沉默吲哚胺2,3-雙加氧酶2基因對黑色素瘤細胞B16-BL6增殖、遷移和侵襲的影響*

曾小平， 肖 楚， 晏頌欣, 劉燕玲， 周慧蓉， 徐方云， 潘 意， 王紅梅△

(1南昌大學基礎醫學院， 2江西科技學院， 江西 南昌 330006)

沉默吲哚胺2,3-雙加氧酶2基因對黑色素瘤細胞B16-BL6增殖、遷移和侵襲的影響*

曾小平1， 肖 楚1， 晏頌欣1, 劉燕玲2， 周慧蓉1， 徐方云1， 潘 意1， 王紅梅1△

(1南昌大學基礎醫學院，2江西科技學院， 江西 南昌 330006)

目的： 探討沉默吲哚胺2,3-雙加氧酶2(IDO2)基因對小鼠黑色素瘤B16-BL6細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的影響。方法: IDO2-siRNA轉染體外培養的黑色素瘤細胞B16-BL6，應用real-time PCR和Western blot檢測IDO2和IDO1基因的表達；平板集落形成實驗檢測IDO2基因沉默對腫瘤細胞增殖的影響；細胞劃痕實驗和Transwell小室細胞遷移實驗觀察IDO2對腫瘤細胞遷移的影響；Transwell小室侵襲實驗觀察腫瘤細胞侵襲能力。結果: 沉默B16-BL6細胞中IDO2基因能使細胞單集落形成密度降低,劃痕遷移變慢, Transwell小室細胞遷移數減少,侵襲細胞數減少。結論: 沉默IDO2可以影響黑色素瘤細胞B16-BL6的增殖、遷移和侵襲能力。

吲哚胺2,3-雙加氧酶2； 黑色素瘤； 細胞遷移； 細胞侵襲

近年來的研究發現，腫瘤細胞、免疫細胞如樹突狀細胞等能產生一種重要的免疫負調節因子——吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO;現又稱為IDO1)，它可以使腫瘤逃避免疫系統的監控，改變腫瘤侵襲和轉移能力，影響樹突狀細胞疫苗的臨床治療效果[1]。IDO1于1963年首次在兔的腸道中被發現，是色氨酸沿犬尿酸代謝途徑的第一步限速酶[2-3]。Mellor等[4]發現IDO1能減少細胞微環境中的色氨酸水平，即引起“色氨酸饑餓”，從而選擇性降低抗原依賴的T細胞活性。此外色氨酸的代謝產物如3-羥基氨基苯甲酸、犬尿素和喹啉也能導致T細胞抑制和死亡，IDO1還可以介導調節性T細胞形成從而引起腫瘤免疫逃逸[5]。2007年在人及小鼠體內發現一種新的具有IDO1樣活性的酶，被稱為吲哚胺2,3-雙加氧酶2(indoleamine 2,3-dioxyge-nase 2，IDO2)，此酶也可以分解色氨酸，是IDO1的同源蛋白，且結構上與IDO1有43%相似，其基因緊鄰IDO1基因的下游，位于人和小鼠的第8號染色體上[6]。由于IDO2分子發現的時間較晚，它的許多生物學特性及免疫抑制的機制還未闡明，但卻表現出比IDO1更強的抑制T細胞的抗腫瘤作用。同時IDO2對腫瘤本身生長、轉移和侵襲的作用仍不清楚。本研究通過篩選獲得高表達IDO2基因的小鼠黑色素瘤細胞B16-BL6，應用RNA干擾技術特異性沉默IDO2后觀察B16-BL6細胞生物學特性的變化，探討IDO2對腫瘤細胞的生長調控作用。

材料和方法

1材料與主要試劑

小鼠黑色素瘤細胞B16-BL6購自American Type Culture Collection (ATCC)；RPMI-1640培養基和胎牛血清購自HyClone； 胰蛋白酶購自Gibco；IDO2-siRNA和GL2-siRNA(control siRNA)購自Sigma；qPCR引物由上海拜力生物科技有限公司合成；SYBR Premix Ex Taq I kit購自TaKaRa；Transwell小室購自BD Biosciences；Lipofectamine 2000購自Invitrogen。

2方法

2.1IDO2-siRNA轉染B16-BL6細胞 小鼠黑色素瘤B16-BL6細胞常規復蘇后，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培養液重懸，置于細胞培養箱中37 ℃、5% CO2條件下培養，隔天換液，待細胞長至90%左右融合用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取生長良好的細胞均勻鋪板于12孔細胞培養板中，待細胞融合度達70%左右時按照Lipofectamine 2000的說明書進行轉染。4 h后換成含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液繼續培養。細胞實驗分為未處理組、轉染GL2-siRNA(control siRNA)的陰性對照組和轉染IDO2-siRNA實驗組。

2.2Real-time PCR和Western blot檢測B16-BL6細胞中siRNA對IDO1和IDO2的沉默效果 收集轉染后48 h的細胞，用Trizol試劑盒提取各組總mRNA, M-MLV 逆轉錄系統反轉錄成cDNA。SYBR Premix Ex Taq I kit及ABI 7500熒光定量PCR儀進行qPCR擴增和分析。IDO1的上游引物序列為5’- GGGCTTTGCTCTACCACATCCACT-3’，下游引物序列為5’-ACATCGTCATCCCCTCGGTTCC-3’，產物為234 bp；IDO2的上游引物序列為5’-TGCCTGATGGCCTATAACCAGTGT-3’，下游引物序列為5’-TGCAGGATGTGAACCTCTAACGCT-3’，產物為306 bp；GAPDH的上游引物序列為5’-GGGGTGAGGCCGGTGCTGAGTAT-3’， 下游引物序列為5’-CATTGGGGTAGGAACACGGAAGG-3’ 。反應條件為： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 30 s， 40個循環； 72 ℃延伸10 min。每組樣本設3個復孔，取其平均Ct值。以未處理組作參照，IDO1和IDO2的相對表達量用2-ΔΔCt表示。組織裂解液RIPA提取轉染48 h的細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取50 μg樣品進行SDS-PAGE，轉至硝酸纖維素膜，分別用相應的抗體孵育，ECL系統曝光顯影，膠片進行高清度掃描后收集圖像，以凝膠圖像灰度處理系統分析。

2.3平板集落形成實驗 將各組細胞配成細胞懸液，調整濃度為1×107cells/L，取100 μL細胞懸液接種于作好標記的培養皿中(即每個培養皿接種1 000個細胞)，補加培養液至5 mL，置于5% CO2、 37 ℃的細胞培養箱中培養；觀察各組細胞平板集落形成情況，在第7天將培養皿中的液體吸出，加PBS清洗2次后，加瑞氏染液的I液1 mL，使其覆蓋培養皿中所有的細胞，作用1 min后加入等量或稍多的瑞氏染液的II液輕輕搖勻，作用5 min后用自來水沖洗；晾干后拍照保存。

2.4劃痕實驗 取24孔板，每孔分別接種每組細胞1×105于1 mL細胞培養液中，置細胞培養箱中培養；24 h后吸出培養液，用10 μL的槍頭給每組豎直劃痕，力道保持平穩；用PBS緩慢清洗3遍，每孔各加1 mL的細胞培養液，于拍照顯微鏡下觀察拍照后放入細胞培養箱中培養24 h；取出觀察細胞遷移情況。

2.5Transwell細胞遷移實驗 將各組細胞換成無血清培養液培養12 h去除血清的影響；0.25%的胰蛋白酶消化細胞后用PBS洗1遍，并用10 g/L BSA的無血清培養基重懸。分別調整細胞濃度至1×109cells/L；將Transwell小室架在24孔板上，各小室內分別加入100 μL各組細胞懸液；24孔板的下室各加入500 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液；常規培養72 h取出小室，吸出培養液，用PBS淋洗；再用棉簽小心擦去上室膜細胞；用瑞氏染液固定染色，倒置顯微鏡下計數遷移至下室膜上的細胞，每個樣本隨機取5個視野計數，取平均值。

2.6Transwell細胞侵襲實驗 將Matrigel放入4 ℃冰箱過夜(12 h)，吸取融化狀態的Matrigel 10 μL，加70 μL的10 g/L BSA無血清培養基混合，加入Transwell小室的上室包被基底膜，室溫風干成果凍狀；吸出殘余液體，每孔加入50 μL含10 g/L BSA的無血清培養基水化基底膜，置于37 ℃培養箱中孵育30 min后； 細胞換成無血清培養12 h，消化后離心收集細胞沉淀，用PBS洗1遍，然后用10 g/L BSA的無血清培養基重懸。分別調整細胞濃度至1×109cells/L；將Transwell小室架于24孔板上，各小室內分別加入100 μL各組細胞懸液；24孔板的下室各加入500 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液，常規培養96 h；取出小室，吸出培養液，用PBS淋洗；再用棉簽小心擦去上室膜細胞；瑞氏染液固定染色，倒置顯微鏡下計數遷移至下室膜上的細胞，每個樣本隨機取5個視野計數，取平均值。

3統計學處理

以SPSS 17.0進行統計分析，計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用t檢驗法，多組間差異的比較用單因素方差分析法。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1siRNA對B16-BL6細胞中IDO2的沉默效果

我們的前期實驗比較了不同來源的腫瘤細胞系IDO2的表達情況，篩選出高表達IDO2基因的小鼠黑色素瘤B16-BL6細胞(數據未公布)，并且挑選出能有效干擾B16-BL6細胞IDO2表達的siRNA進行轉染。應用real-time PCR檢測轉染細胞中IDO1和IDO2的表達，可見轉染IDO2-siRNA后B16-BL6細胞IDO2的表達明顯降低，而IDO1并沒有受影響，用2-ΔΔCt法計算得到IDO2的沉默效率為67%左右。Western blot檢測顯示細胞IDO2蛋白表達亦顯著減少，見圖1。

Figure 1. Transfection with IDO2-siRNA decreased IDO2 expression, but the expression of IDO1 in the B16-BL6 cells was not affec-ted. The mRNA expression of IDO2 and IDO1 was detected by real-time PCR (A), and the protein expression of IDO2 was determined by Western blot (B) in the B16-BL6 cells transfected with IDO2-siRNA or GL2-siRNA (control siRNA). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsGL2-siRNA group.

圖1Real-timePCR和Westernblot檢測轉染IDO2-siRNA對B16-BL6細胞IDO2和IDO1表達的影響

2細胞平板集落形成實驗

通過細胞集落形成實驗觀察IDO2沉默后細胞的生長情況。經平板集落形成7 d后，各組細胞克隆形成，倒置顯微鏡拍照，在40倍顯微鏡下隨機取5個視野計算形成的單克隆數，含50個以上細胞形成的集落為一個統計并作圖。IDO2-siRNA沉默組較正常對照組及siRNA對照組形成的集落密度和大小都顯著減少，各組平均單集落數分別為6.8±0.6、11.8±1.0和10.3±0.7，IDO2沉默組克隆形成數明顯減少(P<0.05)。結果提示沉默細胞中的IDO2能抑制B16-BL6細胞的增殖，見圖2。

3細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗觀察經劃痕處理后培養24 h細胞遷移情況，計算每組細胞的遷移率=(D0h-D24h)/D0h。正常對照組、siRNA對照組及IDO2-siRNA組細胞的遷移率分別為0.73±0.08、0.70±0.05和0.38±0.04，B16-BL6細胞轉染IDO2-siRNA后，與對照組比較細胞遷移率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. Transfection with IDO2-siRNA decreased the numbers of colony formation in the B16-BL6 cells (×40). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsGL2-siRNA group.

圖2細胞的集落形成實驗檢測轉染IDO2siRNA后B16-BL6細胞的集落形成數

Figure 3. The effect ofIDO2 silencing on the migration ability of the B16-BL6 cells detected by the wound healing assay (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsGL2-siRNA group.

圖3細胞劃痕實驗檢測IDO2基因沉默對B16-BL6細胞遷移能力的影響

4B16-BL6細胞Transwell遷移實驗

Transwell遷移實驗觀察IDO2對B16-BL6細胞遷移能力的改變。正常對照組、siRNA對照組和IDO2沉默組遷移到下室的細胞數分別為90.4±3.7、88.6±5.1和56.2±4.0，差異有統計學意義(P<0.01)。這提示沉默細胞中的IDO2能降低B16-BL6細胞的遷移能力，見圖4。

5B16-BL6細胞Transwell侵襲實驗

Transwell侵襲實驗顯示正常對照組、siRNA對照組和IDO2沉默組侵襲到下室的細胞數分別為111.2±10.6、110.8±10.2和44.8±9.6，沉默細胞中的IDO2能降低B16-BL6細胞的侵襲能力，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

討 論

色氨酸是人體含量最少的必需氨基酸，對維持細胞活化和增殖有重要意義，也是T淋巴細胞保持活性和生存所必需的氨基酸。色氨酸主要是沿犬尿酸通路進行分解，該途徑的第一步限速反應為色氨酸氧化生成N-甲酰犬尿酸原，目前發現有3種限速酶能夠催化此反應：色氨酸雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase，TDO)、IDO1和IDO2。TDO主要存在于肝臟，催化食物來源的色氨酸，受糖皮質激素及左旋色氨酸的誘導[7-8]。IDO1和IDO2是肝臟以外的主要限速酶。盡管IDO2和IDO1一樣也是色氨酸代謝的限速酶，但是它們的酶學活性、對底物的親和力、在哺乳動物和人體內的表達以及免疫學上表現的作用并不完全一致[9]；二者表達誘導因素也是不一樣，IDO1容易被IFN-γ所誘導，而IDO2卻很少被誘導[10]。IDO1和IDO2對T淋巴細胞增殖抑制反應也存在不同的信號通路和不同的免疫調節作用，因而可以認為IDO2與IDO1之間既存在相互聯系，又有著不同的作用機制。

Figure 4. The effect ofIDO2 silencing on the migration ability of B16-BL6 cells detected by the Transwell migration assay (×200). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsGL2-siRNA group.

圖4Transwell小室遷移實驗檢測IDO2沉默對B16-BL6細胞遷移能力的影響

Figure 5. The effect ofIDO2 silencing on the invasion ability of the B16-BL6 cells detected by the Transwell invasion assay (×200). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsGL2-siRNA group.

圖5Transwell小室侵襲實驗檢測IDO2對B16-BL6細胞侵襲能力的影響

IDO2作為免疫負調控因子對T細胞的影響已有部分報導，那么它的表達反過來很可能也影響了腫瘤的某些生長特性。由于IDO2與IDO1結構上存在一定的相似性且有共同的酶學底物，到目前為止還沒有一種特異性抑制劑能有效地阻斷其酶學活動，因而我們應用RNA干擾技術特異性沉默IDO2、而不影響IDO1表達來研究其對腫瘤生物學活性的影響作用。我們的結果顯示沉默IDO2后，黑色素瘤細胞B16-BL6的集落形成數量和大小明顯下降，表明其增殖是受抑制的。微環境中色氨酸耗竭以及生成的代謝中間產物可引起細胞增殖受到抑制[11];有研究顯示沉默IDO1可以使細胞增殖加快[12]。因而我們推測IDO2對腫瘤細胞的調控可能與IDO1有著不同的機制，并不完全依賴于它的酶活性，或者它的酶活性是在某些條件下才能發揮作用[13]。研究表明腫瘤內雖然有IDO2表達，但通常只有IDO1分解色氨酸，而 IDO2處于失能狀態，不影響色氨酸代謝[14]。IDO2是否對腫瘤細胞的侵襲轉移能力有影響呢？我們的體外研究結果顯示沉默IDO2后，黑色素瘤細胞遷移速度明顯減慢，在Transwell侵襲實驗中從上室侵襲到下室的細胞也顯著減少。研究表明IDO2通過誘導真核細胞轉錄起始因子2α磷酸化而上調肝臟富含的抑制蛋白的表達，進而調節免疫基因亮氨酸拉鏈的表達，參與調節細胞增殖和免疫反應，且該過程不能被逆轉[15]。應用IDO2抑制劑不僅可以更有效地減小小鼠腫瘤體積，還可以增加腫瘤反應性T細胞的數量，而IDO1抑制劑僅引起荷瘤動物腫瘤體積減小，并且二者發揮不同的免疫調節作用[16]，因而IDO2被認為與腫瘤侵襲和遠處轉移有著更為密切的關系。

[1] Uyttenhove C, Pilotte L, Theate I, et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase[J]. Nat Med, 2003, 9(10):1269-1274.

[2] 岳莉英, 關志明, 裴志強. 內皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制周細胞遷移及收縮蛋白表達[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(2): 256-260.

[3] Yamamoto S, Hayaishi O. Tryptophan pyrrolase of rabbit intestine. D- and L-tryptophan-cleaving enzyme or enzymes[J]. J Biol Chem, 1967, 242(22):5260-5266.

[4] Mellor AL, Munn DH. Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation?[J]. Immunol Today, 1999, 20(10):469-473.

[5] Lee GK, Park HJ, Macleod M, et al. Tryptophan deprivation sensitizes activated T cells to apoptosis prior to cell division[J]. Immunology, 2002, 107(4):452-460.

[6] Schierwater B, de Jong D, Desalle R. Placozoa and the evolution of Metazoa and intrasomatic cell differentiation[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(2):370-379.

[7] 李娟娟， 李 洋， 楊 青. 人源吲哚胺2,3-雙加氧酶-2的表達與純化[J]. 復旦學報: 醫學版, 2016, 43(4):401-408.

[8] 劉燕玲， 王紅梅， 閔衛平. 色氨酸2,3-雙加氧酶2的生物學特性及其在免疫調節與腫瘤治療中的作用[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2015, 31(6):856-859.

[9] Merlo LM, Pigott E, DuHadaway JB, et al. IDO2 is a critical mediator of autoantibody production and inflammatory pathogenesis in a mouse model of autoimmune arthritis[J]. J Immunol, 2014, 192(5):2082-2090.

[10] Brooks AK, Lawson MA, Rytych JL, et al. Immunomodulatory factors galectin-9 and interferon-gamma synergize to induce expression of rate-limiting enzymes of the kynurenine pathway in the mouse hippocampus[J]. Front Immunol, 2016, 7:422.

[11] Uyttenhove C, Pilotte L, Théate I, et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase[J]. Nat Med, 2003, 9(10):1269-1274.

[12] Kai S, Goto S, Tahara K, et al. Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase suppresses NK cell activity and accelerates tumor growth[J]. J Exp Ther Oncol, 2003, 3(6):336-345.

[13] Fatokun AA, Hunt NH, Ball HJ. Indoleamine 2,3-dioxygenase 2 (IDO2) and the kynurenine pathway: characteristics and potential roles in health and disease[J]. Amino Acids, 2013, 45(6):1319-1329.

[14] L?b S, Konigsrainer A, Zieker D, et al. IDO1 and IDO2 are expressed in human tumors: levo- but not dextro-1-methyl tryptophan inhibits tryptophan catabolism[J]. Cancer Immunol Immunother, 2009, 58(1):153-157.

[15] Metz R, Duhadaway JB, Kamasani U, et al. Novel tryptophan catabolic enzyme IDO2 is the preferred biochemical target of the antitumor indoleamine 2,3-dioxygenase inhibitory compound D-1-methyl-tryptophan[J]. Cancer Res, 2007, 67(15):7082-7087.

[16] Hou DY, Muller AJ, Sharma MD, et al. Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase in dendritic cells by stereoisomers of 1-methyl-tryptophan correlates with antitumor responses[J]. Cancer Res, 2007, 67(2):792-801.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Gene silencing of indoleamine 2,3-dioxygenase 2 influences proliferation, migration and invasion of B16-BL6 melanoma cells

ZENG Xiao-ping1, XIAO Chu1, YAN Song-xin1, LIU Yan-ling2, ZHOU Hui-rong1, XU Fang-yun1, PAN Yi1, WANG Hong-mei1

(1Basic Medical College of Nanchang University,2Jiangxi University of Technology, Nanchang 330006, China. E-mail: wanghongmay@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of indoleamine 2, 3-dioxygenase 2 (IDO2) silencing on proliferation, migration and invasion of B16-BL6 melanoma cells.METHODS: IDO2-siRNA was transfected into the B16-BL6 melanoma cellsinvitro. The expression of IDO2 or IDO1 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot. Colony formation assay was performed to analyze the proliferation ofIDO2-silencing tumor cells. The migration ability of B16-BL6 cells after silencing ofIDO2 was measured by wound healing assay and Transwell cell migration assay. The invasion ability of the tumor cells was detected by Transwell cell invasion assay.RESULTS: IDO2-siRNA signi-ficantly down-regulated IDO2 expression in B16-BL6 melanoma cells, and did not affect IDO1 expression. Compared with control group, the colony formation ability, the migratory distance measured by wound healing assay, and the migration and the invasion cell numbers detected by Transwell assay all remarkably decreased in theIDO2-silencing cells.CONCLUSION:IDO2 silencing affects the proliferation, migration and invasion abilities of the B16-BL6 melanoma cells.

Indoleamine 2,3-dioxygenase 2; Melanoma; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)09- 1619- 06

2017- 02- 20 [

] 2017- 07- 22

江西省教育廳科學技術研究項目(No. 14090)

R739.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.014

△通訊作者 Tel: 13767004966； E-mail: wanghongmay@hotmail.com