磷酸奧司他韋膠囊有效成分含量測定方法研究

陳麗，馬書玉

摘 要：目的：通過文獻及方法學研究確立磷酸奧司他韋膠囊有效磷酸奧司他韋的含量測定方法。方法：HPLC法。色譜柱為全多孔硅膠微粒健合C8色譜柱（46mm×25cm，5？滋m）；流動相為甲醇：乙腈：磷酸二氫鉀-氫氧化鉀緩沖溶液（245：135：620）；等度洗脫；流速：1.2ml/min；UV檢測波長：207nm；進樣量：15μl；色譜柱溫度：50℃。結果：有效成分磷酸奧司他韋進樣量在3.0234～30.234μg與峰面積A呈良好的線性關系（r值0.9999），加樣回收率為99.67%，RSD為1.10%；結論：方法學試驗結果表明該方法測定磷酸奧司他韋膠囊含量準確、可靠、重復性好。

關鍵詞：磷酸奧司他韋膠囊；HPLC；含量測定

磷酸奧司他韋膠囊最早在1999年10月上市，原研藥商品名達菲，生產廠家為羅氏制藥。磷酸奧司他韋是其活性代謝產物的藥物前體，其活性代謝產物（奧司他韋羧酸鹽）是選擇性的流感病毒神經氨酸酶抑制劑。神經氨酸酶是病毒表面的一種糖蛋白酶，其活性對新形成的病毒顆粒從被感染細胞中釋放和感染性病毒在人體內進一步播散至關重要。磷酸奧司他韋的活性代謝產物能夠抑制甲型和乙型流感病毒的神經氨酸酶活性。在體外對病毒神經氨酸酶活性的半數抑制濃度低至納克水平。在體外觀察到活性代謝產物抑制流感病毒生長，在體內也觀察到其抑制流感病毒的復制和致病性。本品通過抑制病毒從被感染的細胞中釋放，從而減少了甲型或乙型流感病毒的播散。對自然獲得的和實驗室性流行性感冒進行的研究顯示：應用磷酸奧司他韋并沒有影響人體對感染產生正常的體液免疫反應。對滅活疫苗的抗體反應并沒有受磷酸奧司他韋治療的影響。目前國內市面上主要有羅氏生產的達菲和國產達菲即磷酸奧司他韋膠囊兩種。

本文參考了國內外約17篇文獻以及美國36版藥典，通過方法學驗證建立了磷酸奧司他韋的含量測定標準。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀：Waters2694-2996型，分析天平：METTLE XS205型。磷酸奧司他韋對照品（批號101096-201502）由中國藥品生物制品檢定所提供。流動相用甲醇、乙腈為色譜純；磷酸二氫鉀和氫氧化鉀為分析純；水為超純水；樣品磷酸奧司他韋膠囊為公司自制（中試級）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[1]：

色譜柱：全多孔硅膠微粒健合C8色譜柱（46mm×25cm，5？滋m）；柱溫：50℃

溶液A：將6.8g磷酸二氫鉀溶解在980mL水中。用1M氫氧化鉀溶液調節至pH6.0，用水稀釋至1L。

流動相：甲醇：乙腈：溶液A（245：135：620）。

稀釋劑：甲醇：乙腈：水（245：135：620）。

波長：207nm。

流速：1.2ml/min，進樣量：15μl。

2.2 對照品儲備液、對照品溶液制備

對照品儲備液：稱取磷酸奧司他韋對照品100.78mg，置10mL量瓶中，加入稀釋劑使溶解并定容至刻度，制得10mg/ml的對照品儲備液。

對照品溶液：精密量取上述對照品儲備液1ml至10ml容量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備：取磷酸奧司他韋膠囊20粒，取內容物混勻并研成細粉，精密稱取該粉末（約相當于奧司他韋50mg），置50mL容量瓶中，加入稀釋劑20ml適量，超聲波處理20分鐘，放冷，加稀釋劑至刻度后，搖勻，離心，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

按照2.1項色譜方法進行測定。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察

精密量取對照品溶液儲備液0.2ml，0.6ml，1ml，1.4ml，1.8ml，2.0ml置10ml容量瓶中，分別加稀釋劑至刻度，搖勻，制成0.2、0.6、1、1.4、2.0mg/ml的對照品溶液（線性考察）。按上述色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，制得標準曲線，考察線性關系，計算回歸方程得：A=959265C+3093.8 r=0.9999。試驗結果如下表1。

結果表明：磷酸奧司他韋濃度（以奧司他韋計）在0.2016～2.0156mg/ml（進樣體積15μl），即進樣量在3.0234～30.234μg范圍內，線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗：精密量取磷酸奧司他韋對照品溶液依照2.1項色譜條件連續進樣6針，每針15μl，記錄色譜圖及峰面積，以6針峰面積的相對標準偏差為評測指標，考察精密度。結果：磷酸奧司他韋對照品溶液連續進樣6次，峰面積相對標準偏差RSD結果為0.35%小于2%，說明精密度良好。

2.4.3 重復性試驗：按照上述2.3項供試品溶液制備方法，取同一批次磷酸奧司他韋膠囊樣品（規格75mg，批號1701071）平行制備6份供品試液， 取供試品溶液及對照品溶液各15μl，分別進樣，記錄色譜圖，計算磷酸奧司他韋的含量。結果：6平行份樣品的磷酸奧司他韋含量RSD值為 0.92%，小于2%表明供試品制備方法可靠穩定，方法重復性良好。

2.4.4 回收率試驗：取磷酸奧司他韋膠囊20粒（批號1701071），取內容物混勻并研成細粉，精密稱取該粉末（約相當于奧司他韋25mg）及對照品按高、中、低三個量（每個量3個平行樣，共9份樣品）分別置于9個50mL容量瓶中，分別加入稀釋劑20ml適量，超聲波處理20分鐘，放冷，加稀釋劑至刻度后，搖勻，離心，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。分別精密量取本項下供試品溶液和上述2.2項下對照品溶液各15μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標一點法計算得出含量和回收率。磷酸奧司他韋的加樣回收率（以奧司他韋計）結果：低濃度回收率平均值為99.49%，中濃度回收率平均值為98.68%，高濃度回收率平均值為100.83%。所有結果均在98.41%～101.72%之間，高中低三個濃度9個供試品回收率數據的平均值為99.67%，RSD為1.10%小于2%；所有結果均符合要求，標明該檢驗方法準確、可靠。

2.5 樣品測定

應用上述建立的磷酸奧司他韋含量測定方法對穩定性研究用自制中試級別的四批磷酸奧司他韋膠囊樣品的含量進行測定，測定結果分別為：75.05mg/片、75.02mg/片、75.09mg/片、75.11mg/片，結果均符合規定。通過實際測定，進一步驗證了方法得可靠性。

3 討論

通過方法學驗證試驗建立了磷酸奧司他韋膠囊含量測定方法。并證明該方法穩定可靠。另外，在研究實驗過程中主要遇到以下兩個問題值得討論。一是部分文獻使用C18色譜柱，而美國藥典選擇了C8色譜柱。二者的區別在于C18色譜柱碳鏈更長，保留性更好，C8高疏水性分析物、類固醇、脂類等大分子樣品分析；而C18則適合中等極性、非極性等小分子樣品分析。因此，對于磷酸奧司他韋，選擇C8更為合理。二是部分文獻流動相的水相為磷酸鈉鹽，而美國藥典為磷酸二氫鉀。通過比較試驗，對于磷酸奧司他韋的分析，只要二者摩爾濃度一致，對色譜表現沒有明顯區別。

參考文獻

[1]美國藥典，USP36.