蜂膠醇提物通過抑制C/EBP同源蛋白表達減輕氧化低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞凋亡*

徐曉燕， 邵夏炎， 劉映雪， 李東軒， 焦 鵬， 郝 奇， 田 華， 姚樹桐△

(泰山醫學院 1藥學院， 2人口與計劃生育學院， 3基礎醫學院， 4動脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000)

蜂膠醇提物通過抑制C/EBP同源蛋白表達減輕氧化低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞凋亡*

徐曉燕1， 邵夏炎2▲， 劉映雪2， 李東軒3， 焦 鵬4， 郝 奇3， 田 華4， 姚樹桐3△

(泰山醫學院1藥學院，2人口與計劃生育學院，3基礎醫學院，4動脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000)

目的： 研究蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis，EEP)對氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導的血管內皮細胞凋亡的抑制作用，并探討可能的分子機制。方法: 體外培養人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，給予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA; 4 mmol/L)預處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM; 4 mg/L)繼續培養24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞活力和凋亡情況；試劑盒測定培養液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和細胞內caspase-3活性。分別采用Western blot和real-time PCR技術檢測內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關鍵蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和Bcl-2的表達變化。結果: 與ERS抑制劑PBA相似，EEP呈劑量依賴性地減輕ox-LDL所誘導的HUVECs損傷，表現為細胞活力增加(P<0.01或P<0.05)，LDH漏出、凋亡率和caspase-3活性降低(P<0.05或P<0.01)，且可抑制ERS誘導劑TM所致的HUVECs活力下降(P<0.05)，以及LDH漏出、細胞凋亡率和caspase-3活性增加(P<0.05或P<0.01)；與PBA相似，EEP可抑制ox-LDL所誘導的CHOP上調和Bcl-2下調(P<0.05或P<0.01)；另外，與TM組比較，EEP預處理組CHOP蛋白和mRNA表達上調也受到明顯抑制(P<0.05或P<0.01)。結論: EEP可減輕 ox-LDL 所誘導的HUVECs凋亡，其機制可能與抑制CHOP介導的ERS凋亡途徑有關。

蜂膠醇提物； C/EBP同源蛋白； 氧化低密度脂蛋白； 血管內皮細胞； 細胞凋亡

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎之一，而低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)增高是AS的重要危險因子，LDL經過氧化修飾成為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)則致AS作用更強[1]。血管內皮細胞凋亡和功能障礙是早期AS過程中的重要病理變化，血管內皮細胞結構受損、功能改變，使血液中脂質和單核細胞更易沉積在內皮下間隙進一步成為泡沫細胞，從而啟動粥樣斑塊的形成與發展，促進AS進程。大量研究表明，ox-LDL可通過多種途徑損傷血管內皮細胞，誘導其過度凋亡[2-4]。因此，干預ox-LDL對血管內皮細胞的促凋亡作用對阻止AS發展、降低心血管不良事件的發生率具有重要意義。蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂等與其上顎腺分泌物混合形成的膠狀物質，其中黃酮類、酚酸類等是其重要活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、抗AS等廣泛的生物學活性[5]。本實驗室的前期研究發現，蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis，EEP)能夠促進膽固醇逆向轉運，阻止AS發展，并可以通過抑制凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體介導的氧化應激，減輕ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷[6-8]，但EEP是否可以通過抑制C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)介導的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑減輕 ox-LDL 所誘導的血管內皮細胞凋亡，目前國內外尚未見報道。本工作通過研究EEP對 ox-LDL 所誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)CHOP表達和凋亡的影響，探討了EEP對ox-LDL所誘導的HUVECs凋亡的抑制作用及機制。

材料和方法

1試劑

HUVECs由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供；ox-LDL購自北京協生生物科技有限公司；DMEM高糖培養基和RIPA裂解液分別購自HyClone和Solarbio；衣霉素(tunicamycin，TM)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)和抗β-actin抗體購自Sigma；四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]和 Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒分別購自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗CHOP多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG分別為Cell Signaling Technology和北京中杉金橋公司產品；兔抗Bcl-2多克隆抗體購自Santa Cruz；增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和二氟化樹脂(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜分別為Pierce和Millipore產品；Trizol 試劑為 Invitrogen產品；cDNA 合成試劑盒和 RealMaster Mix (SYBR Green)試劑盒購自北京天根公司 ；Caspase-3和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定試劑盒分別購自碧云天生物和南京建成生物技術公司；其余試劑均為分析純產品。

2方法

2.1EEP制備和總黃酮測定 采集新鮮泰山松柏蜂膠，烘干、粉碎，按本室既往報道的方法[6]制備EEP。取100克蜂膠溶于1L 95%乙醇中，40 ℃超聲提取，共3次，每次3 h，合并3次上清液，50 ℃條件下經旋轉蒸發器減壓濃縮，烘箱中干燥得EEP。按照國家標準分光光度比色法(GB/T 20574-2006)測定EEP總黃酮含量，結果為(213.46±2.93) mg蘆丁當量(RE)/g。 以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制EEP母液，實驗時用細胞培養基稀釋成適當濃度。

2.2細胞培養與實驗分組 HUVECs用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于5% CO2培養箱中37 ℃培養。隨機分為：(1)正常對照(control)組：培養液中常規培養；(2)ox-LDL組：培養液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)EEP+ox-LDL組：培養液中先加入EEP(7.5、15和30 mg/L)預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)PBA(ERS抑制劑)+ox-LDL組：培養液中先加入4 mmol/L PBA預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(5)TM(ERS誘導劑)組：培養液中加入4 mg/L TM；(6)EEP+TM組：先給予30 mg/L EEP預處理1 h，再加入4 mg/L TM。除EEP預處理組和TM組外，其它各組均加入0.1%的DMSO，培養 24 h 收集細胞。

2.3細胞活力和LDH測定 接種于96孔板的細胞經處理后，按既往報道的MTT分析方法[9]檢測細胞活力。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其吸光度(A)值占對照組A值的百分比表示。同時按照LDH活性檢測試劑盒說明書測定各組培養基中LDH活性。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析細胞凋亡情況。細胞經處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作并上機檢測。細胞凋亡率由流式細胞儀分析測定。總細胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

2.5細胞內caspase-3活性的測定 按照試劑盒說明書操作，即細胞經處理后，收集并用PBS洗滌1次，以裂解液冰浴裂解15 min， 4 ℃條件下16 000 ×g離心15 min，采用Bradford法檢測上清液中蛋白濃度。在96孔板中將10 μL裂解上清液、80 μL反應緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃條件下孵育2 h。利用多功能酶標儀于405 nm處讀取吸光度(A)，通過相同條件下獲得的標準曲線計算出樣品中caspase-3活性，并以正常對照組細胞caspase-3活性為100%，其余各組細胞caspase-3活性以其占正常對照組的百分比表示。

2.6Western blot分析 按本室既往報道的方法[10]提取細胞總蛋白，等量的各組總蛋白經SDS-PAGE分離后電轉移至PVDF膜，經封閉、洗脫后與抗CHOP(1∶800)、Bcl-2(1∶400)抗體和抗β-actin(1∶6 000)單克隆抗體室溫孵育4 h，洗膜后與辣根過氧化物酶標記的相應II抗室溫孵育1 h。抗原-抗體復合物用ECL法顯示，應用化學發光成像儀進行圖像采集。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)值，以CHOPIA值/β-actinIA值的比值反映CHOP蛋白相對水平。

2.7Real-time PCR技術檢測CHOP的mRNA表達 收集細胞后，用Trizol一步法提取RNA。按試劑盒說明配制20 μL的反應體系， 37 ℃反應60 min，將mRNA逆轉錄為cDNA。按實時熒光定量 PCR 試劑盒說明書配制PCR反應體系為：2.5×RealMaster Mix/20×SYBR solution 4.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL及三蒸水1.5 μL，共10 μL。引物由上海生工生物技術公司合成，CHOP的上游引物序列為5’-CCACCACACCTGAAAGCAGAA-3’，下游引物序列為5’-GGTGCCCCCAATTTCATCT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CCTCCCGCTTCGCTCTCT-3’，下游引物序列為5’-GCTGGCGACGCAAAAGA-3’。在 Rotor-Gene Q熒光定量 PCR 儀上反應，條件為 94 ℃預變性15 min，然后進行40個循環：94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s。GAPDH作為內參照，根據2-ΔΔCt法分析CHOP mRNA的相對表達量，ΔΔCt=實驗組(Ct目的基因-Ct內參照基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內參基因)。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件分析數據，結果用均數±標準差(mean±SD) 來表示。多組數據比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1EEP抑制ox-LDL誘導的HUVECs活力降低和LDH漏出

MTT 結果顯示，ox-LDL 可使HUVECs活力顯著降低(P<0.01)；而以15 mg/L和30 mg/L EEP預處理HUVECs 1 h，細胞活力則明顯增加(P<0.05)，表明EEP 可以減輕ox-LDL 誘導的HUVECs活力降低；ERS抑制劑PBA也可減輕ox-LDL 誘導的HUVECs活力降低(P<0.05)，與EEP預處理組結果相似，見圖1A。

對培養液中LDH活性檢測結果顯示，與PBA相似， EEP可顯著抑制ox-LDL所致的LDH漏出(P<0.05)，見圖1B。

2EEP抑制TM誘導的HUVECs活力降低和LDH漏出

ERS誘導劑TM 可顯著誘導HUVECs損傷，表現為細胞活力降低(P<0.01)，LDH漏出增加(P<0.01)；而以EEP(30 mg/L)預處理HUVECs 1 h，可以明顯減輕TM 誘導的HUVECs活力降低和LDH漏出(P<0.05)，見圖2。

3EEP抑制ox-LDL誘導的HUVECs凋亡和caspase-3活化

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果顯示，ox-LDL 可使HUVECs總細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；與PBA預處理組相似，以7.5、15和30 mg/L EEP預處理HUVECs 1 h，可以減輕ox-LDL 誘導的細胞凋亡，尤其以30 mg/L EEP預處理組更為顯著(P<0.01)，見圖3A。

細胞內caspase-3活性測定結果顯示，ox-LDL可使caspase-3活性明顯增加，而EEP可以顯著降低ox-LDL 誘導的caspase-3活性增高(P<0.01)，與PBA預處理組相似，見圖3B。

Figure 1. EEP inhibited ox-LDL-induced decrease in the viability of HUVECs and LDH release. HUVECs were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or PBA (4 mmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. A: cell viability determined by MTT assay; B: LDH activity in the media. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖1EEP抑制ox-LDL所誘導的HUVECs活力降低和LDH漏出

4EEP抑制TM誘導的HUVECs凋亡和caspase-3活化

TM可使HUVECs總細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，caspase-3活性顯著上調(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預處理可以減輕TM所誘導的細胞凋亡和caspase-3活化(P<0.01)，見圖4。

5EEP抑制ox-LDL誘導的CHOP上調和Bcl-2下調

Western blot分析結果顯示，與對照組比較，ox-LDL可使CHOP蛋白水平顯著上調(P<0.01)，而降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05)；與PBA預處理相似，EEP預處理可明顯抑制ox-LDL所致的CHOP蛋白上調和Bcl-2下調(P<0.05)，見圖5A。

采用real-time PCR技術檢測細胞內CHOP的mRNA表達，結果與Western blot結果一致，EEP明顯抑制ox-LDL所誘導的CHOP的mRNA上調，以 30 mg/L EEP預處理組尤為顯著(P<0.01)，見圖5B。

Figure 2. EEP inhibited TM-induced decrease in the viability of HUVECs and LDH release. HUVECs were pretreated with EEP (30 mg/L) for 1 h and then treated with TM (4 mg/L) for 24 h. A: the cell viability determined by MTT assay; B: LDH activity in the media. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&P<0.05vsTM group.

圖2EEP抑制TM所誘導的HUVECs活力降低和LDH漏出

6EEP抑制TM誘導的CHOP上調

TM可在蛋白和mRNA水平均明顯上調CHOP表達(P<0.01)；而與TM組比較， EEP預處理組CHOP蛋白和mRNA的表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見圖6 。

討 論

AS是一種慢性進行性血管炎癥性疾病，作為心腦血管疾病的重要病理基礎嚴重危害人類健康。血管內皮細胞損傷及功能紊亂是AS發生發展的始動環節，而ox-LDL是導致內皮損傷的獨立危險因素，可降低細胞活力、誘導細胞凋亡并促進炎癥因子的表達，進而導致炎癥細胞浸潤、泡沫細胞形成及粥樣斑塊的形成和破裂[11]。因此減輕血管內皮細胞損傷被認為是AS防治的重要措施。本工作在ox-LDL誘導的HUVECs損傷模型上觀察到，EEP可明顯抑制細胞活力降低和LDH漏出，并顯著抑制ox-LDL 誘導的細胞凋亡及caspase-3活化，其作用與ERS抑制劑PBA相似。另外，在ERS誘導劑TM誘導的HUVECs損傷模型上也觀察到EEP類似的保護作用，提示EEP能夠抑制ox-LDL誘導的內皮細胞損傷，其機制可能與抑制ERS介導的凋亡途徑有關。

Figure 3. EEP inhibited ox-LDL-induced apoptosis of HUVECs. HUVECs were treated as described in Figure 1. A: the cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total (early- and late-stage) apoptotic cells were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI); B: caspase-3 activity was determined by colorimetric assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsox-LDL group.

圖3EEP抑制ox-LDL所誘導的HUVECs凋亡

內質網是真核細胞內蛋白合成和鈣穩態調控的重要細胞器，并參與脂質合成和氧化還原平衡的維持。在缺氧、氧化應激、膽固醇超負荷等致病因素的作用下，內質網功能紊亂，出現以未折疊和/或錯誤折疊蛋白積聚和鈣穩態失衡為主要特征的ERS反應。一定程度的ERS反應通過暫時性抑制蛋白合成，促進分子伴侶表達有利于維持內質網功能和細胞生存，但是過強或過久的應激則通過激活ERS相關凋亡途徑誘發細胞凋亡，導致不可逆損傷[12]。CHOP 又稱生長停滯和DNA損害誘導基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD153)，是介導ERS 相關凋亡途徑的關鍵分子之一[12]。大量研究表明，CHOP介導AS粥樣斑塊中巨噬細胞凋亡，并在AS易損斑塊的形成中具有重要作用，而CHOP缺陷可抑制巨噬細胞凋亡，縮小粥樣斑塊壞死面積[13-15]。本課題組前期工作[16-18]和文獻報道[19]表明，ox-LDL通過激活CHOP信號途徑誘導巨噬細胞凋亡，其機制與下調抗凋亡蛋白Bcl-2有關，而EEP和槲皮素通過抑制該信號途徑抑制巨噬細胞凋亡，表明CHOP介導的ERS相關凋亡途徑參加AS的發生發展，并有可能成為AS防治的重要靶點。來自內皮細胞的研究表明，CHOP介導ox-LDL所誘導的細胞凋亡[20-21]，而本實驗結果顯示，與ERS抑制劑PBA相似，EEP在mRNA和蛋白水平均明顯減輕ox-LDL所致的HUVECs中CHOP上調，并抑制 ox-LDL對下游 Bcl-2 的下調作用；另外，對于ERS誘導劑TM誘導的CHOP上調，EEP也有類似的抑制作用。

Figure 4. EEP inhibited TM-induced apoptosis of HUVECs. HUVECs were treated as described in Figure 2. A: the cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total (early- and late-stage) apoptotic cells were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI); B: caspase-3 activity was determined by colorimetric assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTM group.

圖4EEP抑制TM所誘導的HUVECs凋亡

Figure 5. EEP inhibited ox-LDL-induced CHOP upregulation and Bcl-2 downregulation. HUVECs were treated as described in Figure 1. The protein levels of CHOP and Bcl-2, and the mRNA levels of CHOP were detected using Western blot (A) and real-time PCR (B), respectively. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖5EEP抑制ox-LDL所誘導的CHOP上調和Bcl-2下調

Figure 6. EEP inhibited TM-induced CHOP upregulation. HUVECs were treated as described in Figure 2. The protein and mRNA levels of CHOP were detected using Western blot (A) and real-time PCR (B), respectively. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&P<0.05,&&P<0.01vsTM group.

圖6EEP抑制TM所誘導的CHOP上調

綜上所述，本研究結果提示EEP可減輕 ox-LDL 所誘導的HUVECs凋亡，其機制可能與抑制CHOP介導的ERS凋亡途徑有關。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Ethanol extract of propolis protects vascular endothelial cells from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting C/EBP homologous protein expression

XU Xiao-yan1, SHAO Xia-yan2, LIU Ying-xue2, LI Dong-xuan3, JIAO Peng4，HAO Qi3, TIAN Hua4, YAO Shu-tong3

(1College of Pharmacy，2College of Population and Family Planning，3College of Basic Medical Sciences，4Institute of Atherosclerosis, Taishan Medical University, Taian 271000, China. E-mail: yst228@126.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of ethanol extract of propolis (EEP) on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced vascular endothelial cell apoptosis and the underlying molecular mechanisms.METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or 4-phenylbutyric acid (PBA, 4 mmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and Annexin V-FITC/PI double staining, respectively. The activities of lactic dehydrogenase (LDH) in the medium and caspase-3 in the HUVECs were measured. The protein and mRNA levels of C/EBP homologous protein (CHOP), a proapoptotic molecule under endoplasmic reticulum stress (ERS), and its downstream Bcl-2 were examined by Western blot and real-time PCR, respectively.RESULTS: Like PBA (an ERS inhibitor), EEP protected HUVECs from ox-LDL-induced injury in a dose-dependent manner, as assessed by the increased cell viability and the decreased LDH release, apoptotic rate and caspase-3 activation. The decrease in cell viabi-lity and the increases in LDH release, apoptotic rate and caspase-3 activation induced by TM, an ERS inducer, were also attenuated by EEP. Moreover, EEP suppressed ox-LDL-induced CHOP upregulation and Bcl-2 downregulation, and this effect was similar to that of PBA. Similarly, EEP significantly suppressed TM-induced CHOP upregulation both at the protein and mRNA levels.CONCLUSION: EEP may protect HUVECs from ox-LDL-induced apoptosis, and the mechanism is at least partially involved in suppressing CHOP-mediated ERS-associated apoptotic pathway.

Ethanol extract of propolis; C/EBP homologous protein; Oxidized low-density lipoprotein; Vascular endothelial cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1551- 07

2017- 03- 22 [

] 2017- 05- 03

國家自然科學基金資助項目(No. 81570410； No. 81202949)；泰山醫學院國家級大學生創新訓練項目(No. 201510439100； No. 201510439126)；山東省高等學校科技計劃(No. J14LM52)

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.003

△通訊作者 Tel： 0538-6225010； E-mail: yst228@126.com

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