漢防己甲素對人鼻咽癌CNE1和CNE2細胞株的放療增敏作用*

王 君， 常利紅， 李 霞， 陳賢珍， 吳喜福， 王志遠， 黃子真， 黃健聰， 張革化

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510630)

漢防己甲素對人鼻咽癌CNE1和CNE2細胞株的放療增敏作用*

王 君， 常利紅， 李 霞， 陳賢珍， 吳喜福， 王志遠， 黃子真， 黃健聰， 張革化△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討最大非毒性劑量漢防己甲素(tetrandrine，Tet)對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2的放療增敏機制。方法: 分別采用最大非毒性劑量Tet (對CNE1細胞為1.5 μmol/L；對CNE2細胞為1.8 μmol/L)、4 Gy放療和最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療處理 CNE1和CNE2細胞；流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期分布，Western blot 檢測各組細胞γ-H2AX、cleaved caspase-3、p-CDC25C、CDK1、p-CDK1、cyclin B1、ERK和p-ERK的蛋白水平。結(jié)果: 最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療后可上調(diào)CNE1和CNE2細胞中γ-H2AX的表達。放療組CNE1和CNE2細胞G2/M期的比例分別為(18.09±0.42)%和(18.48±1.32)%，聯(lián)合處理組CNE1和CNE2細胞G2/M期的比例降為(15.88±1.04)%和(13.80±0.82)%，與放療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合處理可增加放療所致的cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)。不同濃度Tet處理CNE1和CNE2細胞后，p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平隨Tet濃度增加而升高(P<0.05)，CDK1的表達無明顯改變；最大非毒性劑量Tet不影響p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1和CNE2細胞中，聯(lián)合處理可明顯降低放療引起的p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平(P<0.05)，上調(diào)放療后cyclin B1的表達，而對總CDK1的表達無明顯調(diào)節(jié)作用；聯(lián)合處理可顯著抑制放療所致的p-ERK 蛋白水平(P<0.05)。結(jié)論: 最大非毒性劑量Tet可以增加放療引起的CNE1和CNE2細胞的DNA斷裂及細胞凋亡，其放療增敏的機制可能與Tet調(diào)控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路、去除放療導(dǎo)致的G2/M期阻滯有關(guān)。

漢防己甲素； 鼻咽癌； G2/M期阻滯； ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路 [

鼻咽癌是我國華南地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，在中國南方地區(qū)頭頸部惡性腫瘤中占首位，其在中國南方發(fā)病率已達(15～40)/10萬人次[1]，其中，廣東省男性發(fā)病率達30/10萬人次，女性達13/10萬人次[2]。由于鼻咽的解剖位置隱蔽、解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且病理特征以未分化型非角化性為主，因此放射治療一直是鼻咽癌的重要治療手段。對于I期和 IIA期的鼻咽癌患者，單純放療后5年總體生存率可達80%以上[3]。然而由于鼻咽癌早期癥狀不顯著，臨床上初診患者中約有60%已達局部晚期，約5%～8%的患者已伴隨遠處轉(zhuǎn)移[4]。同時約20%的患者在單純放療后仍出現(xiàn)局部惡化[5]。目前，同步放化療是針對晚期鼻咽癌患者的主要治療手段，但其在提高5年生存率的同時，也增加了治療的毒副作用，降低患者的生存質(zhì)量[6]。因此，尋找有效且安全的放療增敏劑對于鼻咽癌的治療具有非常重要的意義。

漢防己甲素(tetrandrine，Tet)又稱粉防己堿，是從中草藥粉防己的根塊中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，分子式為C33H42N2O6。Tet為天然的非選擇性鈣離子通道阻滯劑，具有抗高血壓、抗炎和抗纖維化等作用，目前已在風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、單純硅肺等疾病中應(yīng)用于臨床[7]。在針對惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細胞瘤和食管癌等疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Tet可以抑制腫瘤細胞的生長，并且可以增加腫瘤細胞對放療的敏感性，促進腫瘤細胞的死亡[8-10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Tet針對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2的最大非毒性劑量分別為1.5 μmol/L和1.8 μmol/L，并針對最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對CNE1和CNE2細胞增殖的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)最大非毒性劑量Tet可以增強放療對CNE1和CNE2細胞增殖的抑制作用，增加CNE1和CNE2細胞對放療的敏感性[11]。本研究擬探討最大非毒性劑量Tet對人鼻咽癌細胞株放療增敏作用的機制。

材料和方法

1實驗材料

1.1細胞株 人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈。

1.2主要試劑 Tet購自中國浙江海正藥業(yè)；胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Invitrogen；胎牛血清購自Gibco；BCA蛋白定量試劑盒、細胞周期試劑盒、細胞和總蛋白提取試劑盒購自中國南京凱基生物科技發(fā)展公司；兔抗人γ-H2AX、caspase-3、cleaved caspase-3、ERK和p-ERK抗體購自CST；兔抗人cyclin B1、p-CDK1、p-CDC25C和小鼠抗人CDK1抗體購自Abcam；兔抗人GAPDH抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠IgG II抗購自Proteintec Group；Western blot發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2Tet的配制 取0.1775 g Tet溶解于1 mL 1 mol/L的HCl中，加入去離子水至5 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.5，配制成濃度為2 500 μmol/L的溶液，0.22 μm過濾后4 ℃避光保存。使用時加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。

2.3放射線照射 細胞培養(yǎng)皿常溫下覆蓋1.5 cm硅膠補償膜，采用西門子PRIMUS H型直線加速器的6 MV X線照射細胞，吸收劑量率為250 cGy/min，照射野為25 cm×25 cm，總照射劑量為4 Gy。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期CNE1和CNE2細胞，分為空白對照組、最大非毒性劑量Tet組、4 Gy放療組和4 Gy放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet(對CNE1細胞為1.5 μmol/L，對CNE2細胞為1.8 μmol/L)組。以每孔3×105細胞接種于6孔板，細胞貼壁后收集細胞并使用PBS漂洗2次，70%乙醇4 ℃固定過夜。碘化丙啶避光染色30 min，使用FACSCalibur流式細胞儀(BD)檢測各組細胞周期分布情況。

2.5Western blot實驗 取對數(shù)生長期CNE1和CNE2細胞，以每孔3×105細胞接種于6孔板，細胞貼壁后分別給予相應(yīng)濃度Tet或4 Gy處理，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組在放療1 h后加入最大非毒性劑量Tet。處理24 h后收集細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。取各組蛋白30 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%小牛血清白蛋白(BSA)封閉1.5 h， I 抗4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔或山羊抗鼠 II 抗，室溫孵育1.5 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑進行放射自顯影。使用ImageJ分析軟件對結(jié)果進行灰度分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

設(shè)3組平行實驗，結(jié)果以均數(shù)標±準差(mean±SD)表示。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對CNE1和CNE2細胞中γ-H2AX的影響

Western blot檢測4 Gy放療后及最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療處理后γ-H2AX表達情況，在CNE1細胞中，放療后γ-H2AX表達增加，放療聯(lián)合1.5 μmol/L Tet處理組中γ-H2AX表達增加更明顯，2組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。同樣在CNE2細胞中，放療組和放療聯(lián)合1.8 μmol/L Tet組γ-H2AX表達均增加，且放療聯(lián)合Tet組增加幅度更明顯(P<0.05)，見圖1B。這提示最大非毒性劑量Tet可以增強放療引起的γ-H2AX表達的上調(diào)。

Figure 1. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein level of γ-H2AX. A: the expression of γ-H2AX in the CNE1 cells; B: the expression of γ-H2AX in the CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖1不同處理后CNE1和CNE2細胞γ-H2AX的表達情況

2最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對CNE1和CNE2細胞的細胞周期的影響

流式細胞術(shù)分析CNE1和CNE2細胞給予放療或最大非毒性劑量Tet后細胞周期分布的變化情況。CNE1細胞對照組和最大非毒性劑量Tet處理組G2/M期所占比例分別為(7.81±0.16)%和(7.32±0.53)%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，放療組G2/M期細胞所占比例為(18.09±0.42)%，比對照組明顯增高(P<0.05)，放療聯(lián)合Tet組G2/M期細胞比例為(15.88±1.04)%，低于單純放療組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。

CNE2細胞對照組、最大非毒性劑量Tet處理組、放療組和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組G2/M期所占比例分別為(8.69±0.97)%、(8.57±2.13)%、(18.48±1.97)%和(13.80±2.82)%。對照組和最大非毒性Tet處理組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，放療組在G2/M期出現(xiàn)明顯的阻滯，比例顯著高于對照組和Tet組(P<0.05)，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組G2/M期細胞比例比放療組降低(P<0.05)，見圖2B。這提示最大非毒性劑量Tet可以去除放療引起的G2/M期阻滯。

3最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對CNE1和CNE2細胞cleavedcaspase-3表達的影響

CNE1和CNE2細胞中caspase-3的激活狀態(tài)(cleaved caspase-3)具有相同的變化趨勢。對CNE1細胞及CNE2細胞分別給予1.5 μmol/L和1.8 μmol/LTet處理后，cleaved caspase-3的蛋白水平與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；給予放療處理后，CNE1和CNE2細胞中的cleaved caspase-3蛋白水平增加；而在放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理后，cleaved caspase-3的蛋白水平增加更明顯(P<0.05)，見圖3。這提示放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet可以增強放療對caspase-3的激活作用。

Figure 2. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the cell cycle distribution. A: the distribution of cell cycle in CNE1 cells after different treatments; B: the distribution of cell cycle in CNE1 cells after different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and Tet group；#P<0.05vs4 Gy group.

圖2不同處理對CNE1和CNE2細胞的細胞周期的影響

4最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對CDC25C/CDK1/cyclinB1通路蛋白表達的影響

對CNE1和CNE2細胞給予不同濃度的Tet處理24 h后，Western blot檢測p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1細胞中，予0.75 μmol/L和1.5 μmol/L Tet處理組的p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，3.0 μmol/L和6.0 μmol/L Tet處理組的p-CDC25C和p-CDK1蛋白水平與對照組相比有增加(P<0.05)，CDK1表達無明顯改變，見圖4A。在CNE2細胞中，0.9 μmol/L和1.8 μmol/L Tet處理后p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，3.6 μmol/L和7.2 μmol/L Tet處理后p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平與對照組相比明顯增加(P<0.05)，而各濃度Tet處理后CDK1的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4B。

Figure 3. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein levels of cleaved caspase-3 and caspase-3 in CNE1 (A) and CNE2 (B) cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖3不同處理后CNE1和CNE2細胞中cleavedcaspase-3和caspase-3的表達

對CNE1和CNE2細胞分別給予放療和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理，處理后24 h提取各組蛋白，Western blot檢測各組p-CDC25C、p-CDK1、CDK1和cyclin B1的蛋白水平。CNE1和CNE2細胞中各蛋白水平改變的趨勢相同。放療處理后，p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而cyclin B1的表達無明顯改變。放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組中p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平較放療組降低(P<0.05)，cyclin B1的表達較放療組明顯增加(P<0.05)，而CDK1的表達與放療組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4C、D。

5最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對ERK磷酸化的影響

在CNE1細胞中，p-ERK的蛋白水平在對照組和最大非毒性劑量Tet處理組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，放療組的p-ERK蛋白水平顯著增加(P<0.05)，而放療聯(lián)合最大非毒性Tet組的p-ERK蛋白水平較放療組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5A。在CNE2細胞中，p-ERK蛋白水平的改變具有同樣的趨勢，見圖5B。

討 論

放療是鼻咽癌治療的重要手段，然而腫瘤組織對放療的抵抗性會顯著影響放療的治療效果。目前Tet已被證實對食管癌、神經(jīng)母細胞瘤等疾病具有放療增敏的作用，但這些研究使用的Tet劑量仍具有細胞毒性殺傷作用，聯(lián)合放療會增加治療的毒副作用。我們前期研究確定了Tet針對CNE1和CNE2細胞的最大非毒性劑量，并發(fā)現(xiàn)該劑量可以增加CNE1和CNE2細胞對放療的敏感性，增加放療對細胞增殖的抑制作用，但增敏機制尚未明確。

放療殺傷腫瘤細胞最主要的生物學(xué)效應(yīng)是DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)[12]。H2AX是組蛋白H2A家族成員之一，其C端存在一段由22個氨基酸殘基構(gòu)成的高度保守同源序列，其中包括139位的絲氨酸殘基，在細胞發(fā)生DSBs時被磷酸化，稱為γ-H2AX。由于γ-H2AX與DSBs關(guān)系密切，且沒有細胞特異性，因此γ-H2AX被認為是檢測DSBs的特異性指標[13]。本研究檢測了單純放療和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet對γ-H2AX表達的影響，發(fā)現(xiàn)最大非毒性劑量Tet可以上調(diào)放療引起的γ-H2AX表達的增加，提示最大非毒性劑量Tet可以促進放療引起的DSBs。

DNA損傷后，細胞周期監(jiān)測位點被激活，阻滯細胞周期進程，促使細胞進行DNA修復(fù)。若修復(fù)失敗，細胞攜帶損傷的DNA進入DNA復(fù)制過程，將會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生凋亡[14]。細胞周期檢測位點包括G1/S位點和G2/M位點，若攜帶DNA損傷的細胞通過了G1/S位點，則G2/M位點成為DNA修復(fù)的最后時期，因此G2/M期是放療后細胞周期進程的關(guān)鍵位點。關(guān)于乳腺癌和結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，去除G2/M期阻滯可增加腫瘤細胞對放療的敏感性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CNE1和CNE2細胞中G2/M期細胞所占比例在放療后明顯增加，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后，CNE1和CNE2細胞中G2/M期細胞比例下降，提示放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet可以降低放療導(dǎo)致的G2/M期阻滯，可能為最大非毒性Tet放療增敏的機制之一。

Figure 4. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways. A: the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways in the CNE1 cells after treatment with different doses of Tet; B: the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways in the CNE2 cells after treatment with different doses of Tet; C: the related protein levels in CNE1 cells after Tet treatment combined with irradiation; D: the related protein levels in CNE2 cells after Tet treatment combined with irradiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (0 μmol/L Tet);#P<0.05vs4Gy group.

圖4不同處理后CNE1和CNE2細胞中CDC25C/CDK1/cyclinB1通路蛋白的表達情況

細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中具有重要的意義。Caspase家族為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡重要的介導(dǎo)因子與執(zhí)行因子，其中caspase-3處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，是凋亡最重要的執(zhí)行因子之一[17]。正常情況下，caspase-3以無活性的酶原形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞接受凋亡啟動信號后，caspase-3被上游因子剪切為cleaved caspase-3從而激活，進而誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生凋亡[18]。Caspase-3的活化提示細胞發(fā)生不可逆的凋亡[19]。多項研究表明，活化caspase-3可以促進多種瘤細胞的凋亡[20-22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，放療后CNE1和CNE2細胞中cleaved caspase-3的水平增加，最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療后，cleaved caspase-3的水平增加更顯著，提示最大非毒性劑量Tet可以增強放療對caspase-3的活化作用，促進細胞的凋亡，從而達到放療增敏的作用。

Figure 5. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein level of p-ERK. A: the protein levels of p-ERK and ERK in the CNE1 cells; B: the protein levels of p-ERK and ERK in the CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖5不同處理后CNE1和CNE2細胞中p-ERK和ERK的表達情況

G2/M期進程由CDK1/cyclin B1復(fù)合體進行調(diào)節(jié)。CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活需要去磷酸化的CDK1與cyclin B1進行結(jié)合，當(dāng)CDK1的Tyr15位點處于磷酸化狀態(tài)時，CDK1/cyclin B1復(fù)合體處于非激活狀態(tài)，從而產(chǎn)生G2/M期阻滯[23]。CDC25C可以去除CDK1 Tyr15位點的磷酸化，從而激活CDK1/cyclin B1復(fù)合體，促使G2/M期阻滯的去除。細胞周期未啟動時，CDC25C處于非活性狀態(tài)，其Ser216位點被磷酸化，在細胞周期通過G2/M期前，CDC25C Ser216位點發(fā)生去磷酸化，去磷酸化的CDC25C進一步激活CDK1/cyclin B1復(fù)合體，從而使細胞DNA復(fù)制進程通過G2/M期[24]。我們給予CNE1和CNE2不同濃度的Tet處理，發(fā)現(xiàn)濃度小于等于最大非毒性劑量的Tet并不影響p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的水平，而濃度大于最大非毒性劑量的Tet會上調(diào)p-CDC25和p-CDK1的水平，并且上調(diào)幅度隨濃度增加而增加，但不影響CDK1細胞的表達。提示我們在研究中使用的最大非毒性劑量Tet不影響CNE1和CNE2細胞的G2/M期進程，而大劑量的Tet可以抑制CDC25C/CDK1/cyclin B1通路的激活。與單純放療相比較，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理后， CNE1和CNE2細胞中p-CDK1的蛋白水平降低，而CDK1無明顯改變，cyclin B1表達增加，提示最大非毒性劑量Tet通過增加去磷酸化狀態(tài)CDK1的比例以及上調(diào)cyclin B1的表達促使放療后CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后p-CDC25C的蛋白水平降低，提示Tet對CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活作用可能與Tet促進CDC25C去磷酸化有關(guān)。

ERK為MAPK家族的一員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。ERK可以調(diào)節(jié)多種信號因子的磷酸化作用，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖和凋亡[25]。ERK對G2/M期進程所起的作用仍有爭議。Lee等[26]的研究發(fā)現(xiàn)棕矢車菊素可以促進ERK的磷酸化，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞G2/M期阻滯。而在人白血病細胞中，ERK的抑制劑可以增強PTX-2引起的G2/M期阻滯[27]。在本研究中，與單純放療相比，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后，p-ERK的蛋白水平顯著降低，而ERK的表達無明顯變化，提示最大非毒性劑量Tet抑制了ERK的磷酸化，其去除G2/M期阻滯的機制可能與其抑制上游負調(diào)控因子ERK的激活有關(guān)。

綜上所述，最大非毒性劑量Tet可以增加放療引起的CNE1和CNE2細胞的DNA斷裂，并通過調(diào)控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路，去除放療引起的G2/M期阻滯，進而促進細胞的凋亡，從而達到其對人鼻咽癌細胞放療增敏的目的。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[2] 中國抗癌協(xié)會頭頸腫瘤專業(yè)委員會, 中國抗癌協(xié)會放射腫瘤專業(yè)委員會. 頭頸部腫瘤綜合治療專家共識[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2010, 45(7):535-541.

[3] Xiao W, Han F, Lu T, et al. Treatment outcomes after radiotherapy alone for patients with early-stage nasopharyngeal carcinoma[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2009, 74(4):1070-1076.

[4] Liang Z, Zhu X, Li L, et al. Concurrent chemoradiotherapy followed by adjuvant chemotherapy compared with concurrent chemoradiotherapy alone for the treatment of locally advanced nasopharyngeal carcinoma: a retrospective controlled study[J]. Curr Oncol, 2014, 21(3):e408-e417.

[5] Suarez C, Rodrigo JP, Rinaldo A, et al. Current treatment options for recurrent nasopharyngeal cancer[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2010, 267(12):1811-1824.

[6] Yu H, Wang X, Song A, et al. Concurrent chemoradiotherapy versus radiotherapy alone for locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(8):3961-3965.

[7] Liu T, Liu X, Li W. Tetrandrine, a Chinese plant-derived alkaloid, is a potential candidate for cancer chemotherapy[J]. Oncotarget, 2016, 7(26)：40800-40815.

[8] Chang KH, Chen ML, Chen HC, et al. Enhancement of radiosensitivity in human glioblastoma U138MG cells by tetrandrine[J]. Neoplasma, 1999, 46(3):196-200.

[9] Chen Y, Chen JC, Tseng SH. Effects of tetrandrine plus radiation on neuroblastoma cells[J]. Anticancer Res, 2009, 29(8):3163-3171.

[10] Yu J, Liu F, Sun M, et al. Enhancement of radiosensitivity and the potential mechanism on human esophageal carcinoma cells by tetrandrine[J]. Cancer Biothe Radiopharm, 2011, 26(4):437-442.

[11] 吳喜福， 張革化， 黎景佳， 等. 漢防己甲素對人鼻咽癌細胞株的放射增敏作用及其機制[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(12):2187-2191.

[12] Tarish FL, Schultz N, Tanoglidi A, et al. Castration radiosensitizes prostate cancer tissue by impairing DNA double-strand break repair[J]. Sci Transl Med, 2015, 7(312):312re31.

[13] Singh I, Ozturk N, Cordero J, et al. High mobility group protein-mediated transcription requires DNA damage mar-ker γ-H2AX[J]. Cell Res, 2015, 25(7):837-850.

[14] Deckbar D, Jeggo PA, Lobrich M. Understanding the li-mitations of radiation-induced cell cycle checkpoints[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2011, 46(4):271-283.

[15] Anastasov N, H?fig I, Vasconcellos IG, et al. Radiation resistance due to high expression of miR-21 and G2/M checkpoint arrest in breast cancer cells[J]. Radiat Oncol, 2012, 7:206.

[16] Yong KJ, Milenic DE, Baidoo KE, et al. Sensitization of tumor to212Pb radioimmunotherapy by gemcitabine involves initial abrogation of G2 arrest and blocked DNA damage repair by interference with Rad51[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2013, 85(4):1119-1126.

[17] Shalini S, Dorstyn L, Dawar S, et al. Old, new and emerging functions of caspases[J]. Cell Death Differ, 2015, 22(4):526-539.

[18] Parrish AB, Freel CD, Kornbluth S. Cellular mechanisms controlling caspase activation and function[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013, 5(6): a008672.

[19] Bratton SB, MacFarlane M, Cain K, et al. Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress induced apoptosis[J]. Exp Cell Res, 2000, 256(1):27-33.

[20] 方 勇, 吳金民, 潘宏銘. Caspase-3抑制劑抑制長春堿誘導(dǎo)的人乳腺癌細胞凋亡及IκΒ-α降解[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(2):215-219.

[21] 胡明珠, 李 磊, 曹 蕾, 等. PXD101誘導(dǎo)人前列腺癌細胞PC3凋亡的線粒體信號通路[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(5):793-797.

[22] 邵軍良, 韓明芳, 黎運呈. 桂皮酸聯(lián)合順鉑對人肝癌MHCC97細胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7):1219-1224.

[23] Stolz A, Ertych N, Bastians H. Tumor suppressor CHK2: regulator of DNA damage response and mediator of chromosomal stability[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(3):401-405.

[24] Bartek J, Lukas J. DNA damage checkpoints: from initiation to recovery or adaptation[J]. Curr Opin Cell Biol, 2007, 19(2):238-245.

[25] Samatar AA, Poulikakos PI. Targeting RAS-ERK signalling in cancer: promises and challenges[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(12):928-942.

[26] Lee JG, Kim JH, Ahn JH, et al. Jaceosidin, isolated from dietary mugwort (Artemisiaprinceps), induces G2/M cell cycle arrest by inactivating cdc25C-cdc2 via ATM-Chk1/2 activation[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 55:214-221.

[27] Moon DO, Kim MO, Kang SH, et al. Induction of G2/M arrest, endoreduplication, and apoptosis by actin depolymerization agent pextenotoxin-2 in human leukemia cells, involving activation of ERK and JNK[J]. Biochem Pharmacol, 2008, 76(3):312-321.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of tetrandrine on radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells

WANG Jun, CHANG Li-hong, LI Xia, CHEN Xian-zhen, WU Xi-fu, WANG Zhi-yuan, HUANG Zi-zhen, HUANG Jian-cong, ZHANG Ge-hua

(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630, China. E-mail: gehuazh@hotmail.com)

AIM: To investigate the mechanism of the radiosensitizing effect of maximum non-cytotoxic doses of tetrandrine (Tet) on nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE1 and CNE2.METHODS: The cells were treated with ma-ximum non-cytotoxic doses of Tet (for CNE1 cells at 1.5 μmol/L and for CNE2 cells at 1.8 μmol/L), irradiation at 4 Gy, or combination of irradiation and maximum non-cytotoxic doses of Tet. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. The protein levels of γ-H2AX, cleaved caspase-3, p-CDC25C, CDK1, p-CDK1， cyclin B1, ERK and p-ERK were determined by Western blot.RESULTS: The expression of γ-H2AX was increased in CNE1 cells and CNE2 cells after combined treatment with irradiation and maximum non-cytotoxic doses of Tet. The percentages of CNE1 cells and CNE2 cells at G2/M phase in irradiation group were (18.09±0.42)% and (18.48±1.32)%, respectively, which were decreased to (15.88±1.04)% and (13.80±0.82)% in combined treatment group, respectively (P<0.05). Combined treatment enhanced the increase in the protein level of cleaved caspase-3 caused by irradiation. The protein levels of p-CDC25C and p-CDK1 were increased in a dose-dependent manner by Tet treatment (P<0.05), while the expression of CDK1 showed no difference among different doses of Tet treatments. The protein levels of p-CDC25C, p-CDK1 and CDK1 showed no difference after the treatment with maximum non-cytotoxic doses of Tet. The combined treatment with irradiation and the maximum non-cytotoxic doses of Tet decreased the protein levels of p-CDC25C and p-CDK1 (P<0.05), increased the expression of cyclin B1, and had no influence on the expression of CDK1 (P<0.05). The combined treatment resulted in an increase in the protein level of p-ERK1 (P<0.05).CONCLUSION: The maximum non-cytotoxic doses of Tet enhance the DNA damage and apoptosis in CNE1 cells and CNE2 cells caused by irradiation, and the mechanism might be associated with ending of G2/M arrest via activation of ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways.

Tetrandrine; Nasopharyngeal carcinoma; G2/M phase arrest; ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways

1000- 4718(2017)09- 1611- 08

2017- 01- 26 [

] 2017- 06- 18

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2014A030313142)； 廣州市科技計劃對外科技合作專項(No. 2013J4500013)；廣州市天河區(qū)科技計劃項目醫(yī)療衛(wèi)生專項(No. 2013KW027)

] R762； R965； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.013

△通訊作者 Tel： 020-85253045； E-mail： gehuazh@hotmail.com