PEG介導的柳枝稷葉肉細胞原生質體瞬時表達體系的建立

祁澤文,孫鑫博,樊波,張雪,袁建波,韓烈保*

(1.北京林業大學草坪研究所,北京 100083；2.河北農業大學河北省作物生長調控重點實驗室,河北 保定071001；3.深圳市園藝園林建設有限公司,廣東 深圳518038)

PEG介導的柳枝稷葉肉細胞原生質體瞬時表達體系的建立

祁澤文1,孫鑫博2,樊波3,張雪1,袁建波1,韓烈保1*

(1.北京林業大學草坪研究所,北京 100083；2.河北農業大學河北省作物生長調控重點實驗室,河北 保定071001；3.深圳市園藝園林建設有限公司,廣東 深圳518038)

為了建立以PEG介導的柳枝稷葉肉細胞原生質體瞬時表達體系,本研究以柳枝稷 Alamo品種的葉片為材料,通過設計梯度實驗確定柳枝稷原生質體分離的最佳條件, 每組梯度實驗重復3次, 方案如下：1)對植物培養的時間進行優化。酶解時間固定在8 h, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 將培養了1, 2, 3和4周的黃化苗用作實驗材料；2)滲透壓優化。選取2周的黃化苗為實驗材料, 酶解時間固定在8 h, 甘露醇濃度分別為0.4, 0.5, 0.6， 0.7和0.8 mol/L；3)酶解時間優化。選取2周的黃化苗為實驗材料, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解時間分別為6, 7, 8, 9和10 h。通過對比分析發現,苗齡為2周的柳枝稷黃化苗葉片在甘露醇為0.6 mol/L的酶解液中, 黑暗, 28 ℃并裂解8 h后分離的原生質體最為理想。接下來構建了能夠在植物細胞內表達GFP-MYB103融合蛋白(GFP為綠色熒光蛋白)的重組質粒LN-OsMYB103, 利用PEG介導法將質粒LN-OsMYB103轉化進入柳枝稷原生質體, 并且在激光共聚焦顯微鏡下觀察到了強烈的綠色熒光蛋白信號。該結果表明, 分離的原生質體可以行使正常生物學功能。綜上所述, 利用柳枝稷葉片建立了一套完整的柳枝稷葉肉細胞原生質體瞬時表達體系。這將為深入開展柳枝稷的功能基因組學研究奠定了基礎。

柳枝稷；PEG；原生質體；瞬時表達

在現代分子生物學中, 瞬時表達方法已經成為了研究基因的重要手段, 被逐漸應用到各類生物學的研究中。植物細胞瞬時表達系統的建立, 為研究啟動子活性、基因功能和蛋白質定位提供了便利[1-2]。柳枝稷(Panicumvirgatum)屬禾本科黍亞科黍屬, 是一種多年生高稈的C4植物, 它起源于北美洛基山脈以東、北緯55°以南[3-4], 柳枝稷能用種子繁殖, 具有耐干旱, 耐貧瘠, 適應性強, 生物量潛力高等優良品質, 常被用于放牧、生態建設, 目前也是一種重要的生物燃料作物。在化石燃料儲量逐步下降、環境保護日益嚴峻的今天, 生物燃料受到了各國的高度重視, 生物燃料的原料來源成為生物燃料可持續發展的重要課題, 因此柳枝稷引起了國內外的重視[5-9]。

柳枝稷是一種異源多倍體植物, 具有自交不親和的遺傳特性, 通過傳統育種方法對其進行改良存在巨大的困難[5]。隨著技術的進步, 現代生物技術的發展, 通過基因工程手段進行遺傳改良成為一種快捷、有效的育種手段, 可以彌補傳統育種的不足[10-11]。

外源基因在植物中表達有兩種方式：一種通過農桿菌或者基因槍介導的方式, 外源基因整合到植物基因組中, 進行穩定表達；一種是在植物材料中進行順利表達的方法。而瞬時轉化的方法主要有：基因槍轟擊法[12]、農桿菌侵染法[13]、PEG(polyethylene glycol, 聚乙二醇)[14]介導的原生質體轉化等方法。PEG轉化法是一種通過PEG的滲透作用, 將外源基因轉入原生質體中的方法, 使用PEG法不僅費用低、操作簡便、不需特定儀器而且結果準確[15-16]。通過這種方法在很多植物中獲得了成功, 例如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)、柑橘(Citrusparadisi)和軟棗獼猴桃(Actinidiaargute)等原生質體瞬時表達體系中, 外源 DNA 轉化率均能達到10%以上[17]。模式植物擬南芥的外源DNA轉化率更是達到90%[2,18-20], 并為其功能基因組和基因功能的研究奠定了基礎。

在柳枝稷的遺傳轉化研究中, 國內外已經有很多學者進行了嘗試, 如Liu等[21]、Mazarei等[22]成功地建立了柳枝稷的遺傳轉化方法。而在原生質體瞬時表達的研究中, 國內外尚處于體系建立的探索階段[23-25]。因此針對這點, 本課題組進行原生質體瞬時表達體系的建立。要優化以PEG介導法建立的柳枝稷葉肉原生質體瞬時表達體系, 優化原生質體制備條件尤為重要。水稻(Oryzasativa)和柳枝稷同屬于禾本科植物, 可借鑒中國科學院遺傳與發育生物學研究所朱立煌課題組的水稻原生質體分離方法分離柳枝稷的原生質體, 以此為基礎, 本研究使用柳枝稷品種Alamo黃化苗原生質體為材料, 借鑒水稻原生質體分離方法并利用PEG介導的轉化法, 對柳枝稷原生質體分離主要因素進行分析及優化, 建立分離的原生質體的體系，并在此基礎上建立一套簡單、高效的柳枝稷葉肉原生質體瞬時表達體系, 優化柳枝稷的遺傳轉化體系, 旨在為提高柳枝稷遺傳轉化效率和改良柳枝稷的遺傳特性奠定基礎, 并推動柳枝稷在分子及細胞生物學領域的發展。

1 材料與方法

試驗于 2016年 9 月至 2016 年12 月在中國科學院遺傳與發育生物學研究所朱立煌組實驗室完成。

1.1供試材料

供試柳枝稷 Alamo品種的成熟種子購于美國 Ernst Conservation Seeds 公司。

1.2黃化苗的準備

選取柳枝稷種子, 在70%酒精中浸泡2 min 后, 將種子放在滅菌液(成分：巴士消毒液20%, 滅菌水80%)中, 在150 r/min的搖床上, 室溫, 30 min。種子滅完菌后用滅菌水洗凈, 在超凈工作臺下吹干, 然后播在滅菌的營養土中, 并維持在(28±2) ℃, 黑暗條件下培養。

1.3酶解液優化

參考水稻原生質體的提取方法[26], 在此基礎上優化條件, 使該方法適用于柳枝稷。原配方成分為酶解液, W5溶液, Mmg溶液和40% PEG溶液。具體的配方如下：酶解液為0.6 mol/L甘露醇(D-mannitol), 10 mmol/L MES [2-(N-嗎啡啉)乙磺酸,pH 5.7], 1.5% 纖維素酶(Cellulase RS), 0.75%果膠酶(Macerozyme), 0.1% BSA(牛血清白蛋白), 3.4 mmol/L CaCl2, 5 mmol/L β-羥基乙醇(β-mercaptoethanol)和50 μg/mL羧芐青霉素(carbenicillin)；W5溶液為154 mmol/L NaCl, 125 mmol/L CaCl2, 5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES；Mmg溶液為0.6 mol/L甘露醇, 15 mmol/L MgCl2和4 mmol/L MES;40% PEG溶液為0.6 mol/L甘露醇, 100 mmol/L CaCl2和40% PEG4000 (聚乙二醇4000)。

設計梯度實驗, 確定柳枝稷原生質體分離的最佳條件, 每組梯度實驗重復3次。具體方案如下：1)對植物培養的時間進行優化。 酶解時間固定在8 h, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 將培養了1, 2, 3和4周的黃化苗用作實驗材料；2)滲透壓優化。 選取2周的黃化苗為實驗材料, 酶解時間固定在8 h, 甘露醇濃度分別為0.4, 0.5, 0.6， 0.7和0.8 mol/L；3)酶解時間優化。 選取2周的黃化苗為實驗材料, 甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解時間分別為6, 7, 8, 9和10 h。

1.4原生質體提取方法

首先使用全新的刀片將柳枝稷黃化幼苗的葉片切割成1 mm寬的細條。用鑷子將切好的苗條放在含20 mL酶溶液的150 mL燒瓶中, 放置28 ℃的黑夜中振蕩(40～60 r/min)培養, 4 h后從燒瓶中取10 μL, 在顯微鏡下觀察原生質體。健康的原生質體應是圓形的并沒有其他細胞。酶解完成后, 原生質體及酶的混合液經35 μm(100 μm)的篩網, 除去未完全酶解的材料。濾液經916 r/min離心5 min, 去掉上清。向沉淀(原生質體)加入3 mL的W5溶液使其懸浮, 再向管底加入5 mL的CPW20溶液[附加20%蔗糖的CPW鹽溶(細胞原生質體清洗液，cell protoplast wash medium)], 916 r/min離心4 min, 兩相中間出現一條純凈的原生質體帶, 小心取出并以W5溶液重懸后等到純凈的原生質體。取少量純化后的原生質體懸浮液滴加在血球計數板上, 在顯微鏡下觀察計數, 依次計數中央大方格內原生質體數, 重復3次。

原生質體的密度(個/mL)=大方格(0.1 mm3,即0.1 μL)的原生質體數×104

原生質體產量(個/g)=原生質體密度×原生質體懸浮液總體積(mL)/制備原生質體所用材料的鮮重

1.5載體構建及顯微觀察

選用pEZR(K)-LN雙元載體用作亞細胞定位載體。該載體含CaMV 35S啟動子和加強型的綠色熒光蛋白eGFP。OsMYB103基因是MYB家族的轉錄因子, 根據Yang等[27]的方法, 將OsMYB103連接上LN載體 (pEZR-LN), 用于亞細胞定位的實驗。

將制備好的原生質體沖懸浮于Mmg溶液中。取10 μg的質粒LN-PCF5放入2 mL離心管, 再加入200 mL重懸液, 輕輕混勻后在室溫下放置15 min, 接著加入220 μL的 40% PEG溶液, 輕輕混勻,室溫放置 15 min。用 880 μL的W5 溶液重新懸浮原生質體, 輕彈管底混勻, 1183 r/min離心 2 min, 棄上清液。加入1 mL WI溶液(即洗滌培養液, washing and incubation solution, 配方為0.5 mol/L 甘露醇, 20 mol/L KCl和4 mmol/L MES) 重懸浮并轉移至經BSA(牛血清白蛋白)預沖洗過的培養皿中, 24 ℃過夜培養。之后用激光共聚焦顯微鏡(Leica, Germany)觀察鑒定。

2 結果與分析

圖1 不同時期的黃化苗提取柳枝稷原生質體Fig.1 The preparation of switchgrass protoplasts with different periods of etiolated seedlings 甘露醇濃度為0.6 mol/L,酶解時間為8 h。 The concentration of mannitol: 0.6 mol/L; Enzymolysis time: 8 h. 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 下同。Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05). The same below.

2.1原生質體提取條件優化

2.1.1黃化苗培養時間 植物的幼嫩程度會極大地影響原生質體提取效率, 在此首先針對植物培養的時間進行優化。在保持滲透壓和酶解時間不變的條件下, 選擇不同培養時間的黃化苗進行原生質體的提取。如圖1所示, 培養1周左右的黃化苗得到的數量較少, 且細胞也偏小, 不利于亞細胞定位的觀察；而培養2～3周的黃化苗能得到數量很多的原生質體, 并且2周左右的苗子能得到最多數量原生質體, 適用于亞細胞定位實驗觀察。而超過3周后的柳枝稷黃化幼苗, 提取原生質體的量開始減少。

2.1.2滲透壓優化 植物細胞在缺少細胞壁的保護之后, 對外界的滲透壓會非常敏感。因此, 滲透壓的優化是原生質體提取的一個重要環節。選擇2周大的黃化苗在保持酶解時間不變的條件下, 選擇不同滲透壓條件進行原生質體的提取。如圖2所示, 當甘露醇濃度為0.4 mol/L時, 得到非常少量的原生質體, 隨著濃度上升, 原生質體提取量迅速增大, 在甘露醇濃度為0.6 mol/L時原生質體提取量達到了最大值。之后隨著甘露醇濃度的增大, 原生質體的量又迅速的減少。

2.1.3酶解時間優化 在黃化苗苗齡及滲透壓一致的條件下, 酶解時間能明顯影響原生質體的產量。如圖3所示, 酶解7和8 h都能獲得大量的原生質體, 并且8 h獲得的原生質體數最多。在酶解6～8 h之間, 原生質體數量隨著酶解時間增大而顯著增加, 當大于酶解8 h時, 原生質體數量則隨著酶解時間的增大而減小, 而且發現游離的細胞碎片明顯增多。

圖2 不同滲透壓下提取柳枝稷原生質體Fig.2 The preparation of switchgrass protoplasts under different osmotic pressure

2周的黃化苗, 酶解時間8 h。 Etiolated seedlings of two weeks, enzymolysis time: 8 h.

圖3 不同酶解時間下提取原生質體Fig.3 The preparation of switchgrass protoplasts in different enzymolysis time

甘露醇0.6 mol/L, 2周的黃化苗。The concentration of mannitol: 0.6 mol/L, etiolated seedlings of two weeks.

綜合分析影響柳枝稷葉肉原生質體制備的主要因素, 柳枝稷葉肉原生體質體系得以優化。選取2周大的柳枝稷黃化幼苗為實驗材料, 酶解液中甘露醇濃度為0.6 mol/L, 酶解8 h。流程如下：對Alamo柳枝稷種子進行滅菌處理, 維持在(28±2) ℃, 黑暗條件下培養2周, 取柳枝稷黃化幼苗的葉片切割成1 mm寬的細條, 將切好的苗條與酶解液充分接觸(圖4a)，對得到的原生質體進行沉淀純化, 消除分離過程中的破裂細胞和未酶解的碎片, 獲得原生質體(圖4b)。基于上述流程所得到的原生質體大, 碎片少, 量多, 活性強(圖4c), 滿足進一步的遺傳轉化實驗條件。

圖4 柳枝稷原生質體的分離Fig.4 Separation of switchgrass protoplasts a:樣品的酶解反應The enzymatic hydrolysis of the sample；b:原生質體的沉淀純化Purification of protoplasts；c:柳枝稷原生質體Protoplasts.

2.2亞細胞定位載體構建

從水稻基因組數據庫中(http://rice.plantbiology.msu.edu)下載OsMYB103(ID：Os08g05520)的基因序列。根據序列信息LN載體的引物LN-EcoRI-103: AGCTCAAGCTTCGAATTCATGGGGCATCACTCTTGCTGC; LN-BamHI-103: AGCGGCAGCAGCCGGATCCTTAATCATGGTCATTTGGTCCCATA, 用高保真酶進行擴增, 其長度約為1000 bp。將擴增片段連上載體pEASY-T5(CT501, 全式金), 通過熱激導入到菌株為BH5a的感受態大腸桿菌中(CD-201, 全式金), 之后挑菌測序。將攜帶正確質粒的大腸桿菌擴繁, 提取pEASY-103質粒, 用NEB公司的酶切體系, 分別對pEASY-103和LN載體進行雙酶切。結果如圖5a, pEASY-103酶切后有個1000 bp的片段, 這是目標基因OsMYB103, LN載體酶切后為10 kb以上的片段(圖5b), 分別將這兩段切膠回收, 再利用NEB公司的連接酶進行反應, 得到LN-103(LN-OsMYB103),之后導入感受態大腸桿菌, 挑選陽性克隆測序。經酶切與測序檢測, 質粒LN-103完全正確(圖5c)。

圖5 載體PCR擴增Fig.5 PCR amplification of pEZR MYB指的是含有MYB結構域的轉錄因子；LN指的是雙元表達載體； marker為DL2000的marker;a:從植物cDNA中擴增得到的OsMYB103基因, 大小為1 kb左右；b:載體LN的雙酶切膠圖；c:LN-103(LN-OsMYB103)的雙酶切圖, 載體大小完全正確。MYB refers to the transcription factor; LN refers to the binary expression pEZR； marker：DL2000 marker; a：The OsMYB103 gene, which is about 1 kb in size, was amplified from cDNA；b： The double enzyme map of pEZR-LN；c：The double enzyme map of LN-103 and the pEZR size is correct.

2.3亞細胞定位分析

將制備好的柳枝稷原生質體分別和LN-103(LN-OsMYB103), LN空載體共培養12 h, 在共聚焦顯微鏡下進行檢測。如圖6所示, 在激發光為488 nm條件下LN-103和LN空載體都檢測到了綠色熒光；在激發光為580 nm下, 原生質體檢測到了紅色熒光。攜帶OsMYB103基因的質粒始終定位于細胞核上, 這與Yang等[27]的實驗結果一致。同時空載體LN的熒光蛋白在細胞、細胞核及細胞膜上。上述結果表明,LN載體適用于柳枝稷的亞細胞定位實驗, 并且可用于轉錄因子等相關基因的分析。

圖6 攜帶OsMYB103基因的LN-103載體和LN空載體的亞細胞定位圖(10 μm)Fig.6 Subcellular localization of pEZRLN-103 and empty pEZR-LN carrying OsMYB103 gene (10 μm)

3 討論

植物原生質體是研究基因功能的強有力工具, 在植物功能基因研究中扮演非常重要的角色[28]。20世紀中期原生質體的分離得到了初步的研究, 目前已經有很多的物種進行了原生質體體系的建立, 然而在柳枝稷中卻鮮有報道[23-25]。雖然水稻和柳枝稷是近緣物種, 都隸屬于禾本科植物, 但種間差異會影響基因的功能研究, 因此建立一個柳枝稷原生質體的亞細胞定位體系是很重要的。

植物的各個器官如根、莖、葉、種子及愈傷組織等都能分離出原生質體[29]。愈傷組織容易獲得大量原生質體, 但需要長時間的材料準備, 且不利于葉綠體相關的基因研究。借鑒中國科學院遺傳與發育生物學研究所朱立煌課題組的水稻原生質體分離辦法發現, 分離禾本科植物的黃化幼苗(包括莖, 葉)能滿足各類基因功能的研究工作。因此, 本課題組決定用兩周齡柳枝稷黃化幼苗的莖和葉作為實驗材料。

由于原生質體是去壁的細胞, 對外面環境的刺激非常敏感, 分離有效原生質體會被很多因素影響, 獲得高質量的原生質體, 需要優化滲透壓、 酶解時間等幾個關鍵因素[30]。最直接重要的就是外界環境的滲透壓, 只有維持在一定滲透壓內才能保證原生質體的產量及活力。在本實驗中, 發現甘露醇在0.6 mol/L能使外界環境的滲透壓達到最佳狀態, 濃度過大或過小都會影響原生質體的產量及質量, 低于0.6 mol/L原生質體會因部分失水變癟, 過高導致細胞過分吸水而破裂, 直接影響原生質體產量。

原生質體提取是植物細胞去壁的過程, 因此細胞壁的酶解時間和細胞的幼嫩程度都會極大影響原生質體的提取。酶解時間過短, 細胞壁水解的不充分, 原生質體難以分離；而酶解時間過長, 會影響原生質體的存活, 使得無法得到有效的原生質體[31]。本實驗的結果表明, 酶解8 h是最佳的時間, 產量能達到9×105個/g, 并且酶解時間在7～8 h間都能獲得大量原生質體以滿足實驗需求。植物細胞的幼嫩程度則決定了細胞壁是否易于分解, 苗齡在兩周大的黃化苗能獲得最多的原生質體。小于兩周, 細胞壁過嫩較易水解；大于兩周, 細胞壁過老而不利于水解。

在確立了柳枝稷原生質體分離體系之后, 本課題組用已報道過的基因進行了驗證, 該基因是MYB家族的基因, 定位于細胞核上。實驗結果表明, 分離出的原生質體適用于基因的亞細胞定位。

4 結論

本研究結果顯示, 2周左右的苗子能得到最多數量原生質體, 原生質體提取量均超過8.43×105個/g, 并適用于亞細胞定位的實驗觀察；其他條件相同, 在甘露醇濃度為0.6 mol/L時原生質體提取量達到了最大值, 原生質體提取量均超過7.98×105個/g；其他條件相同, 酶解8 h獲得的原生質體數最多, 原生質體提取量均超過8.61×105個/g；經酶切與測序檢測, 質粒LN-103完全正確；將制備好的柳枝稷原生質體和LN-103載體共培養12 h, 在共聚焦顯微鏡下進行檢測發現：LN載體適用于柳枝稷的亞細胞定位實驗, 并且可用于轉錄因子等相關基因的分析, 通過本研究可為柳枝稷遺傳改良及功能基因研究奠定一定的基礎。

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Establishmentofagenetransientexpressionsystemmediatedbypolyethyleneglycolinswitchgrass(Panicumvirgatum)mesophyllprotoplasts

QI Ze-Wen1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo3, ZHANG Xue1, YUAN Jian-Bo1, HAN Lie-Bao1*

1.TurfgrassResearchInstitute,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.KeyLaboratoryofCropGrowthRegulationofHebeiProvince,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China; 3.ShenzhenHorticulturalGardenConstructionCompany,Shenzhen518038,China

Leaves of Alamo switchgrass (Panicumvirgatum) were used as materials to establish a transient expression system for mesophyll protoplasts cells. To determine the optimal conditions to obtain protoplasts from switchgrass, we designed a gradient experiment, with three replicates per treatment. First, we determined the optimal age of plants as the source of material. The leaves of etiolated seedlings grown for 1, 2, 3, and 4 weeks were subjected to enzymolysis for 8 h in a solution containing D-mannitol at 0.6 mol/L. Next, we determined the optimal osmotic pressure by exposing leaf material from 2-week-old etiolated seedlings to solutions containing D-mannitol at 0.4 mol/L, 0.5 mol/L, 0.6 mol/L, 0.7 mol/L and 0.8 mol/L. The optimal duration of enzymolysis was determined by subjecting leaf material from 2-week-old etiolated seedlings to enzymolysis for 6, 7, 8, 9, and 10 h in a solution containing 0.6 mol/L D-mannitol. This series of assays showed that the optimal conditions to isolate protoplasts were as follows: 2-week-old etiolated seedlings as the source material, and enzymatic hydrolysis in a solution containing 0.6 mol/L D-mannitol in the dark for 8 h at 28 ℃. The protoplasts obtained using this method were transformed with the plasmid LN-OsMYB103 by a polyethylene glycol-mediated method, and strong green fluorescence was detected by laser confocal microscopy. These results indicated that the protoplasts retained normal biological functions. In summary, we established an integrated transient expression system for protoplasts obtained from switchgrass leaves. This method will be very useful for functional genomics research on switchgrass.

switchgrass (Panicumvirgatum); PEG; protoplast; transient expression

10.11686/cyxb2017029

http://cyxb.lzu.edu.cn

祁澤文, 孫鑫博, 樊波, 張雪, 袁建波, 韓烈保. PEG介導的柳枝稷葉肉細胞原生質體瞬時表達體系的建立. 草業學報, 2017, 26(9): 113-120.

2017-01-18；改回日期：2017-03-29

深圳市科技計劃項目(JSGG20160229155434792和JCYJ20160331151245672)資助。

祁澤文(1992-)，男，江蘇連云港人，碩士。E-mail: qizewen0404@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: hanliebao@163.com

QI Ze-Wen, SUN Xin-Bo, FAN Bo, ZHANG Xue, YUAN Jian-Bo, HAN Lie-Bao. Establishment of a gene transient expression system mediated by polyethylene glycol in switchgrass (Panicumvirgatum) mesophyll protoplasts. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(9): 113-120.