藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠體內EPCs動員及損傷血管的再內皮化*

楊維華， 張清芬， 王 剛， 周敬群△

(1三峽大學附屬仁和醫院心血管內科，湖北 宜昌 443001； 2武漢大學中南醫院心血管內科，湖北 武漢 430000)

藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠體內EPCs動員及損傷血管的再內皮化*

楊維華1， 張清芬1， 王 剛2， 周敬群1△

(1三峽大學附屬仁和醫院心血管內科，湖北 宜昌 443001；2武漢大學中南醫院心血管內科，湖北 武漢 430000)

目的： 研究藏紅花素對頸動脈損傷小鼠外周血中內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)動員的影響及其作用機制。方法: 利用導絲損傷的方法構建C57BL/6小鼠頸動脈損傷模型，動物分為假手術組(sham組)、生理鹽水處理模型組(model組)和藏紅花素低、中、高劑量(10、50和100 μmol·kg-1·L-1)處理組。在3 d時，利用流式細胞術檢測各組頸動脈損傷小鼠體內外周血中EPCs動員情況；7 d時，利用酶聯免疫吸附法檢測各組頸動脈損傷小鼠外周血血清中促血管修復因子——血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質細胞衍生因子1(stromal-derived factor-1, SDF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的含量變化；14 d時，利用依文思藍和蘇木精-伊紅染色分別檢測各組頸動脈損傷小鼠損傷血管再內皮化和內膜增生情況；同時采用real-time PCR檢測各組頸動脈損傷小鼠損傷段血管中促修復因子相關受體——血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4, CXCR4)、堿性成纖維細胞生長因子受體(basic fibroblast growth factor receptor, bFGFR)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的mRNA表達水平。結果: 與sham組相比，model組頸動脈損傷小鼠外周血中EPCs動員量和促血管修復因子VEGF、SDF-1、bFGF、EGF、MMP-9的含量上升(P<0.05)；損傷血管再內皮化面積下降而增生內膜面積和增生內膜與中層膜面積比顯著升高(P<0.05)；損傷段血管中促修復因子相關受體VEGFR-2、CXCR4、bFGFR和EGFR的表達水平亦上升(P<0.05)。而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理組頸動脈損傷小鼠外周血中EPCs動員量和促血管修復因子VEGF、SDF-1、bFGF、EGF、MMP-9含量均顯著上升(P<0.05)；損傷血管再內皮化面積逐漸上升而增生內膜面積和增生內膜與中層膜面積比逐漸下降(P<0.05)；損傷段血管中促修復因子相關受體基因VEGFR-2、CXCR4、bFGF-R和EGFR的表達水平隨之逐漸上升(P<0.05)。結論: 藏紅花素能夠促進頸動脈損傷小鼠體內EPCs細胞動員及損傷血管的再內皮化，從而對損傷血管發揮修復作用。

藏紅花素； 內皮祖細胞； 血管損傷； 細胞動員； 再內皮化； 血管修復

經皮冠狀動脈成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)是治療冠心病的主要手段之一，但由于PTCA術中易造成血管內皮損傷，從而影響相關心血管疾病的治愈和康復率[1]。同時其它因素所致的血管內皮損傷均容易導致粥樣斑塊的形成，是血管損傷性疾病發生、發展的重要病理生理基礎[2]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種能夠直接分化成內皮細胞的前體細胞，主要來源于骨髓、外周血等，能夠在血管損傷修復中發揮重要作用[3]。

藏紅花素(crocin, Cro)又名番紅花甙，屬于糖苷類，是從傳統中藥藏紅花中提取的主要有效活性成分之一[4]。近來研究表明藏紅花素具有舒經活絡、通經化瘀、散瘀開結、消腫止痛等功效，能夠全面提高人體免疫力，并改善心肌供血，明顯增加冠狀動脈的血流量[5]。藏紅花素可用于防治心血管以及衰老相關疾病，但目前關于藏紅花素能否促進血管內皮損傷修復的研究尚未見。因此，本研究利用導絲損傷C57BL/6小鼠頸動脈血管構建血管損傷模型，探討藏紅花素通過促進EPCs動員對損傷血管進行修復的機制。

材料和方法

1主要材料試劑

8周齡的SPF級健康雄性C57BL/6小鼠100只，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心[動物許可證號SCXK(鄂)2011-2014]，在本科室實驗室進行常規適應性飼養1周。

藏紅花素購自Sigma；FITC標記的單克隆兔抗鼠CD34和APC標記的單克隆兔抗鼠血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)流式細胞術抗體購自美國B&D公司；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質細胞衍生因子1(stromal-derived factor-1，SDF-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和基質金屬蛋白酶9(matrix me-talloproteinase-9, MMP-9) ELISA試劑盒購自北京博奧生物公司；依文思藍染色液和HE染色液購自北京鼎國生物公司；總RNA提取液、逆轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa。

2實驗方法

2.1頸動脈損傷小鼠模型的構建 按照參考文獻[6]中方法，利用導絲損傷C57BL/6小鼠頸總動脈建立頸動脈損傷模型。隨機選擇80只小鼠以0.3%的戊巴比妥腹腔注射麻醉。手術打開頸右側動脈鞘，在頸總動脈近心端和頸內動脈遠心端用絲線活結結扎阻斷血流，結扎頸外動脈遠心端，用醫用彈性導絲經頸外動脈插入頸總動脈，旋轉來回抽送3次，使頸總動脈內皮剝落。結扎頸外動脈穿刺段，松開結扎活結使血流恢復，縫合小鼠頸部切口。術后隨機挑選5只頸動脈損傷小鼠損傷段血管，切片后HE染色確保損傷段頸總動脈血管內皮細胞剝落，小鼠頸動脈損傷模型構建成功。

2.2小鼠分組處理 將構建成功的頸動脈損傷模型C57BL/6小鼠分成4組，每組20只。第1組每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水作為模型(model)組；其它3組分別尾靜脈注射低、中、高劑量(10、50和100 μmol·kg-1·L-1)的藏紅花素(每只0.2 mL)，分別為Cro-LD、Cro-MD和Cro-HD組；同時提前選擇20只C57BL/6小鼠作為假手術(sham)組(與模型組小鼠操作相同但不用導絲損傷頸動脈血管內皮細胞)。

2.3流式細胞術檢測各組小鼠中EPCs動員情況 各組小鼠連續處理3 d后，隨機選取5只，麻醉后手術經心臟取血約1 mL，用D-Hanks液同體積稀釋。加入1.5倍的Percol分離液，1 200×g，離心30 min，取中間細胞層，再用D-Hanks液洗滌。用M199細胞培養基重懸細胞分別加入FITC標記的單克隆抗鼠CD34和APC標記的單克隆抗鼠VEGFR-2流式抗體各10 μL，室溫避光孵育20 min后，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗滌1遍后，經BD cantoⅡ流式細胞儀檢測各組小鼠外周血中動員的EPCs細胞(CD34+/VEGFR-2+)含量。

2.4ELISA檢測各組小鼠血清中促血管修復因子 各組小鼠在連續處理7 d后，每組隨機選擇5只，按照上述方法麻醉，手術取心臟循環外周血于1 mL EP管中。不加肝素室溫靜置30 min，3 000×g離心20 min，取血清備用。按照參考文獻[7]方法并分別根據ELISA試劑盒說明，檢測各組頸動脈損傷小鼠外周血血清中血管損傷促修復相關因子VEGF、SDF-1、EGF、bFGF和MMP-9的含量變化。

2.5小鼠頸動脈損傷段血管再內皮化和內膜增生情況的檢測 各組小鼠連續處理14 d時，隨機選擇5只。麻醉后經過尾靜脈注射Evans blue 染液(25 mg/kg)。10 min后取小鼠損傷側頸總動脈近頸動脈分叉處血管約5 mm。切開小鼠頸總動脈可見未內皮化血管呈藍色，而再內皮化血管不著色。采用Lucia軟件測量染色血管和總血管面積，計算各組小鼠頸動脈損傷再內皮化情況=內皮化面積/損傷血管總面積。同時對所取血管切片后HE染色，血管HE染色增生內膜層為血管內皮膜層向管腔中延伸層，外膜層為松散結締組織層，中膜層為內膜和外膜層中間主要為彈性膜層，使用Olympus BX53在固定視野和放大倍數下拍照和Image-Pro Plus軟件自動區分血管增生內膜和中膜層并計算中膜和新生內膜面積，以評估血管內膜增生情況。

2.6Real-time PCR檢測小鼠頸動脈損傷段血管促修復因子相關受體mRNA的表達 各組小鼠在連續處理14 d時，每組隨機挑選5只。麻醉后處死，取頸動脈損傷段血管于勻漿器內研磨均勻，并加入1 mL的總RNA提取試劑提取各組小鼠損傷段血管的總RNA。每組取500 ng的總RNA按照逆轉錄方法反轉得到cDNA模板。分別根據小鼠促血管修復因子VEGF的受體VEGFR-2、SDF-1的受體CXCR4、EGF的受體EGFR、bFGF的受體bFGFR及內參照GAPDH的cDNA序列設計real-time PCR引物(由上海生工公司合成，具體序列見表1)。利用Bio-Rad的IQ5實時熒光定量RCR系統檢測各組小鼠頸動脈損傷段血管中促血管修復因子相關受體VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達情況。

表1 促血管修復因子相關受體的real-time PCR引物序列

3統計學處理

利用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。所有數據進行方差齊性分析后，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠體內EPCs動員

流式細胞術檢測發現藏紅花素可以顯著促進頸動脈損傷小鼠體內外周血中EPCs動員，結果見圖1。各組小鼠外周血中動員的EPCs能夠經CD34和VEGFR-2共同標記，而經藏紅花素處理組小鼠外周血中標記的EPCs動員量逐漸上升。經過統計發現，與sham組相比，model組頸動脈損傷小鼠生理鹽水處理后外周血中EPCs動員量有所上升(P<0.05)；而與model組相比，經不同濃度藏紅花素處理組頸動脈損傷小鼠外周血中動員的EPCs含量均上升更顯著(P<0.05)。

Figure 1. The effect of crocin on EPCs mobilization in peripheral blood of mice with carotid artery injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖1藏紅花素對頸動脈損傷小鼠體內外周血中EPCs動員的影響

2藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠血清中促血管修復因子水平

ELISA檢測發現不同濃度藏紅花素連續誘導處理7 d后能夠顯著促進頸動脈損傷小鼠血清中促血管修復因子VEGF、SDF-1、bFGF和EGF的含量。經過統計發現，與sham組相比，model組頸動脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF和EGF含量均有所上升(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理的頸動脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF和EGF含量逐漸上升，并具有一定濃度依賴效應(P<0.05)，見表2。

表2藏紅花素對頸動脈損傷小鼠外周血清中促血管修復因子含量的影響

Table 2. The effect of crocin on the content of vascular repair factors in peripheral blood of mice with carotid artery injury (ng/L. Mean±SD.n=5)

GroupVEGFSDF-1bFGFEGFMMP-9Sham22±684±894±946±523±6Model55±9*116±10*133±11*98±9*48±9*Cro-LD96±11#146±9#180±12#128±8#97±8#Cro-MD138±10#198±12#235±11#186±9#147±9#Cro-HD189±12#273±16#305±12#212±12#195±12#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

3藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠內皮化

通過伊文思藍染色檢測發現，模型組小鼠頸動脈損傷段再內皮化較少，而經過不同濃度藏紅花素處理14 d后，小鼠頸動脈損傷段再內皮化均逐漸增加。經過統計發現，與sham組相比，model組小鼠血管再內皮化面積顯著下降(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理組小鼠血管再內皮化面積逐漸上升(P<0.05)，見圖2。

4藏紅花素降低頸動脈損傷小鼠內膜增生

通過HE染色檢測發現不同濃度的藏紅花素能夠抑制頸動脈損傷小鼠損傷段血管內膜增生(紅色箭頭標示增生內膜層)。與sham組相比，model組小鼠頸動脈損傷后血管增生內膜面積和血管增生內膜與中層膜面積比顯著升高(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理后的小鼠頸動脈損傷后血管增生內膜面積和血管增生內膜與中層膜面積比均逐漸減少(P<0.05),見圖3。

5藏紅花素促進頸動脈損傷小鼠損傷段血管促修復因子相關受體基因的表達

Real-time PCR檢測發現藏紅花素能夠顯著促進頸動脈損傷小鼠損傷段血管促修復因子VEGF的受體VEGFR-2、SDF-1的受體CXCR4、EGF的受體EGFR和bFGF的受體bFGFR表達水平，見圖4。

Figure 2. The effect of crocin on vascular re-endothelialization in mice with carotid artery injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖2藏紅花素對頸動脈損傷小鼠血管再內皮化的影響

Figure 3. Effect of crocin on intimal hyperplasia in mice with carotid artery injury. A: HE staining (×200); B: vascular intimal hyperplasia area; C: vascular proliferation intima and media area ratio. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖3藏紅花素對頸動脈損傷小鼠血管內膜增生的影響

Figure 4. The effect of crocin on the mRNA expression of vascular repair factor-related receptors in the injured segments of carotid artery in mice. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖4藏紅花素對頸動脈損傷小鼠損傷段血管中促修復因子相關受體mRNA表達的影響

經過統計，與sham組相比，model組小鼠頸動脈損傷后損傷段血管中VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達水平均上升(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理后的小鼠頸動脈損傷段血管中VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達水平均顯著上升(P<0.05)。

討 論

血管損傷性疾病如動脈粥樣硬化等容易導致心力衰竭、肢體壞死、癱瘓等后果，是嚴重威脅人類健康的疾病[8]。同時臨床上廣泛開展PTCA治療冠心病，往往由于手術對血管內皮的損傷，容易發生冠狀動脈再狹窄現象，影響心血管疾病治療成功和康復率[9]。因此，如何促進血管內皮細胞修復和再生是治療血管損傷疾病的關鍵。研究表明[10]，當機體血管發生損傷時，可通過藥物刺激，使EPCs從骨髓動員到外周血中，并循環至血管損傷區域分化成內皮細胞對損傷血管進行修復[11]。同時研究發現通過促進EPCs動員并加快其從骨髓進入體循環到達損傷部位分化成內皮細胞，能夠利于抑制損傷血管的內膜增生、血栓形成，并降低血管再狹窄率[12]。藏紅花素是少見的水溶性的類胡蘿卜素，是傳統藏藥藏紅花的主要色素成分，具有多種活性作用[13]。研究表明藏紅花素除了抗腫瘤外，還發揮細胞保護作用，其主要藥理作用包括抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎癥等[14]。藏紅花素因其較好的水溶性和兼具的抗腫瘤、促進細胞保護的作用，成為研究最廣、最具應用前景的新藥物之一。最新研究揭示藏紅花素能夠促進骨髓造血干細胞集落形成，但關于其能否促進骨髓中EPCs動員，發揮血管損傷修復作用尚未知[15]。本研究中采用導絲損傷C57BL/6小鼠頸動脈構建血管損傷模型，利用不同濃度藏紅花素誘導處理后，流式細胞術檢測發現藏紅花素處理組小鼠外周血中CD34+和VEGFR+的EPCs動員量均顯著增加，并具有一定濃度效應，直接說明藏紅花素能夠促進頸動脈損傷小鼠體內EPCs從骨髓動員至外周血。

為進一步揭示藏紅花素能否發揮促進頸動脈損傷小鼠血管修復作用，本研究利用依文思藍染色法對藏紅花素誘導處理后的頸動脈損傷端血管，直接觀察血管內皮化修復情況。研究中發現藏紅花素能夠顯著增加損傷段頸動脈血管的再內皮化面積，說明藏紅花素對損傷血管再內皮化修復具有積極作用。臨床開展PTCA時，血管內支架植入及球囊擴張時會對血管內皮造成剝落損傷，而血管內皮損傷后容易發生增生性再狹窄現象[16]。而相關研究證實，損傷血管的再內皮化能夠抑制血管中膜平滑肌增殖造成的內膜增生情況[17]。本研究中不同濃度藏紅花素誘導處理頸動脈損傷小鼠后取出血管HE染色，檢測新生內膜面積、新生內膜與中膜層相對面積比來評價損傷血管內膜增生及修復情況。結果顯示藏紅花素處理組小鼠損傷段頸動脈血管新生內膜面積和內中膜面積比均逐漸降低，說明藏紅花素能夠有效抑制內皮損傷血管的內膜增生，并可能通過促進EPCs動員對血管損傷修復以維持血管功能。

但藏紅花素是如何促進EPCs動員發揮修復血管作用的呢？有研究表明SDF-1、bFGF、EGF、VEGF等細胞因子參與到血管的損傷修復中，它們通過促進EPCs細胞增殖、遷移、黏附至血管損傷處而誘導血管新生和修復[18]。VEGF是目前所知的最強的誘導血管損傷修復和血管生成因子，同時SDF-1、bFGF、EGF等因子均能夠促進血管內皮中VEGF的生成，并具有協同作用，在EPCs動員、分化中發揮作用[19]。MMP-9是作用于血管內皮細胞基質的主要膠原蛋白酶，研究認為其在血管細胞的增殖和遷移中發揮作用，同時可通過EPCs動員促進血管新生和損傷修復[20]。本研究中利用ELISA檢測發現不同濃度藏紅花素能夠顯著促進各組頸動脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復因子的含量并具有濃度效應，說明藏紅花素可通過促進外周血中VEGF、SDF-1、bFGE、EGF和MMP-9水平而發揮刺激EPCs動員修復損傷血管的作用。一般細胞因子在體內可通過旁分泌、自分泌或內分泌等方法發揮作用，本研究中經藏紅花素處理后的頸動脈損傷小鼠外周血中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9水平顯著上升，其可能來自損傷血管的自分泌，也可能來自其它受刺激細胞的旁分泌，但這些血管損傷促修復因子的具體來源需要進一步驗證分析。為了探究頸動脈損傷小鼠外周血血清中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復因子如何發揮作用，本研究同時檢測了各組小鼠損傷段血管促修復因子相關受體VEGFR-2、CXCR4、bFGFR和EGFR mRNA的表達水平，發現在不同濃度藏紅花素作用下，受體基因表達水平均隨之顯著上升，說明頸動脈損傷小鼠外周血中增加的VEGF、SDF-1、bFGF、EGF等因子可能循環至損傷血管處與其受體結合發揮作用。但關于藏紅花素具體對損傷血管發揮修復作用的分子機制和信號通路有必要進一步研究。

綜上所述，本研究首次發現傳統中藥藏紅花中有效成分藏紅花素能夠通過增加VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復因子水平，促進EPCs動員和血管再內皮化作用，進而對損傷血管進行修復。本研究對于臨床防治血管內皮損傷性心血管疾病具有重要指導價值。

[1] Gori T, Münzel T. Endothelial dysfunction after stenting and scaffolding of coronary arteries[J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2014, 58(1):175-181.

[2] 萬 強， 楊玉萍， 劉中勇. 丹參酮ⅡA通過抑制p38 MAPK通路減輕PM2.5對血管內皮細胞的損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(4):597-601.

[3] 崔 斌， 黃 嵐， 武曉靜， 等. 內皮祖細胞移植對血管內膜修復的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(4):625-628.

[4] 楊武韜. 中藥藏紅花的鑒別方法及有效成分的藥理作用[J]. 中國醫藥指南, 2014, 12(25):302-303.

[5] 吳 揚， 潘瑞蓉， 王玉琴. 藏紅花素對大鼠缺氧心肌的保護作用及其機制研究[J]. 中國循環雜志, 2011, 26(1):61-64.

[6] 代文靜， 張 軍， 周敬群， 等. 轉化生長因子-α 在小鼠頸動脈損傷血管修復中的作用[J]. 中國循環雜志, 2015, 30(4):384-389.

[7] 常鵬宇， 崔 爽， 姜 新， 等. 脂肪干細胞修復輻射誘導的腸血管損傷研究[J]. 中華放射醫學與防護雜志, 2014, 34(9):652-657.

[8] Riegler J, Liew A, Hynes SO, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of MSCs in vascular injury[J]. Biomaterials, 2013, 34(8):1987-1994.

[9] Moon HE, Byun K, Park HW, et al. COMP-Ang1 potentiates EPC treatment of ischemic brain injury by enhancing angiogenesis through activating AKT-mTOR pathway and promoting vascular migration through activating Tie2-FAK pathway[J]. Exp Neurobiol, 2015, 24(1):55-70.

[10] Ke X, Shu XR, Wu F, et al. Overexpression of the β2AR gene improves function and re-endothelialization capacity of EPCs after arterial injury in nude mice[J]. Stem Cell Res Ther, 2016, 7(1):1-9.

[11] Li X, Chen C, Wei L, et al. Exosomes derived from endothelial progenitor cells attenuate vascular repair and accelerate reendothelialization by enhancing endothelial function[J]. Cytotherapy, 2016, 18(2):253-262.

[12] Lacquaniti A, Giardina M, Lucisano S, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and endothelial progenitor cells (EPCs) evaluation in aortic aneurysm repair[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2013, 11(6):1001-1010.

[13] 吳 揚， 潘瑞蓉， 耿 鵬. 藏紅花素抗心肌細胞低氧損傷作用及其機制研究[J]. 中國應用生理學雜志, 2010, 26(4):453-457.

[14] 潘瑞蓉， 吳 揚， 耿 鵬， 等. 藏紅花素對大鼠心肌細胞缺氧損傷的保護作用[J]. 江蘇大學學報: 醫學版, 2011, 21(2):131-134.

[15] 丁雯雯. 藏紅花素對骨髓造血干/祖細胞集落形成的影響[D]. 青島: 青島大學, 2013.

[16] King TF, McDermott JH. Endothelial progenitor cells and cardiovascular disease[J]. J Stem Cell, 2014, 9(2):93-99.

[17] Bakogiannis C, Tousoulis D, Androulakis E, et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes[J]. Curr Med Chem, 2012, 19(16):2597-2604.

[18] Karazizi C, Onerup A, Larsson P, et al. The effect of exercise on angiogenic factors in the healthy mouse heart: a short report[J]. Exp Clin Cardiol, 2014, 20(1):2332-2341.

[19] Paczkowska E, Go b-Janowska M, Bajer-Czajkowska A, et al. Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with haemorrhagic and ischaemic stroke: the role of endothelin-1[J]. J Neurol Sci, 2013, 325(1-2):90-99.

[20] 李玉明， 李海濤， 王新芳， 等. ISO通過ADPRC、PI3K-Akt和FOXO3a上調MMP-9促進血管平滑肌細胞增殖與遷移[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(10):1801-1802.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Crocin promotes mobilization of EPCs and re-endothelialization of damaged blood vessels in mice with carotid artery injury

YANG Wei-hua1, ZHANG Qing-fen1, WANG Wang2, ZHOU Jing-qun1

(1Department of Cardiology, Affiliated Renhe Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443001, China;2Department of Cardiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430000, China. E-mail: zhoujingqun-1@medmail.com.cn)

AIM: To study the effect of crocin on the mobilization of endothelial progenitor cells (EPCs) in the peripheral blood of the mice with carotid arterial injury and its mechanism.METHODS: The carotid artery injury model of the C57BL/6 mice was established by the method of wire injury. The animals were divided into sham operation group, saline-treated model group， and low dose, medium dose and high dose (10, 50 and 100 μmol·kg-1·L-1， respectively) of crocin treatment groups. The mobilization of the EPCs in peripheral blood of the mice with carotid artery injury was detected by flow cytometry at 3 d. The changes of vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal-derived factor-1 (SDF-1), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in the peripheral blood of the mice with carotid artery injury were detected by enzyme-linked immunosorbent assay at 7 d. The vascular re-endothelialization and intimal hyperplasia of the mice with carotid artery injury were detected by Evans blue and hematoxylin-eosin staining. At the same time, real-time PCR was used to detect the mRNA expression of vascular repair factor-related receptors， vascular endothelial growth factor receotor-2 (VEGFR-2), CXC chemokine receptor-4 (CXCR4), basic fibroblast growth factor receptor (bFGFR) and epidermal growth factor receptor (EGFR)， in the injured segments of carotid arteries.RESULTS: Compared with sham group, the EPCs mobilization and the content of vascular repair factors VEGF, SDF-1, bFGF, EGF and MMP-9 in peripheral blood were increased in model group (P<0.05). The area of vascular endothelium was decreased， while the area of intimal hyperplasia and the ratio of intimal to medial membrane area were increased significantly (P<0.05). The expression levels of VEGFR-2, CXCR4, bFGFR and EGFR were also increased in the injured segments of carotid arteries (P<0.05). Compared with model group, the EPCs mobilization and the content of vascular repair factors VEGF, SDF-1, bFGF, EGF and MMP-9 in peripheral blood were significantly increased in different concentrations of crocin-treated mice with carotid artery injury (P<0.05). The area of vascular endothelium was gradually increased， while the area of intimal hyperplasia and the ratio of intimal to medial membrane area were gradually decreased (P<0.05). The expression levels of VEGFR-2, CXCR4, bFGFR and EGFR were also gradually increased in the injured segments of cartid arteries (P<0.05).CONCLUSION: Crocin promotes the mobilization of EPCs and the re-endothelialization of damaged blood vessels in the mice with carotid artery injury, thus repairing the injured vasculature.

Crocin; Endothelial progenitor cells; Vascular injury; Cell mobilization; Re-endothelialization; Vascular repair

1000- 4718(2017)09- 1574- 07

2016- 10- 19 [

] 2017- 05- 02

湖北省教育廳自然科學研究計劃重點項目(No. D20091308)

R285.5; R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.006

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