏。先前研究中有人采用氣相色譜法測定了環糊精中β-紫羅蘭酮的含量[5]，但對脂質體中β-紫羅蘭酮的包封率研究未見報道。再者，包埋的物質不同，包封率的測定方法不同，現有的包封率測定方法不適合測定紫羅蘭酮這種揮發性成分。因此作者采用薄膜超聲法制備了脂質體，并建立了測定β-紫羅蘭酮脂質體包封率的方法，為β-紫羅蘭酮脂質體的質量評價提供了依據。

1 材料

1.1 材料

二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC，氫化大豆卵磷脂HSPC：上海艾韋特醫藥科技有限公司產品；β-紫羅蘭酮：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司產品；乙腈：色譜純，上海沃凱化成工業有限公司產品；水：超純水。

1.2 儀器

旋轉蒸發器：R-205，上海申順生物科技有限公司產品；超聲波細胞粉碎機：南京菲奇工貿產品；磁力加熱攪拌器：C-MAG HS4，德國IKA產品；Waters高效液相色譜儀：美國waters公司產品。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

稱取一定比例的DPPC、HSPC、吐溫80和β-紫羅蘭酮于250 mL圓底燒瓶中，加入20 mL的無水乙醇，在50℃下水浴至溶，減壓旋轉蒸發除去乙醇，形成薄膜。再加入一定量的PBS（pH=6.8）緩沖溶液，旋轉蒸發水化30 min（50℃），迅速冷卻，于探頭式超聲儀上碎冰浴超聲處理4 min。50℃水溶2 h后于4℃靜置過夜，冷凍離心（4 500 g）30 min除去鈦顆粒，置于冰箱中保存[6-7]。

2.2 β-紫羅蘭酮脂質體質量濃度測定

圖1 β-紫羅蘭酮和輔料的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of beta-ionone and supplementary materials

2.2.1 檢測波長的確定 配制β-紫羅蘭酮標準品的乙醇溶液，并按比例配制對應輔料的乙醇溶液，在200～400 nm內進行紫外掃描，見圖1。通過紫外吸收圖譜可見，輔料在β-紫羅蘭酮最大吸收波長294 nm處干擾很大，故在選擇測定方法時，選擇輔料無干擾的HPLC系統。

2.2.2 HPLC的色譜條件和色譜行為 色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國waters公司）；流動相：V（乙腈）∶V（水）=70∶30等度洗脫；柱溫：30℃；流量：1.0 mL/min；檢測波長：304 nm；進樣體積：20 μL。取β-紫羅蘭酮溶液，空白脂質體破乳溶液和β-紫羅蘭酮脂質體破乳溶液各20 μL進樣分析。由圖2可見，雜質峰與β-紫羅蘭酮峰分離良好，輔料和試劑對β-紫羅蘭酮測定無干擾。

2.2.3 線性范圍及標準曲線 用乙醇準確配制質量濃度為100 mg/L的β-紫羅蘭酮對照品貯備液，4℃冰箱保存，分別精密吸取β-紫羅蘭酮對照品貯備液0.5、1、2、4、6、8 mL，置1～8號10 mL棕色容量瓶中，以乙醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為5、10、20、40、60、80 mg/L的紫羅蘭酮標準溶液，進液相色譜分析。以質量濃度C對峰面積A進行線性回歸，得回歸方程：A=83 597C-8 509.3，R2=0.999 8。實驗表明，β-紫羅蘭酮在5～80 mg/L的質量濃度范圍內，峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 Representative HPLC chromatograms used for specificity

2.2.4 進樣精密度和回收率實驗 取質量濃度為10，20，40，60 mg/L的β-紫羅蘭酮對照品貯備液，于1天和1周內重復進樣3次，進樣體積20 μL，測得日內精密度和日間精密度，結果見表1。

精密度用相對標準偏差表示，結果表明，在此條件下測定，RSD＜5%，重現性良好。

表1 HPLC的進樣精密度實驗結果Table 1 Intra-precision and Inter-precision of HPLC determination for beta-ionone

精密量取250 μL空白脂質體溶液，分別加入至125，350，625 μL的β-紫羅蘭酮貯備液 （1 000 mg/L）中，每個樣品各3份，以適量Triton X-100破壞脂質體，用水定容至10 mL，搖勻即得樣品溶液，分別進樣20 μL，測定峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 空白脂質體加β-紫羅蘭酮加樣回收率Table 2 Recovery of beta-ionone with blank liposomes

2.3 脂質體包封率的測定

2.3.1 反透析平衡時間的確定 精密量取脂質體混懸液5 mL置于250 mL燒杯中，用體積分數20%的乙醇水溶液稀釋至200 mL。再精密量取乙醇溶液5 mL于已處理的透析袋內，把透析袋浸入上述經稀釋的脂質體混懸液中，同時以磁力攪拌器攪拌，透析過程中，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、20 h吸取20 μL袋內透析液，并補充等量的釋放介質，HPLC進樣測定[8]。

實驗結果可知，10 h即可達到透析平衡，透析袋內外的游離β-紫羅蘭酮濃度相等，并且在20 h內脂質體不發生嚴重的滲漏現象，在此時間段內β-紫羅蘭酮濃度基本保持不變，為保證透析完全而脂質體不滲漏，將透析時間定為12 h。

2.3.2 反透析法游離紫羅蘭酮回收率 分別稱取一定量的β-紫羅蘭酮，用體積分數20%乙醇等滲液溶解，得β-紫羅蘭酮過飽和溶液，室溫避光條件下平衡24 h后，過0.22 μm微孔濾膜，制成β-紫羅蘭酮飽和溶液，即時進樣20 μL，得游離β紫羅蘭酮質量濃度Ctol。以此飽和溶液作為外相，取5 mL乙醇等滲液作為內相，透析時間與脂質體透析平衡時間（12 h）一致。透析平衡后取內相20 μL進樣，得游離β紫羅蘭酮透析量Cfree。回收率=（Cfree/Ctol）*100%。

結果表明，回收率在99.21%～101.22%之間。這說明采用反透析法能達到除去脂質體中游離β-紫羅蘭酮的目的，該方法可行。

2.3.3 β-紫羅蘭酮包埋率的測定 取一定量的脂質體混懸液到10 mL容量瓶中，加入等量的TritonX-100溶液，漩渦振蕩使脂質體解體，用超純水定容后過0.22 μm微孔濾膜，HPLC測定溶液里β-紫羅蘭酮的總質量濃度Ctol。

精密量取脂質體混懸液5 mL置于250 mL燒杯中，用乙醇溶液稀釋至200 mL。再量取的乙醇溶液5 mL于已處理的透析袋內，把透析袋浸入上述經稀釋的脂質體混懸液中，同時以磁力攪拌器攪拌，達到平衡時間（12 h）后，取透析袋內透析液20μL進樣，HPLC測定計算游離β紫羅蘭酮的質量濃度CFree。

式中，Ctol為脂質體溶液中β-紫羅蘭酮的總質量濃度；CFree為脂質體溶液中游離β-紫羅蘭酮的質量濃度。

3 結語

1）為保證紫羅蘭酮總含量測定的準確性，需將脂質體破乳，使β-紫羅蘭酮從載體中完全釋放出來。TritonX-100可溶解脂質體使溶液澄清，并且不干擾β-紫羅蘭酮含量的測定。因此，作者選擇TritonX-100為破乳溶劑。

2）分離脂質體中未被包埋的芯材的方法較多，如葡聚糖凝膠過濾法，超速離心法，超濾離心法，微柱離心法，濾膜法，反透析法等。

作者采用的反透析法則可避免因脂質體與游離芯材動態平衡被打破所導致的滲漏問題，且透析袋價格較低，比較經濟[9-11]。

3）因β-紫羅蘭酮的水溶性較差，而脂溶性較好，平衡透析法選擇透析介質為使用高濃度20%乙醇溶液，能將一個處方量游離的β-紫羅蘭酮完全溶解，即對游離β-紫羅蘭酮有一定的溶解能力，且又在平衡時間內不造成脂質體的滲漏[12]。

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Determination of Entrapment Efficiency of Beta-Ionone Liposomes

WANG Yihan1，2， XU Yingbo2， NING Ming2， ZHOU Zhilei1，LIANG Rong3， CHEN Ling1， XU Feifei1， ZHONG Fang*1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Tobacco Chemistry，China Tobacco Anhui Industrial Co.，LTD，Hefei 230088，China；3.Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A method used for determining the entrapment efficiency of beta-ionone in liposomes was established.The liposome was prepared by thin film evaporation.The free beta-ionone was separated from liposomes by reverse dialysis and quantified with HPLC.The results showed that the calibrated curve was linear（R2=0.999 8）within the range of 5～80 mg/L for beta-ionone.Intra-day and inter-day precision（RSD）were both less than 3%.The equilibrium time for the dialysis was 12 h，and the recoveries showed with good reproducibility （99.21%～101.22%），and the leaking percentage in 20 h was negligible.The average entrapment efficiency of beta-ionone liposome was 52.76±1.10%.The reverse dialysis method was convenient，accurate and economic，suitable for determining the encapsulation efficiency of beta-ionone liposomes.

Beta-ionone liposomes，thin film evaporation，entrapment efficiency，reverse dialysis method

TS 201.7

：A

：1673—1689（2017）07—0688—04

2015-07-06

國家自然科學基金項目（31171686）；煙草化學安徽省重點實驗室2013年開放課題資助項目（0920140109010）。

*通信作者：鐘 芳（1972—），女，河南新鄉人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品物性、食品膠體研究。E-mail：fzhong@jiangnan.edu.cn

王一涵，徐迎波，寧敏，等.β-紫羅蘭酮脂質體包封率測定方法研究[J].食品與生物技術學報，2017，36（07）：688-691.