郭燕君， 徐 營， 劉勝兵， 侯 杰， 葉先才， 王志堅， 沈忠飛

(嘉興學院醫學院， 浙江 嘉興 314001)

LC3蛋白在小鼠卵泡顆粒細胞中的表達及定位研究*

郭燕君， 徐 營， 劉勝兵， 侯 杰， 葉先才， 王志堅， 沈忠飛△

(嘉興學院醫學院， 浙江 嘉興 314001)

目的： 探討自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)在小鼠卵泡顆粒細胞中的表達及定位。方法: 昆明小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)前及注射后的第1、2、3、4、5天，采用免疫組織化學染色方法檢測自噬相關蛋白LC3和凋亡相關蛋白cleaved caspase-3在卵泡中表達及共定位情況；促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)處理顆粒細胞后，Western blot檢測LC3和cleaved caspase-3在顆粒細胞中的水平，免疫熒光方法對LC3在顆粒細胞中的亞細胞定位進行研究。結果: 在小鼠卵泡發育的各個階段，LC3蛋白主要在顆粒細胞中表達；免疫熒光顯示在閉鎖卵泡的顆粒細胞中cleaved caspase-3和LC3的蛋白水平較高；在PMSG腹腔注射后第1、2天，顆粒細胞cleaved caspase-3和LC3-II的蛋白水平減少(P<0.05)；在PMSG腹腔注射后第3、4、5天，顆粒細胞的cleaved caspase-3和LC3-II蛋白水平依次增加； LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平具有相關性(r2=0.8299，P<0.05)。FSH處理后，LC3-II定位于顆粒細胞胞漿并呈點狀分布。結論: LC3主要在卵泡顆粒細胞中表達，其表達具有細胞特異性和區域特異性，提示自噬在卵泡發育過程中主要在顆粒細胞中發生。卵巢顆粒細胞自噬和凋亡具有相關性，均呈促性腺激素依賴性。

顆粒細胞； 輕鏈蛋白3； Cleaved caspase-3； 卵泡發育

在哺乳動物卵巢中，僅有一小部分的卵泡完全成熟并排卵，大多數的卵泡最終將閉鎖和死亡。雖然卵泡閉鎖的過程在卵巢周期中重復發生，但是大多數細胞死亡的確切機制還沒有完全闡述清楚。有研究發現卵泡閉鎖與顆粒細胞凋亡相關[1]。但是，卵泡閉鎖過程可能不是僅僅只有凋亡參與，已有研究顯示在鵝和鵪鶉的竇狀卵泡中觀察到非凋亡形式的程序性細胞死亡(自噬和壞死樣細胞死亡)現象[2-3]。

自噬是細胞內的降解系統，細胞內一部分胞質被一種具有雙層膜結構的自噬體所包裹后，與溶酶體融合最終降解[4]。最開始自噬被認為是細胞對于饑餓和應激反應的一種自救反應[5]，但是，后續很多研究顯示自噬可以通過過度的自我消化和降解重要的細胞內組成結構來促進細胞死亡[6]。最近研究發現自噬可以被各種誘導凋亡的刺激激活[7]。特別是在人類卵泡顆粒細胞中，暴露于氧化型低密度脂蛋白中的內皮細胞可以通過自噬的方式發生凋亡性死亡[8]。由于顆粒細胞是在卵泡閉鎖過程中的最先發生凋亡的細胞，所以自噬可能參與了卵泡發育的過程[9]。到目前為止，自噬參與卵泡發育和閉鎖過程以及自噬誘導的具體機制還不清楚。本文從顆粒細胞凋亡的角度來探討自噬在卵泡發育閉鎖過程中的發生機制。

材料和方法

1動物

SPF級4周齡大小的健康雌性昆明小鼠，體重18～25 g，購自浙江省實驗動物公共管理平臺，實驗動物許可證號為SCXK(浙)2014-0001。

2試劑儀器

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和牛血清白蛋白購于 Sigma；抗微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)兔多克隆抗體和cleaved caspase-3兔多克隆抗體購于Cell Signaling Technology；BCA試劑盒、生物素鏈接的II抗和β-actin抗體購于碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔II抗購于Santa Cruz Biotechnology；HTF、BIO-AMF2培養基由Gibco生產；Triton X-100購于北京索萊寶科技有限公司；DAB試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司；其它試劑為國產分析純。3111型二氧化碳培養箱購于Thermo；熒光顯微鏡為Olympus產品；切片機購于Leica。

3方法

3.1動物處理 8周齡雌性昆明小鼠腹腔注射10 U PMSG誘導卵巢卵泡發育和閉鎖。分別在PMSG注射前及注射后第1、2、3、4、5天頸椎脫臼法處死小鼠，將一側卵巢脫水固定進行石蠟包埋后用于組織切片，另一側卵巢無菌條件下分離小鼠卵巢顆粒細胞。

3.2顆粒細胞收集培養 分離一側卵巢于無菌條件下分離小鼠卵巢顆粒細胞，HTF培養液清洗，體視顯微鏡下剝離卵巢周圍脂肪和被膜，用1 mL注射器針頭刺破卵泡，釋放出顆粒細胞，1 500 r/min離心7 min，加入HTF培養液清洗2次后，棄上清，收集細胞用于Western blot實驗。

3.3免疫組織化學染色 石蠟包埋的卵巢組織切片經過脫蠟、水化后，入10 mmol/L檸檬酸緩沖液中 30 min進行抗原修復。采用3% H2O2孵育30 min消除內源性過氧化物酶。5%牛血清白蛋白 孵育30 min封閉非特異性結合位點。洗滌，依次加抗LC3兔多克隆抗體(1∶300)和抗cleaved caspase-3兔多克隆抗體(1∶200)于4 ℃孵育過夜，去除切片上液體后，孵育生物素鏈接的II抗1 h(1∶2 000)，洗滌，通過DAB染色觀察鏈霉親和素-過氧化物酶結合抗體復合物顯色。HE復染后脫水封片，Olympus顯微鏡下攝像，用Image J軟件分析計數。

3.4免疫熒光染色 顆粒細胞培養過夜，去掉未貼壁的細胞后分組，培養基去血清，采用細胞饑餓方式誘導細胞自噬，FSH組則另外添加100 μg/L促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)處理細胞。24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，封閉液封閉2 h，加入LC3兔多抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，PBS 洗3次，加入FITC標記的羊抗兔IgG (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，PBS洗后DAPI染核30 s，用抗熒光淬滅液封片觀察，Olympus熒光顯微鏡下攝像分析。

3.5Western blot實驗檢測蛋白水平 吸去收集的顆粒細胞上清液，PBS洗滌，1 500 r/min離心7 min后棄去上清，加入100 μL RIPA蛋白裂解液(含1 μL PMSF蛋白酶抑制劑)，冰上靜置20 min，12 000 r/min離心30 min，取部分上清，BCA試劑盒測定總蛋白濃度；取30 μg 蛋白100 ℃水浴 10 min 變性，120 V恒壓電泳70 min后，200 mA轉膜2 h，5% BSA封閉1 h，再分別加兔抗LC3多克隆抗體I抗(1∶5 000)、抗cleaved caspase-3兔多克隆抗體I抗(1∶1 000)及β-actinⅠ抗(1∶1 000)于4 ℃冰箱中過夜，TBS洗3次，TBST洗1次，然后分別加HRP標記的羊抗兔II抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，TBS洗3次，TBST洗1次，暗室中加ECL化學發光劑顯影；Image Pro-Plug 6.0分析軟件測定目的條帶的光密度值,以目的條帶的光密度值與β-actin條帶的光密度值比值作為該目的蛋白的相對表達量。

4統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)描述，應用SPSS 16.0軟件建立數據庫，檢驗數據的正態性后，進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法。LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平相關性采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1自噬在卵巢卵泡細胞中的定位

LC3蛋白作為檢測自噬的標志物被廣泛使用。我們通過向未成熟昆明小鼠腹腔注射PMSG，免疫組織化學染色法檢測LC3表達分析卵巢卵泡細胞中自噬的情況。免疫組化方法顯示原始卵泡中LC3表達微弱。相比，初級卵泡和竇狀卵泡顆粒細胞中LC3強烈表達。與此類似的是，在卵泡發育早期、中期和晚期竇狀卵泡中，顆粒細胞顯示LC3強烈表達(呈深棕黃色)，但是，膜細胞中LC3則微弱表達。在卵泡發育的各個階段，卵母細胞細胞質中LC3表達均為陰性，見圖1。

Figure 1. Immunolocalization of LC3 protein in the mouse ovarian follicles at different stages of development (×400). GC: granulosa cells; TC: thecal cells; O: oocytes.

圖1小鼠卵巢不同發育階段的卵泡中LC3定位表達情況

2卵泡發育和閉鎖過程中顆粒細胞自噬和凋亡

由于自噬形成時胞漿型LC3即LC3-I會酶解掉一小段多肽，轉變為自噬體膜型即LC3-II，因此，LC3-II/LC3-I比值的大小可估計自噬水平的高低。LC3-II表達高低是與自噬體的數量相關的。Cleaved caspase-3是凋亡性細胞死亡的最終途徑，顆粒細胞凋亡水平可以通過檢測cleaved caspase-3的蛋白水平來反映。在PMSG腹腔注射后第1、2天，顆粒細胞cleaved caspase-3的蛋白水平較沒有注射PMSG組顯著減少(P<0.05)。而且在PMSG腹腔注射后第3天，cleaved caspase-3的蛋白水平增加并維持到PMSG腹腔注射后第5天。在PMSG腹腔注射后第1、2天，顆粒細胞LC3-II的表達水平也顯著減少(P<0.05)，在PMSG腹腔注射后第3、4、5天的顆粒細胞LC3-II的表達水平增加。 LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平具有相關性(P<0.05)，見圖2。

未成熟的昆明小鼠腹腔注射PMSG后，卵巢組織LC3免疫組化定位顯示，在早期健康竇狀卵泡和中期健康竇狀卵泡顆粒細胞層中LC3蛋白表達呈弱陽性，而在早期和中期閉鎖竇狀卵泡的顆粒細胞層LC3蛋白表達呈強陽性，見圖3。

3促性腺激素依賴的顆粒細胞自噬

從PMSG處理1 d的小鼠卵巢分離的未處理顆粒細胞較FSH處理組相比，cleaved caspase-3及LC3-II的蛋白水平均顯著增加(P<0.05),見圖4。圖5顯示LC3-I在顆粒細胞胞漿中散在表達，LC3-II在胞漿中呈點狀表達在胞核的周圍。LC3陽性細胞計數，胞漿中呈點狀表達的顆粒細胞計算為自噬性細胞，非FSH處理組自噬性顆粒細胞比例為(84.2±1.2)%，FSH處理組為(61.5±1.3)%。

Figure 2. The protein levels of cleaved caspase-3 and LC3-II in the granulosa cells from immature mice at different times (0～5 d). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d.

圖2小鼠卵巢不同發育階段的卵泡中顆粒細胞cleavedcaspase-3和LC3-II蛋白的表達

Figure 3. Colocalization of cleaved caspase-3 and LC3 proteins on adjacent sections of healthy (A, C, E, G) and atretic (B, D, F, H) follicles from immature mice (×200). GC: granulosa cells; TC: theca cells.

圖3早期和中期健康有腔卵泡和閉鎖卵泡中cleavedcaspase-3和LC3的表達情況

討 論

細胞自噬是細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質，以實現細胞本身代謝需要和某些細胞器更新的過程[10]。自噬既可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器、代謝產物，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞，同時也可作為一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡[11-12]。 根據細胞物質到達溶酶體腔途徑的不同，自噬可以分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導的自噬3種形式，通常所說的“自噬”主要指大自噬，其過程大致包括自噬的誘導(形成自噬前體)、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成以及內容物的降解[13]。

本實驗中，通過未成熟昆明小鼠腹腔注射PMSG，免疫染色分析LC3蛋白來檢測自噬在卵巢卵泡細胞中的表達。在卵巢卵泡發育的各個階段中，卵母細胞LC3表達均為陰性。這些結果與有絲分裂II卵母細胞幾乎沒有自噬誘導的結果是一致的[14]。但是，在卵巢卵泡發育的各個階段，顆粒細胞中LC3表達均呈強陽性，表明自噬主要發生在顆粒細胞中，顆粒細胞為卵泡閉鎖過程中凋亡性細胞死亡的主要靶細胞，自噬性細胞死亡也可能參與卵泡閉鎖的過程。

為了證實上面的假設，我們運用體外腹腔注射PMSG誘導昆明小鼠卵泡發育和閉鎖的模型，檢測自噬是否與顆粒細胞凋亡具有相關性[15]。Cleaved caspase-3作為評價顆粒細胞凋亡的指標，本研究發現在PMSG注射后第1、2天其蛋白水平下降，第3、4、5天其蛋白水平增加。LC3-II的表達與cleaved caspase-3的蛋白表達趨勢一樣，具有明顯相關性。這些結果顯示誘導自噬與顆粒細胞凋亡和卵巢卵泡閉鎖密切相關的。

Figure 4. The protein levels of cleaved caspase-3 and LC3-II in cultured mouse granulosa cells after incubation under serum-free conditions in the absence or presence of FSH. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFSH (-).

圖4體外培養的顆粒細胞去血清和FSH處理后cleavedcaspase-3和LC3-II的蛋白水平變化

Figure 5. The immunofluorescence images of the granulosa cells cultured in serum-free with or without FSH conditions (×200).

圖5體外培養的顆粒細胞去血清和FSH處理后LC3蛋白的免疫熒光圖像觀察

本研究通過分析卵巢組織LC3和cleaved caspase-3的共定位情況，檢測顆粒細胞自噬和卵泡閉鎖之間的關系。由于小卵泡不同發育階段包括原始卵泡，初級卵泡和有腔卵泡。在原始卵泡，初級卵泡和有腔卵泡顆粒細胞中cleaved caspase-3表達均為陰性，因此不能確定cleaved caspase-3和LC3共定位。然而，在閉鎖卵泡中，本研究結果表明在閉鎖的早期和中期有腔卵泡中可見cleaved caspase-3 陽性顆粒的細胞同時出現了LC3表達陽性和聚集的LC3免疫反應。但是在健康竇狀卵泡中，cleaved caspase-3蛋白呈陰性，LC3表達呈弱陽性并且部分呈分散分布。上述這些結果初步顯示顆粒細胞自噬可能直接參與了卵巢卵泡發育的各個階段中的卵泡閉鎖過程。

有研究顯示顆粒細胞凋亡受促性腺激素影響。本研究在體實驗腹腔注射PMSG后早期(第1、2天)LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平降低，隨著體內對PMSG的代謝， PMSG注射后晚期(第3、4、5天)由于凋亡的誘導，LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平依次升高，說明顆粒細胞自噬與凋亡一樣是呈促性腺激素依賴的。為了證明上面的結果，本研究設計了體外顆粒細胞培養系統，添加FSH培養24 h后，顯示顆粒細胞自噬呈促性腺激素依賴性，LC3-II蛋白質定位在胞漿中，圍繞胞核呈同心圓樣點狀表達。

Rodrigues等[16]對新出生小鼠研究, 發現其卵母細胞中溶酶體數量增多, 只有少數生殖細胞凋亡。提示自噬可能是引起出生后生殖細胞死亡的重要機制, 而不是凋亡。青春期前大鼠閉鎖卵泡卵母細胞死亡的過程，從自噬到凋亡, 直至兩者共同作用導致細胞死亡。來源于新生大鼠的卵母細胞主要經歷凋亡(活化的caspase-3和TUNEL反應陽性), 而在5、10、25、28 d雌性大鼠的閉鎖卵泡中, 發現大部分卵母細胞具有局部性凋亡和自噬標記物的表達, 并且自噬標記物Lamp1和酸性磷酸酶強烈表達。Escobar等[17]假設, 卵母細胞死亡可能最初起始于線粒體等細胞器的自噬降解, 之后促進了caspases的活化，由此導致了DNA片段化，且不伴隨核濃縮。Gonzales-Polo等[18]也證實自噬體的形成在凋亡之前，且這兩條通路之間存在交叉性。

本研究中LC3在小鼠顆粒細胞中的表達定位和特點，提示他們可能直接或間接地影響卵泡顆粒細胞的分化和凋亡，并進一步影響卵泡的發育和閉鎖過程，但要完全闡明LC3在雌性卵巢卵泡發育和閉鎖中的相關機制仍需作進一步的研究。

綜上所述，在小鼠卵泡發育過程中，LC3蛋白主要在小鼠顆粒細胞中表達，并且顆粒細胞自噬的表達模式與顆粒細胞凋亡的表達模式密切相關。在體和體外卵巢顆粒細胞自噬和凋亡均呈促性腺激素依賴性。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

LC3 protein expression and localization in mouse follicular granulosa cells

GUO Yan-jun, XU Ying, LIU Sheng-bing, HOU Jie, YE Xian-cai, WANG Zhi-jian, SHEN Zhong-fei

(College of Medicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001,China. E-mail: shzhmy169@vip.sina.com)

AIM: To investigate the expression and localization of autophagy related protein microtublule associated protein 1 light chain 3 (LC3) at various stages of follicular development and atresia in the mice.METHODS: On 0,1,2,3,4 and 5 day after intraperitoneal injection of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG), expression and positioning situation of autophagy related protein LC3 and apoptosis related protein cleaved caspase-3 were examined by the me-thod of immunohistochemical staining. The protein levels of cleaved caspase-3 and LC3 were determined by Western blot in cultured mouse granulosa cells after incubation under serum-free conditions in the absence or presence of FSH. LC3 subcellular localization in granulosa cells were studied by the method of immunofluorescence.RESULTS: The LC3 protein expressed in granulosa cells during all developmental stages mainly. Granulosa cells of atretic follicles that showed intense staining of cleaved caspase-3 and LC3. The protein levels of cleaved caspase-3 and LC3-II in the granulosa cells significantly decreased at 1 d and 2 d after intraperitoneal injection of PMSG (P<0.05). The protein levels of cleaved caspase-3 and LC3-II in the granulosa cells increased in turn on 3, 4 and 5 day after intraperitoneal injection of PMSG. The positive correlation between LC3-II and cleaved caspase-3 protein levels was observed (r2=0.8299,P<0.05). The LC3-II protein expressed with punctuate structures in granulosa cell cytoplasm cultured under serum-free conditions in the presence of FSH.CONCLUSION: LC3 is expressed in the follicular granulosa cells with cell specificity and regional specificity. Autophagy is induced mainly in granulosa cells during folliculogenesis and shows positive correlation with apoptosis. Ovarian granulosa cell autophagy and apoptosis are gonadotropic hormone dependent.

Granulosa cells; Microtubule associated protein 1 light chain 3; Cleaved caspase-3; Follicular development

1000- 4718(2017)09- 1690- 06

2017- 01- 12 [

] 2017- 04- 13

浙江省教育廳科研項目資助(No. Y201534052)；浙江省實驗動物科技計劃項目(No. 2017C37173)

R339.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.025

△通訊作者 Tel: 0573-83643850； E-mail: shzhmy169@vip.sina.com