油菜株高QTL定位、整合和候選基因鑒定

張江江，詹杰鵬，劉清云，師家勤，王新發，劉貴華，王漢中

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油菜株高QTL定位、整合和候選基因鑒定

張江江1，詹杰鵬1，劉清云2，師家勤1，王新發1，劉貴華1，王漢中1

（1中國農業科學院油料作物研究所，武漢430062；2浠水縣農業局油料作物推廣站，湖北黃岡438200）

【目的】通過對油菜株高進行多環境QTL定位并與已報道的油菜株高QTL和植物株高基因分別進行整合和比對分析，揭示油菜株高的遺傳結構和候選基因并為其分子改良提供依據。【方法】以油菜優良品種中雙11（測序）和No.73290（重測序）衍生的含184個單株的BnaZNF2群體為試驗材料。首先，對BnaZNF2群體進行基因型分析，利用Joinmap 4.0軟件構建了一張含803個分子標記的高密度遺傳圖譜。其次，對F2:3和F2:4家系進行連續兩年（2010—2011）兩點（武漢和西寧）田間試驗和表型鑒定。然后，利用BnaZNF2群體的基因型數據和F2:3以及F2:4家系的株高表型數據，采用WinQTLCart 2.5軟件的復合區間作圖法進行QTL檢測。最后，利用元分析的方法采用BioMercator軟件對不同環境中檢測到的株高QTL進行整合。【結果】對兩年兩點環境下分別檢測到的株高QTL進行整合總共得到5個株高QTL的位點：、、、和，分布于A2、C2和C3染色體上，解釋2.6%—55.6%的表型方差。其中，和只在武漢檢測到，而、和只在西寧檢測到。位于C2連鎖群的主效QTL-只在西寧被重復檢測到，而且LOD值、加性效應和貢獻率（分別為23.4、-16.0和55.6%）均高于前人報道，是目前發現的效應最大的一個油菜株高QTL。基于油菜基因組物理圖譜對本研究和已報道的油菜株高QTL和植物株高基因分別進行整合和比對分析，獲得了一個由183個QTL和287個候選基因組成的相對完整的油菜株高遺傳結構圖。其中，有18個株高QTL簇能在不同研究中被共同檢測到，分布在A1、A2、A3、A6、A7、A9、C6和C7染色體上。另外，本研究定位到的5個油菜株高QTL的物理位置和已報道的油菜株高QTL均不重疊，因而是新的株高QTL位點。其中，、和物理區間內總共找到了15個株高同源基因，而11個在2個親本中存在序列變異，被選作候選基因進行進一步研究。【結論】QTL定位和整合獲得5個油菜株高QTL，均為首次報道而且都只在武漢或西寧被檢測到。其中位于C2連鎖群的主效QTL效應值超過以往報道，表現出極強的QTL與環境的互作。通過與已報道的油菜株高QTL和植物株高基因分別進行整合和比對分析，較為全面地揭示了油菜株高的遺傳結構和候選基因，生物信息學分析還鑒定到11個位于本研究定位到的3個株高QTL區間內的候選基因。

甘藍型油菜；株高；遺傳結構；QTL；候選基因；QTL與環境的互作

0 引言

【研究意義】油菜是中國第一大油料作物[1]，也是中國唯一的冬季油料作物[2]，近年來，種植面積和總產均占全世界的20%左右（http://apps.fas.usda. gov/psdonline/）。菜籽油是世界植物油第二大來源，同時也是中國食用植物油第一大來源，占中國國產油料作物產油量的55%以上，在國家食用油供給安全戰略中地位十分重要[3-4]。然而，由于單產和機械化水平低共同造成的生產效益低下是制約油菜產業發展的主要因素[3]。從作物品種的演變歷程可以看出，品種產量提高和種植方式升級的背后往往伴隨著株型的選擇和優化。株高是油菜株型的主要決定因素之一[5-6]，不但與油菜收獲指數以及產量密切相關，而且也是影響抗倒伏能力和機械化收獲特性的一個重要因素[3,7]。因此，油菜株高遺傳結構的解析，對于培育油菜理想株型品種具有重要的理論與現實意義。【前人研究進展】油菜株高是一個典型的數量性狀，表型連續分布且容易受到環境條件的影響[3]。近十年來，利用連鎖[8-13]或關聯分析[5,14-21]的方法，在油菜中已經定位到200多個株高QTL。這些株高QTL在油菜所有19個連鎖群上都有分布，其中絕大部分貢獻率都比較低，而只在A2、A3、C2和C6連鎖群上發現了少數幾個效應較大的QTL。Shi等[15]用源自Tapidor和寧油7號的202個雙單倍體及其衍生的“重構F2”群體，在10個環境中共定位到44個株高QTL，分布于A1-3、A5-10、C3、C6、C7和C9染色體上。LI等[12]用472個油菜核心種質和60K油菜SNP芯片進行全基因組關聯分析，在3個環境中共檢測到8個株高QTL，分布于A3、A5、A7和C7染色體上。Wang等[13]用顯性矮桿突變體（源自油菜純系NJ7982的EMS誘變）和中雙11衍生的回交分離群體將該位點精細定位到A9染色體152 kb的區段，并從14個注釋基因中鑒定了7個候選基因。Liu等[22]克隆了油菜A6染色體上一個半顯性矮桿突變體基因（源自92-B10雙單倍體的EMS誘變），該基因（）編碼DELLA蛋白作為赤霉素信號的受體。雖然油菜株高基因的克隆尚處于起步階段，但在模式植物擬南芥和主要農作物中已經鑒定了一大批調控株高的基因[23-24]，大多與赤霉素、油菜素內酯和生長素等植物激素的合成或信號轉導途徑有關。【本研究切入點】因為不同研究者進行油菜株高QTL定位的遺傳圖譜或標記系統不同，很難準確判斷這些QTL之間的位置關系進而將它們整合，因此無法揭示一個相對完整的油菜株高的遺傳結構圖。另外，檢測到的油菜株高QTL效應偏小難以被精細定位并克隆，而植物中揭示的株高基因及其調控途徑可以為油菜株高的基因克隆和機理研究提供借鑒和參考。【擬解決的關鍵問題】基于油菜測序品種中雙11和No.73290構建的BnaZNF2群體，對油菜株高性狀進行多年多點QTL定位，同時利用已發表的油菜基因組物理圖譜和已報道的株高QTL進行整合和比較，最后利用植物中已克隆的株高基因進行同源比對并篩選QTL區間內的候選基因，系統地揭示油菜株高的遺傳結構及候選基因，為油菜株高的遺傳研究和分子改良打下基礎。

1 材料與方法

2009年10月至2010年5月、2010年10月至2011年5月在武漢中國農業科學院油料作物研究所陽邏綜合試驗基地完成了BnaZNF2:3家系群體種植及田間考察工作。2011年4—8月在西寧青海大學農場完成了BnaZNF2:3和BnaZNF2:4家系群體的田間種植和表型鑒定工作。在這3個家系群體的基礎上于2016年對數據進行了QTL掃描定位和整合工作。

1.1 試驗材料

用來進行株高QTL定位的群體名為BnaZNF2[25]，來源于油菜測序品種中雙11（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/genomes/203?）和No.73290[26]。F2:3家系群體的種子由184個F2單株分別套袋自交所得；而F2:4家系群體的種子則由F2:3家系各單株分別套袋自交所得種子按數目等量混合而成。

1.2 田間試驗

田間試驗采用完全隨機區組設計，3次重復。每小區種兩行，行距33.3 cm，單株間平均間距16.7 cm。待油菜成熟時，每個小區隨機挑選10個有代表性的單株手工收獲晾干。

1.3 性狀考察和數據分析

株高考察參考油菜品種審定標準[27]，自子葉節至全株最高部分長度，以“cm”表示。用SAS V8軟件的PROC ANOVA程序對幾個環境的株高表型數據進行方差分析，利用遺傳方差模型對遺傳力進行估算。廣義遺傳力的計算公式：2=σg2/(σg2+σge2/n+σe2/nr)。其中，σg2、σge2和σe2分別代表基因型方差、基因型和環境互作方差以及誤差項；n和r分別代表環境數和重復數。

1.4 QTL定位

油菜分子育種課題組之前利用BnaZNF2群體構建的遺傳連鎖圖譜進行QTL定位[25]。該連鎖圖譜包含803個標記，19個連鎖群，圖譜總長1 763.2 cM。利用軟件WinQTLCart 2.5軟件[28]和復合區間作圖（composite interval mapping）的方法[29-30]進行QTL掃描。LOD閾值用1 000次重復排列測驗確定。基本參數設置：步長=1 cM；窗口大小=10 cM；控制標記數=5。用=0.05水平下的LOD閾值來確定顯著的QTL，為了避免漏掉微效QTL，那些可重復的=0.1水平下的QTL也被承認[6]。按照McCouch等[31]的方法對檢測到的QTL命名，以“”加上性狀再加染色體編號表示，字體為斜體。采用元分析[32]的方法對不同環境（地點×年份組合）中檢測到的QTL進行整合。

1.5 候選基因的鑒定

從已發表的文章中[6]收集植物中控制株高的基因約200個[33-49]。利用上述收集到的株高基因序列和油菜基因組注釋基因序列進行Blast比對（參數設置為：e-10），確認它們在油菜基因組中的同源基因。

2 結果

2.1 親本和群體株高表型和遺傳力分析

親本中雙11和No.73290的株高差別不大，兩者間的差異只在西寧2011年達到了顯著水平（圖1和表1）。但是，無論是BnaZNF2:3還是BnaZNF2:4群體株高在各個環境下都表現出廣泛的變異和超親分離，表明株高增效基因在2個親本中都有分布。而且，2個群體在各個環境下的株高都呈正態或近似正態分布，符合數量性狀的典型特征，表明該群體適合用來進行QTL定位。

通過對上述幾個環境下的株高進行方差分析（表2），結果表明，無論是基因型、環境還是它們之間的互作對株高的效應都達到了極其顯著的水平。通過方差組分估計出來的株高遺傳力為0.54。

2.2 多環境下株高QTL定位

用軟件WinQTLCart 2.5對武漢、西寧兩年4個環境下的株高數據分別進行QTL掃描。檢測到的單環境下的QTL經元分析整合后得到5個QTL（、、、和）分別位于A2、C2和C3連鎖群。這些QTL的LOD值在3.09—23.4，貢獻率在2.6%—55.6%（表3）。其中，和只在武漢檢測到，而、和只在西寧檢測到，說明環境對株高QTL的表達有很大影響。另外和的加性效應為正，說明這2個QTL的增效等位基因來自中雙11，而、和加性效應是負的，說明這3個QTL的增效等位基因來自No.73290。

表1 2個親本和群體在3個環境下的株高表型

在西寧2011年2個群體都重復檢測到了一個效應值很高的主效QTL，其LOD值、加性效應和貢獻率（分別為23.4、-16.0和55.6%）均高于前人報道，是目前為止發現的效應最大的一個油菜株高QTL。這個主效QTL只在西寧重復檢測到，而在武漢2年均檢測不到，呈現出很強的與環境的互作（圖2）。武漢和西寧在油菜種植期內的主要環境差別是日照長度和溫度，而有研究表明二者會影響植物株高[21,49]。因此，推測很有可能和日照長短或溫度有關。

2.3 和已報道的油菜株高QTL的整合與比較

油菜中已經有10多篇文獻報道了株高QTL的連鎖或關聯定位結果，共定位243個，分布在油菜所有19個連鎖群，其中，以A2、A3、A6、A7連鎖群分布較為集中。

為了進一步準確地比較這些QTL的位置，利用其連鎖/關聯的分子標記引物/探針序列和已發表的油菜基因組參考序列進行比對分析，確定了其中183個QTL的物理位置（圖3）。同時，也確定了定位的5個株高QTL的物理位置。通過比較發現，定位的5個QTL與前人報道的油菜株高QTL均沒有重疊，因而是新的油菜株高QTL位點。

圖1 BnaZNF2:3和BnaZNF2:4群體兩年兩點株高的頻率分布

表2 株高表型方差分析和遺傳力估算

圖2 qPH.C2-1與環境的互作

表3 武漢和西寧環境下檢測出的株高QTL

另外，綜合比較和前人研究中報道的株高QTL的物理位置，發現18個重疊的QTL簇，它們分布在A1、A2、A3、A6、A7、A9、C6和C7染色體上（表4）。這些能在不同的群體或環境中共同檢測到的QTL可信度高、穩定性好，應成為油菜株高分子標記輔助選擇研究的重點。

2.4 候選基因鑒定

通過廣泛查閱文獻，收集到223個控制植物株高的基因，用它們的序列和油菜基因序列進行Blast分析，發現它們在油菜參考基因組中共有727個同源基因（圖3）。其中，287個位于上述QTL的物理區間內，可以作為這些株高QTL的候選基因。本研究定位到的、和物理區間內分別找到了4、7和4個株高同源基因（表5）。其中，有11個株高同源基因在親本中存在序列差異，可以作為候選基因進行后續研究。而和物理區間內沒有找到株高同源基因，說明它們很可能是由新的株高基因控制的。

表4 不同研究檢測到的共同的油菜株高QTL

圖3 油菜株高QTL和同源株高基因在物理圖譜上的分布

表5 株高QTL候選基因鑒定

3 討論

雖然前人利用連鎖或關聯分析的方法在油菜中已定位了200多個株高QTL，但由于所用的遺傳圖譜和標記系統不同難以將它們整合，因此尚未獲得一個相對完整的油菜株高的遺傳結構圖。基于已發表的油菜參考基因組序列[50]，將這些油菜株高QTL整合在同一個物理圖譜上，從而獲得了首張油菜株高遺傳結構圖。這些QTL分布在油菜所有19個連鎖群，其中絕大部分貢獻率都在10%以下，而只有11個效應較大，可以作為后續精細定位和基因克隆的目標。另外，本研究還發現了在不同研究中共同檢測到的18個油菜株高QTL簇，可以作為分子標記輔助選擇的靶點。這些研究結果說明油菜株高是一個由眾多基因控制的數量性狀，具有非常復雜的遺傳基礎。

本研究定位了5個株高QTL，都與已報道的株高QTL位置不重疊，應該代表新的油菜株高QTL位點。其中，只在西寧（春油菜生態區）而不是武漢（半冬性油菜生態區）被重復檢測到，可以作為研究QTL和環境互作效應的范例，這也說明環境對株高QTL表達有很大影響。另外，的貢獻率和加性效應都高于前人的報道，可以作為下一步基因克隆的首選目標。本研究定位的這5個株高QTL物理區間（范圍：0.302—1.811 Mb；均值：1.153 Mb）略小于前人的報道，這可能跟它們都位于染色體較為末端的位置有關，因為這些區域的重組更為頻繁。

目前，油菜株高遺傳研究整體上還處于QTL初步定位階段，尚無油菜株高QTL被精細定位，更沒有被克隆的報道。這很可能是因為已報道的株高QTL效應都小，而且株高受環境條件的影響較大而表型難以準確鑒定，因此，難以進行精細定位和克隆。因此，很多研究者轉而利用油菜株高突變體進行研究，精細定位或克隆了少數幾個株高基因[10,50]。而本研究發現的油菜株高主效QTL是目前為止效應最大的，完全具備進一步精細定位和克隆的基礎，從而為油菜株高的遺傳改良打下理論基礎并提供技術支撐。

4 結論

QTL定位和整合獲得了5個油菜株高QTL，均為首次報道而且都只在武漢或西寧被檢測到。其中位于C2連鎖群的主效QTL效應值超過以往報道，表現出極強的QTL與環境的互作。通過與已報道的油菜株高QTL和植物株高基因分別進行整合和比對分析，較為全面地揭示了油菜株高的遺傳結構和候選基因。另外，鑒定到11個位于本研究定位到的3個株高QTL區間內的候選基因。

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（責任編輯 李莉，岳梅）

QTL mapping and integration as well as candidate genes identification for plant height in rapeseed (L.)

ZHANG JiangJiang1, ZHAN JiePeng1, LIU QingYun2, SHI JiaQin1, WANG XinFa1,LIU GuiHua1, WANG HanZhong1

(1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062;2Oil Crops Extension Station of the Agricultural Bureau of Xishui County, Huanggang 438200, Hubei)

【Objective】In order to reveal the genetic architecture and candidate genes for plant height in rapeseed, QTLs were mapped in multiple environments and were integrated with previously reported plant height QTLs and then aligned with the plant height genes, which will provide a basis for the molecular improvement of plant height in rapeseed. 【Method】The BnaZNF2population of 184 individuals derived from the elite rapeseed cultivar Zhongshuang11 (de novo sequencing) and No.73290 (re-sequencing) was used as the experimental material. First, the BnaZNF2population was subjected to genotype analysis and a high-density linkage map of 803 molecular markers was constructed using Joinmap 4.0. Second, the F2:3and F2:4family of BnaZNF2population were planted and phenotyped at two locations (Wuhan and Xining) for successive two years (2010 and 2011). Then QTL mapping was conducted by the composite interval mapping method incorporated into WinQTLCart 2.5 software, using the genotype of BnaZNF2population and the plant height phenotype of its F2:3and F2:4family. 【Result】After integration of QTLs detected in two locations over two years, a total of 5 consensus QTLs (,,,,) were obtained, which were distributed on A2, C2 and C3 chromosomes and, explained 2.6%-55.6% of the phenotypic variance. A major QTL on the C2 chromosome,, was only detected repeatedly in Xining and its LOD value, additive effect and2(23.4, -16.0 and 55.6%, respectively) were largest among all of the reported plant height QTLs. Based on the physical map of rapeseed, all of the currently and previously reported plant height QTLs in rapeseed were integrated and then aligned with the plant height genes, which revealed a relatively completed genetic architecture map consisting of 183 QTLs in rapeseed and 287 candidate genes in rapeseed. Of these, a total of 18 QTL cluster were commonly detected in different studies, which were distributed on A1, A2, A3, A6, A7, A9, C6 and C7 chromosomes. In addition, the physical positions of the five QTL detected in the current study were all not overlapped with those of the previously detected plant height QTL, which should be novel. A total of 15 homologues of plant height genes were found within the physical intervals of,and, of which 11 homologues showed sequence variations between the two parents, which were chosen as the candidates for further study. 【Conclusion】QTL mapping and integration identified five QTL for plant height in rapeseed, which were all novel. The effect of the major QTL on the C2 chromosome was larger than those of the previously reported plant height QTL, which also showed the strong interaction with the environment. The integration of the reported plant height QTLs and the alignment with the plant height genes systematically revealed the genetic architecture and candidate genes for plant height in rapeseed. By bioinformatics analysis, a total of 11 candidates were identified within the physical intervals of three plant height QTLs detected in the current study.

L.; plant height; genetic architecture; QTL; candidate genes; QTL by environment interaction

2017-01-20；接受日期：2017-04-05

國家油菜產業技術體系（CARS-13）、中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2013-OCRI）、國家公益性科研院所基本科研業務費（1610172017001）、湖北農業科技創新中心

張江江，E-mail：zhangjiangjiang6@163.com。通信作者師家勤，Tel：027-86711553；E-mail：shijiaqin@caas.cn