鎘脅迫下增施氮對白三葉草生長的影響和鎘毒害的緩解效應研究

董姬妃,張帆,胡雨寒,李俊承,李維,王嫻淑

(四川農業大學風景園林學院,四川 成都 611130)

鎘脅迫下增施氮對白三葉草生長的影響和鎘毒害的緩解效應研究

董姬妃,張帆*,胡雨寒,李俊承,李維,王嫻淑

(四川農業大學風景園林學院,四川 成都 611130)

為了解鎘(Cd)脅迫下施加外源氮對植物生長生理的影響及解毒機理, 本研究采用盆栽試驗, 以白三葉草為材料, 研究了在重金屬鎘(CdCl2·2.5H2O)脅迫下施加氮[CO(NH2)2]對其生長、葉綠素含量、抗氧化酶活性、鎘含量、谷胱甘肽(GSH)和植物絡合素(PCs)含量的影響。結果表明, 單獨的Cd處理顯著抑制白三葉草生長及葉綠素的合成；而鎘脅迫下施加氮顯著促進了白三葉草的生長, 其生物量和葉綠素含量顯著提高。同時, 鎘脅迫下增施氮顯著提高了植株過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及白三葉草植株體內鎘含量。單獨鎘處理顯著增加了PCs含量, GSH含量顯著降低；而鎘脅迫下增施氮使GSH和PCs含量均顯著增加。由此說明, 外源氮素在植物對重金屬鎘的解毒過程起到了重要的作用, 緩解了鎘對白三葉草的毒害。

鎘脅迫；氮；白三葉草；生長生理；GSH；PCs；解毒作用

隨著工業化和城市化進程的快速發展, 土壤重金屬污染問題已日益突出[1]。重金屬鎘(Cd)污染已嚴重影響著植物的正常生長和人類的健康[2-3]。因此, 重金屬鎘污染土壤的治理問題亟待解決。已有研究表明, 鎘對植物的毒害主要體現在抑制植株生長, 影響植物開花, 降低植株對逆境的抗性[4-6]。

盡管鎘對植物有一定的毒性, 但某些植物在長期的生長發育過程中對Cd脅迫產生了一定的耐性。植物耐鎘機理主要有：限制鎘的吸收, 細胞壁或細胞外碳水化合物對鎘的固定, 抗氧化防御系統的作用以及氨基酸或抗逆蛋白的合成, 液泡的區室化作用, 金屬硫蛋白(MTs)或者植物絡合素(PCs)與Cd2+的結合[7-10]。

雖然植物對重金屬鎘具有一定的耐性, 但是當土壤中鎘濃度過高時, 植物則受到Cd毒害。因此, 隨著鎘污染日益嚴重, 找到一種低成本、高效率的土壤修復方法迫在眉睫。植物修復是指植物吸收、轉移、富集以及降解等機制來降低土壤中重金屬的含量, 使土壤得到修復和治理[11-14]。與傳統的物理、化學修復方法相比, 植物修復技術具有以下優點：成本低；不破壞土壤生態環境；通過對植物的集中處理, 不易產生二次污染；易為公眾接受。因此, 用對Cd具有高富集效應的植物來修復Cd污染土壤是一種經濟、徹底的有效措施。

單純利用植物進行重金屬污染土壤的修復效果不顯著, 因此人工干預植物修復以提升修復效果顯得極為重要。研究表明, 氮素是植物生長必需營養元素之外[15-17], 還能緩解重金屬毒害, 提高植物對重金屬的富集能力。因此, 在應用重金屬超富集植物進行土壤重金屬污染修復時合理施用氮肥會使植物修復土壤的效率得以提高[17-18]。但是氮素在植物解毒過程中的作用機制尚不明確。因此, 研究氮素在植物的解毒過程中的作用具有重要意義。

在重金屬鎘污染土壤的植物修復中, 東南景天(Sedumalfredii)、滇苦菜(Picrisdivaricata)及圓錐南芥(Arabispaniculata)等超富集植物已得到廣泛應用, 但它們大部分植物生長緩慢、生物量較低、鎘遷移總量較小且景觀價值不高, 不適宜大面積鎘污染土壤的修復[19]。而園林地被植物具有個體小、種類多、生長快等特點[20]。生長一段時間后可整株移出, 不會對土壤造成二次污染。白三葉草(Trifoliumrepens)為多年生草本植物, 其適應性廣, 觀賞價值較高, 主要用于草地建設, 因此具有較好的生態價值和經濟價值[21-22]。目前, 對于白三葉草重金屬鎘脅迫方面的研究, 多集中于鎘對白三葉草粗蛋白種類和含量的影響, 以及鎘對其養分代謝的影響[21,23], 而關于氮素在白三葉緩解鎘毒害過程中的作用機理鮮有報道。因此, 本研究以白三葉草為材料, 采用盆栽試驗, 研究鎘脅迫下施加氮對其生長生理的影響及對鎘毒害的緩解效應, 以期探討氮素在白三葉草重金屬鎘解毒過程中的重要作用, 為鎘污染土壤的植物修復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

供試植物材料為由四川省農業科學院提供的“拉丁諾”白三葉草種子。供試土壤為不含腐根、腐葉的自然土壤。土壤理化性質為：pH 6.3、有機質13.87 g/kg、全氮0.58 g/kg, 全磷0.39 g/kg, 全鉀2.95 g/kg, 水解氮36.56 mg/kg, 速效磷19.62 mg/kg, 速效鉀48.34 mg/kg, 鎘含量0.549 mg/kg。

1.2試驗方法

2015年10月至2016年9月, 試驗在四川農業大學成都校區溫室大棚及五教實驗室內進行。供試土壤經自然風干后, 搗碎、剔除雜物、研磨, 過5 mm篩, 裝入內徑21.5 cm, 深16.5 cm的圓形塑料花盆中, 每盆裝土2.5 kg。將白三葉草種子消毒后播種于干凈的沙穴盤中。待幼苗長出5片真葉時選取生長良好、生物量一致的白三葉草幼苗移栽至塑料盆, 每盆5株, 種植深度1.5～2.0 cm, 并進行常規養護管理。待白三葉草恢復生長后, 按表1進行處理, 共設置4個處理, 3次重復。每隔7 d, 加入濃度為75 mg/kg的Cd2+(0.3810 g CdCl2·2.5H2O)和0.1001 g CO(NH2)2(N含量0.0467 g), 待單獨鎘處理的植株葉片出現癥狀后進行測定。

1.3指標測定及方法

1.3.1生長量與生物量的測定 采用游標卡尺測量主根長及地上部高度。將收獲的植株用蒸餾水充分洗凈植株上附著的雜質, 根系在20 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液中浸泡30 min, 以去除根系表面黏附的金屬離子(Cd2+), 再用去離子水沖洗干凈, 瀝去水分后, 將植株分為根、莖、葉三部分(莖稈與葉片為地上部), 將每部分放置于烘箱中105 ℃殺青30 min, 然后在80 ℃下烘干至恒重, 分別稱量每部分干重。3次重復。

1.3.2葉綠素含量測定 采用抽提法測定葉綠素含量。取成熟葉片去主脈, 稱取0.200 g 放入具塞試管。加入25 mL 80%丙酮和95%乙醇混合提取液(體積比為1∶1)后放入溫度為35 ℃的振蕩培養箱中, 暗處浸提12 h, 當葉片呈蒼白色時測OD663 nm和OD645 nm, 參照熊慶娥[24]的方法分別測定葉綠素a 和b的含量。3次重復。

表1 白三葉草在重金屬鎘處理下增施氮的試驗方案Table 1 Experimental design of nitrogen supplement on T. repens under Cd stress

1.3.3抗氧化酶活性測定 稱取植物材料1.0 g, 加入0.02 mol/L磷酸緩沖液(PBS)5 mL, 研磨成勻漿, 以3000 r/min離心10 min, 上清液即為酶液。1)取1 mL酶液和3 mL反應混合液(取50 mL 0.1 mol/L PBS于燒杯中, 加入28 μL愈創木酚, 加熱攪拌至溶解, 待溶液冷卻后, 加入19 μL 30%過氧化氫), 測OD470 nm。計算過氧化物酶(POD)活性。2)取0.05 mL酶液和2.95 mL反應混合液(130 mmol/L 甲硫氨酸溶液、750 μmol/L 氮藍四唑溶液、100 μmol/L EDTA-Na2、20 μmol/L 核黃素溶液各0.3 mL, 0.5 mol/L PBS 1.5 mL及蒸餾水0.25 mL)混合后在4000 lx日光下反應20 min, 避光測OD560 nm。計算超氧化物歧化酶(SOD)活性。3)取0.1 mL酶液和3 mL反應混合液(取200 mL PBS, 加入0.3092 mL H2O2搖勻), 測定OD240 nm(測定40 s)。計算過氧化氫酶(CAT)活性。POD、SOD和CAT活性均參照熊慶娥[24]的方法測得。3次重復。

1.3.4鎘含量的測定 稱取烘干磨細植物樣品0.3000 g于三角瓶中, 加HNO3-HClO4(體積比為4∶1)混合液20 mL, 靜置≥5 h。蓋上漏斗, 在電熱板上加熱0.5 h, 直到瓶內有大量白煙, 繼續加熱, 使白煙慢慢消失, 溶液呈無色透明尚有2 mL時停止加熱。冷卻后用蒸餾水洗入25 mL容量瓶, 定容。用原子發射光譜儀(ICP)測定植物Cd含量。3次重復。

稱取土樣1.0000 g于聚四氟乙烯坩堝內, 加幾滴蒸餾水潤濕, 再加15 mL氫氟酸(HF)與10 mL HClO4-HNO3(體積比為1∶1)混合液消化至干, 再加5 mL HNO3, 消化至干, 加5 mL 2 mol/L鹽酸, 溶解搖勻, 定容至25 mL容量瓶。用原子發射光譜儀(ICP)測定土壤Cd含量。3次重復。

根部和地上部鎘的生物富集系數(BCF)的計算公式如下：

1.3.5谷胱甘肽(GSH)、植物絡合素(PCs)含量測定 1)稱取1.0 g材料置于研缽中, 加入5 mL預冷后的50 g/L 三氯醋酸(TCA)(含0.05 mol/L EDTA-Na2),冰浴研磨, 于4 ℃、17600 r/min離心20 min。取上清液根據熒光法測定GSH含量[25]。2)取0.5 g材料, 加少量5%磺基水楊酸(SSA), 冰浴研磨, 于4 ℃、17600 r/min離心30 min。所得上清液參照Rama等[26]的方法測定非蛋白巰基總量(NPT), 參照郝建軍等[27]的方法測定總谷胱甘肽含量(還原型谷胱甘肽GSH+氧化型谷胱甘肽GSSG)。PCs的含量=非蛋白巰基總量-總谷胱甘肽含量, 即采用差減法[28]。3次重復。

1.4數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2003進行相關性分析；采用DPS數據軟件進行方差分析和LSD法分析差異顯著性。

2 結果與分析

圖1 氮素對鎘脅迫下白三葉草生長及生物量的影響Fig.1 Effects of nitrogen on growth and biomass of T. repens under Cd stress 圖中數值為平均值±標準誤。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。下同。Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters indicate significant difference among the treatments (P<0.05); Different capital letters indicate extraordinarily significant difference among treatments (P<0.01). The same below.

2.1氮素對鎘脅迫下白三葉草生長及生物量的影響

由圖1可知, 單獨的鎘處理(T1)顯著抑制了白三葉草的生長, 其地上部高、主根長、生物量分別比對照降低20.46%, 29.30%和31.61%。與對照相比, 單獨氮處理(T2)顯著增加了地上部高和生物量, 分別增加了30.54%和14.05%, 但主根長與對照相比無顯著差異。而鎘脅迫下增施氮(T3)顯著促進了白三葉草的生長, 與對照相比, 其地上部高、主根長、生物量分別增加了28.75%, 25.99%和14.05%。此外, 鎘脅迫下增施氮(T3)處理, 其地上部高和生物量均極顯著高于單獨鎘處理(T1), 主根長極顯著高于單獨氮處理(T2)(P<0.01)。由此說明高濃度的Cd處理抑制了植物的生長, 但鎘脅迫下增施氮能緩解Cd對白三葉草生長的抑制作用。

2.2氮素對鎘脅迫下白三葉草葉綠素含量的影響

由圖2可知, 單獨鎘處理嚴重影響了葉綠素的合成, 尤其是葉綠素a。其葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別比對照降低了40.98%, 19.80%和33.99%。與對照相比, 單獨氮處理(T2)中葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量顯著提高, 分別增加了32.68%, 19.80%和28.43%。而鎘脅迫下增施氮處理, 其植株葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別比對照高26.83%, 28.71%和27.45%, 與單獨氮處理均無顯著差異。此外, 鎘脅迫下增施氮(T3)處理, 其葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素均極顯著高于單獨鎘處理(T1)(P<0.01)。說明高濃度的Cd處理影響葉綠素合成, 尤其是葉綠素a, 而鎘脅迫下施加氮能增加葉綠素的含量, 緩解重金屬鎘對白三葉草的毒害作用。2.3氮素對鎘脅迫下白三葉草抗氧化酶系統的影響

由圖3可知, 單獨鎘處理的植株, 其POD、SOD及CAT活性分別比對照降低了31.71%, 32.91%和41.59%, 其中POD和CAT活性與對照差異達極顯著(P<0.01)。說明高濃度的鎘降低了抗氧化酶的活性, 導致活性氧積累, 從而毒害植株。而鎘脅迫下增施氮處理, 其POD、SOD及CAT活性與對照相比, 差異不顯著(P>0.05), 但與單獨鎘處理相比, 差異達極顯著。說明鎘脅迫下增施氮能顯著提高白三葉草體內抗氧化酶活性, 以維持體內活性氧的產生與清除的動態平衡, 進而緩解鎘對植株的毒害。

圖2 氮素對鎘脅迫下白三葉草葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of nitrogen on chlorophyll content of T. repens under Cd stress

圖3 氮素對鎘脅迫下白三葉草抗氧化酶系統的影響Fig.3 Effects of nitrogen on the antioxidant enzyme activities of T. repens under Cd stress

2.4氮素對鎘脅迫下白三葉草鎘積累的影響

由表2可知, 與單獨鎘處理(T1)相比, 鎘脅迫下增施氮處理(T3)植株地上部鎘含量和根系鎘含量分別增加了53.03%和74.17%, 而土壤鎘含量降低了6.17%。說明氮素能提高白三葉草對Cd的吸收。

此外, T3處理白三葉草的地上部轉移系數和根系轉移系數分別比T1處理植株增加了80.00%和100.00%(表2)。說明氮素能輔助鎘在植物體內的遷移, 從而提高白三葉草對Cd的富集能力, 促進植物對重金屬污染土壤的修復。

表2 氮素對鎘脅迫下白三葉草鎘積累的影響Table 2 Effects of nitrogen on cadmium accumulation capacity of T. repens under Cd stress

注：表中數值為平均值±標準誤。同列中數值后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note：Data in the table are means±SE. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among the treatments (P<0.05); Different capital letters indicate extraordinarily significant difference among treatments (P<0.01).

圖4 氮素對鎘脅迫下白三葉草GSH和PCs含量的影響Fig.4 Effects of nitrogen on GSH and PCs content of T. repens under Cd stress

2.5氮素對鎘脅迫下白三葉草GSH和PCs含量的影響

由圖4可知, 單獨鎘處理顯著影響白三葉草中谷胱甘肽(GSH)及植物絡合素(PCs)含量(P<0.05)。與對照相比, 其GSH降低了81.25%, PCs增加了132.30%。說明高濃度鎘脅迫下, 白三葉草以提高自身PCs含量來抵抗鎘的毒害, 而作為PCs合成的底物GSH, 其含量極顯著降低。此外, 鎘脅迫下增施氮處理, 植株的GSH、PCs含量與對照相比均極顯著增加, 分別增加了193.75%和279.21%。由此說明, 增施氮能促進白三葉草GSH的合成, 提高PCs含量, 從而增強植株對重金屬鎘的解毒能力。

3 討論

土壤中鎘含量過多會使植物受到毒害, 造成植物生長緩慢、植株矮小、葉片失綠等[29]。植物吸收過量的鎘會誘導植株產生過氧化氫類物質, 破壞抗氧化系統的防御功能, 導致氧化還原失衡, 造成氧化脅迫[30]。本研究表明, 高濃度Cd顯著降低了白三葉草的生長量、干重、葉綠素含量、抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性, 這與多數植物受鎘脅迫的毒害情況基本一致[31-32]。

重金屬鎘對植物造成毒害的同時, 植物也會產生相應的解毒機制。植物合成的含巰基化合物, 如谷胱甘肽(GSH)和植物絡合素(PCs), 在植物對重金屬鎘的解毒過程中起到了重要作用[33]。谷胱甘肽通過谷胱甘肽-S-轉移酶完成對有害物質的解毒作用, 并將其排出體外[34-37]。植物絡合素是由以GSH為底物的酶促反應合成[38-39]。PCs對重金屬解毒的機理是重金屬離子進入植物體后, 細胞內的PCs與之結合形成復合物, 然后轉運到特定的細胞器(主要為液泡), 進行區室化固定, 從而降低重金屬對植物的毒害[38,40]。因此, 谷胱甘肽和植物絡合素含量在一定程度上可以反映植物對鎘的抗性[41]。本研究中, 單獨鎘處理的PCs含量顯著高于對照, 而GSH的含量顯著低于對照。這與Jackon等[42]對曼陀羅(Daturastramonium)的研究結果相一致。GSH含量的降低可能是由于大量用于合成PCs造成的。

GSH的生物合成主要通過兩步依賴于ATP的酶催化反應完成, 即谷氨酸、半胱氨酸在 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)GSH I催化下生成γ-谷氨酰半胱氨酸；γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸在谷胱甘肽合成酶(GS)GSH II 的催化下生成GSH[37]。GSH在植物絡合素合酶(PCS)的催化下進一步合成植物絡合素。而GSH前體物谷氨酸和甘氨酸的合成需要氮的參與, 因此氮素對GSH的合成具有重要作用[43]。然而, 氮素(谷氨酸)不僅用于合成GSH, 也參與葉綠素和核酸、蛋白質的合成[44-45]。正常情況下, GSH、葉綠素以及核酸、蛋白質的合成過程對N的利用處于一種平衡狀態。當植物受到鎘脅迫時, 氮素不足會造成以下兩種情況：1)植株大量合成GSH和PCs用于螯合Cd2+, 導致用于合成葉綠素、蛋白質的氮素減少, 植株生長受抑制, 葉片失綠；2)葉綠素、蛋白質合成消耗N, GSH和PCs合成受阻, 大量Cd2+抑制植株對Ca2+、Fe2+、Zn2+等必需元素的吸收, 使蛋白質變性, 打破細胞內的氧化還原平衡, 對植物造成嚴重的毒害[46-48]。若此時氮元素供應充足, 植物能夠合成足夠的谷氨酸使得GSH、葉綠素和核酸、蛋白質的合成均不受影響, 那么植物生長不會出現中毒癥狀, 植物細胞不會遭受破壞, 即實現了氮素緩解重金屬鎘對植物的毒害作用。本試驗中, 氮素緩解了Cd對白三葉草生長的抑制, 顯著提高了白三葉草對Cd的富集能力, 植株生長量、干重、葉綠素含量、抗氧化酶活性基本恢復到對照水平, 甚至優于對照。而且, 鎘脅迫下增施氮使植物體內GSH和PCs含量均極顯著高于對照和單獨鎘處理。這與白瑞霞等[49]、翟晶[50]、張圓圓等[18]以及Gutiérrez-Gamboa等[51]的研究結果基本一致。然而氮素以何種形態起作用, 是否能夠緩解其他種類重金屬對植物造成的毒害, 均有待進一步研究。

4 結論

重金屬鎘脅迫下, 白三葉草的生長明顯受抑制, 植株矮小, 葉片失綠, 新陳代謝速率降低, 無法合成足夠的谷胱甘肽, 植株出現中毒癥狀；而在鎘脅迫下增施氮能讓植物各生理指標恢復到對照水平, 顯著增加谷胱甘肽和植物絡合素含量, 提高植株抗氧化能力和對鎘的富集能力。說明氮素在白三葉草的重金屬鎘解毒機制中具有重要作用, 能夠緩解鎘對植株的毒害, 提高植株對鎘的富集能力, 這為白三葉草的生產應用提供了理論參考, 為城市園林綠化及Cd污染土壤的修復提供了理論依據。

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Effectofnitrogensupplementationongrowthofwhitecloverundercadmiumstressandalleviationofcadmiumtoxicity

DONG Ji-Fei, ZHANG Fan*, HU Yu-Han, LI Jun-Cheng, LI Wei, WANG Xian-Shu

CollegeofLandscapeArchitecture,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China

We investigated the effect of exogenous nitrogen on the growth of white clover (Trifoliumrepens) under cadmium stress and on Cd toxicity. White clover plants grown in pots were treated with N and/or Cd, and their growth, biomass, chlorophyll content, antioxidant enzyme activity, Cd content, glutathione (GSH) content, and phytochelatins content were determined. Treatment with Cd significantly inhibited the growth and decreased the chlorophyll content of white clover. However, applications of both Cd and N to the soil promoted white clover biomass and chlorophyll content, as compared with the control. The addition of N under Cd stress enhanced plant growth and chlorophyll content, and increased the activities of peroxidase, superoxide dismutase, and catalase, as well as increasing the Cd content. Treatment with Cd alone increased the phytochelatins content and significantly reduced the GSH content. Treatment with N increased the GSH and phytochelatins contents under Cd stress. These results indicated that exogenous N can effectively alleviate Cd toxicity to white clover.

cadmium stress; nitrogen,Trifoliumrepens; growth; GSH; PCs; detoxification

10.11686/cyxb2016461

http://cyxb.lzu.edu.cn

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DONG Ji-Fei, ZHANG Fan, HU Yu-Han, LI Jun-Cheng, LI Wei, WANG Xian-Shu. Effect of nitrogen supplementation on growth of white clover under cadmium stress and alleviation of cadmium toxicity. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(9): 83-91.

2016-12-08；改回日期：2017-02-11

國家自然科學

基金項目(31300514)，四川省“十三五”科技攻關項目林木新品種選育(2016YZGG)和四川農業大學科研興趣培養計劃項目(04054487)資助。

董姬妃(1992-)，女，浙江臺州人，在讀碩士。E-mail：15608037874@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：nolady@163.com