PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來源巨噬細胞系的建立*

陸 琤 周晨辰 張鵬飛 張 硌 查玉華*

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來源巨噬細胞系的建立*

陸 琤①周晨辰①張鵬飛①張 硌①查玉華①*

目的：建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來源巨噬細胞系，為PLEKHQ1基因功能的研究奠定基礎。方法：用慢病毒感染的方法將包裝質粒pCDH-SV40/GFP導入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓來源巨噬細胞，建立永生化細胞系；觀察永生化細胞的生物學性狀，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測目的基因的整合，用RT-PCR鑒定目的基因的表達，并對永生化和非永生化骨髓來源巨噬細胞的生長狀況進行比較。結果：構建的骨髓來源巨噬細胞系已擴大培養并穩定傳代，經鑒定，SV40LT抗原已整合入細胞并穩定表達。結論：通過慢病毒感染細胞的方法成功構建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來源巨噬細胞系。

PLEKHQ1基因敲除小鼠；骨髓來源巨噬細胞；永生化；SV40LT抗原

基因PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing，family Q member 1)，又被稱為基因PLEKHO2(pleckstrin homology domain containing，family O member 2)，是一種包含490個氨基酸的蛋白質，屬于含有Pleckstrin同源區結構域(Pleckstrin homolgy domain，PHD)的蛋白超家族，目前尚無文獻專門對其功能進行報道[1]。本研究的前期實驗研究表明，PLEKHQ1可能在巨噬細胞的功能調控中發揮作用。因此，通過轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術[2-6]剪切PLEKHQ1外顯子DNA，使DNA發生修復后形成移碼突變，從而使控制PLEKHQ1蛋白表達的基因失活，得到PLEKHQ1基因敲除小鼠，經過繁殖篩選后，分離其骨髓細胞并誘導成巨噬細胞進行研究[7]。但是，原代培養的骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)生存期短，傳代次數有限，分離原代細胞不但工作量巨大，而且由于每批細胞來源于不同的個體，不可避免存在差異，限制了研究工作的開展。因此，有必要建立穩定的細胞系以便深入研究PLEKHQ1的功能。本研究采用慢病毒介導的方法，將SV40LT整合至野生型(wild type，WT)小鼠和PLEKHQ1基因敲除(knockout，KO)小鼠的BMDM基因組，使其永生化，為進一步探討PLEKHQ1基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

(1)C57BL/6 PLEKHQ1基因敲除及野生型小鼠各1只，均為雄鼠，包裝質粒PMD、SPA、pCDHSV40/GFP，均由本實驗室保存；293TX細胞為本實驗室保存；Q5超保真DNA聚合酶購自(英國NEB公司)；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen Life Technologies公司；RPMI1640培養基購自美國GIBCO公司；血清購自Hyclone；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；細胞DNA、RNA提取試劑盒均購自(北京)TIANGEN公司。其余常用試劑均為國產分析純。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物由北京天一輝遠有限公司合成。

(2)GL-1800型梯度基因擴增(PCR)儀(美國伯樂，BIO-RAD，C1000 Touch)；Thermo LABOFUGE 400R型低溫離心機(美國Thermofisher公司)；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；BIORAD，TC20細胞計數儀(美國伯樂公司)；EX 450-490 DM 505 BA520型熒光倒置顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse Ts 100)。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓來源巨噬細胞的分離和培養

將C57BL/6小鼠脫頸處死后，無菌條件下取后肢骨，將股骨和脛骨中的骨髓沖入培養皿中，此過程重復2次。過濾，加入紅細胞裂解液靜置10 min。1000 r/min，離心5 min，棄上清，1 ml培養基重懸骨髓細胞，接種于60 mm培養皿內。加入含20%的L929上清條件培養基，刺激骨髓細胞向巨噬細胞分化。放置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，于3 d換液1次，約8 d后貼壁細胞為巨噬細胞。

1.2.2 SV40LT慢病毒的包裝

293TX細胞于對數生長期時接種于60 mm培養皿中，用含10%血清的RPMI1640培養基培養。將PMD 1 μg、SPA 3 μg、pCDH-SV40/GFP 4 μg與100 μl無血清RPMI1640培養基溫和混勻，Lipofectamine 2000 16與100 μl無血清RPMI1640溫和混勻，室溫靜置5 min，再將二者混勻，室溫靜置20 min，將混合液緩慢滴入293TX細胞中，即完成轉染過程。轉染后8 h或過夜后換液，24～36 h收1次上清，補液5 ml。約72 h后再收上清，3 000 r/min 離心5 min，使得細胞等雜質沉淀，取上清用0.22 μm濾器過濾后加入millipore超濾離心管，3 000 r/min，離心5 min，后得約200 μl濃縮病毒，于-40 ℃保存或立刻使用。

1.2.3 骨髓來源巨噬細胞的感染及培養

待感染的BMDM少量接種至12孔板中的1孔，加入濃縮病毒20 μl，感染后72 h，在倒置熒光顯微鏡下，激發光于450～490 nm藍光波長照射下，觀察BMDM感染情況，判定感染率。

1.2.4 SV40T基因在BMDM中的整合及表達

(1)PCR擴增。收集PLEKHQ1基因KO小鼠及WT小鼠非永生化BMDM及永生化BMDM，提取基因組DNA。根據SV40大T抗原基因序列設計引物，上游引物5＇-CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA-3＇；下游引物5＇-TGTGGTATGGCTGATTATGA-3＇，擴增產物應為391 bp。使用Q5高保真聚合酶，反應條件：預變性98 ℃ 30 s，然后98 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個循環，72 ℃延伸2 min，4 ℃保持。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

(2)RT-PCR分析。按TIANGEN試劑盒操作法提取細胞RNA，進行反轉錄。SV40大T抗原基因引物序列及大小同上。內參β-肌動蛋白，上游引物為：5＇-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGA TG-3＇，下游引物為：5＇-CATCGTGCACCGCA AATGCTTCTAGG-3＇，擴增產物為260 bp，反應條件同上，PCR產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 KO小鼠的原代BMDM和永生化BMDM生長情況比較

取KO小鼠的原代BMDM和永生化第5代BMDM各接種3個孔至24孔板中，每孔接種10 000個細胞，用細胞計數儀每隔1 d計數取平均值，連續15 d，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 永生化BMDM的生物學性狀

BMDM具有粘附平展能力，在體外培養中呈貼壁生長。以KO小鼠為例，在平皿中可看到呈梭形、星形或圓形的貼壁細胞，有許多偽足和凸起。永生化的BMDM與非永生化的BMDM相比，在形態結構上無明顯差異，但能見到較多的細胞分裂相。在熒光顯微鏡下觀察，前者能觀察到綠色熒光，而后者觀察不到。如圖1所示。

2.2 BMDM中SV40的PCR擴增結果

使用質粒pCDH-SV40/GFP作陽性對照，對WT小鼠非永生化BMDM、WT小鼠第5代永生化BMDM、KO小鼠非永生化BMDM和KO小鼠第5代永生化BMDM，提取基因組DNA，后進行PCR，產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。結果3號條帶和5號條帶在391 bp處有一特異擴增條帶，與1號條帶位置相同，而2號條帶和4號條帶在該處無擴增條帶，如圖2所示。

2.3 BMDM中SV40的RT-PCR結果

永生化BMDM，無論是WT小鼠的還是KO小鼠的，有特異性擴增條帶，大小為391 bp，而非永生化的BMDM未見該條帶，內參為β-肌動蛋白，大小為260 bp，如圖3所示。

2.4 永生化BMDM和原代BMDM生長情況比較

將KO小鼠的第5代永生化BMDM與原代BMDM生長速率進行比較，二者均在培養第3 d進入快速增長期，但前者一直保持較快速率生長，而后者在培養約兩周后生長緩慢，進入平臺期，如圖4所示。

圖3 SV40T mRNA在非永生化BMDM和永生化BMDM中的表達電泳圖

圖4 KO小鼠永生化BMDM和原代BMDM生長情況示圖

3 結論

前期的研究結果表明，PLEKHQ1基因可能參與細胞因子與受體的相互作用，可能在調控細胞炎癥反應中發揮重要作用，且表達譜數據顯示其在巨噬細胞中特異高表達，因而本研究選擇小鼠巨噬細胞來進行PLEKHQ1基因的研究。但前期實驗已證實，原代培養的BMDM生長緩慢、生存期短，限制了實驗的開展[1]。因此，迫切需要建立永生化的骨髓來源巨噬細胞系，為下一步研究打下基礎。

永生化細胞是體外培養細胞自發的或在外界因素影響下獲得無限增殖能力的細胞[8]。建立永生化BMDM是實驗標準化、規范化的重要基礎。有些研究建立永生化細胞系只是單純用轉染的方法直接將pCDH-SV40/GFP導入細胞，效果不好，而本實驗研究先將pCDH-SV40/GFP包裝成慢病毒，再用慢病毒去感染細胞，能建立更加穩定的永生化細胞系

SV40是20世紀60年代發現的一種猴腎細胞病毒，目前被廣泛用于轉基因動物模型的建立和各種人類及動物細胞的永生化，SV40 T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可作為體外研究原始細胞的標準細胞模型[9-13]。本研究就是利用SV 40的這些特點，用慢病毒包裝并感染目的細胞的方法將BMDM永生化。本研究結果顯示，利用SV40T基因使WT和KO小鼠骨髓來源巨噬細胞永生化是一種可行、可重復的建系方法，且該永生化細胞系已穩定培養了半年，為PLEKHQ1基因的功能研究提供了可實行的方法和手段，成功構建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來源巨噬細胞系。

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Establishment of an immortalized bone marrow-derived macrophage cell line in PLEKHQ1 knockout mouse/

LU Cheng, ZHOU Chen-chen, ZHANG Peng-fei, et al//
China Medical Equipment,2017,14(9):167-170.

Objective: To establish an immortalized bone marrow-derived macrophage(BMDM) cell line in PLEKHQ1 knockout mouse so as to pave the way for further studies on the function of PLEKHQ1 gene. Methods: Packaging plasmid pCDH-SV40/GFP was transfected into wild type mouse BMDM and PLEKHQ1 knockout mouse BMDM by the means of lentivirus infection so as to establish immortalized cell lines. The cell morphology of immortalized cell lines was observed and Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the integration of the target gene, and RTPCR was used to identified the expression of target gene. The proliferation between the immortalized BMDM and nonimmortalized BMDM was compared and analyzed in the finally. Results: The established immortalized BMDM cell line has achieved stable growth and serial propagation, and the results of identification showed that SV40LT antigen gene has been integrated in cell and been stably expressed. Conclusion: An immortalized BMDM cell line of PLEKHQ1 knockout mouse has been successfully established by the mean of. lentivirus infecting cells.

PLEKHQ1 knockout mouse; Bone marrow-derived macrophage; Immortalization; SV40 LT antigen

Department of Medical Engineering, The Affiliated Hospital to Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)09-0167-04

R516.8

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.09.047

2017-06-07

國家自然科學基金(31400739)“PH結構域蛋白PLEKHQ1協調巨噬細胞遷移與激活的機制研究”；軍事醫學創新基金(2015CXJJ29)“PLEKHQ1調控細菌性膿毒敗血癥的功能和機制研究”

①軍事醫學科學院附屬醫院醫學工程科 北京 100071

*通訊作者：ygk307@sina.com

陸琤,女,(1987- ),碩士，助理工程師。軍事醫學科學院附屬醫院醫學工程科，從事細胞信號轉導研究工作。