秦嶺凹葉厚樸內生真菌研究初報△

耿直

(陜西國際商貿學院 醫藥學院，陜西 西安 712046)

·中藥農業·

秦嶺凹葉厚樸內生真菌研究初報△

耿直*

(陜西國際商貿學院 醫藥學院，陜西 西安 712046)

目的：通過對凹葉厚樸內生真菌的鑒定研究，進一步豐富凹葉厚樸內生真菌種群的多樣性，為更加合理有效的利用藥用植物資源提供依據。方法：本文通過微生物方法從秦嶺凹葉厚樸中分離純化內生真菌，采用顯微形態觀察法對分離得到的內生真菌進行初步鑒定。結果：對秦嶺凹葉厚樸內生真菌進行分離純化及初步鑒定，共分離得到內生真菌34株，其中四川都江堰共分離14株，優勢菌群為枝孢屬；陜西漢中共分離20株，優勢菌群為鐮刀菌屬。初步鑒定結果為：1綱，3目，4科，9屬。其中曲霉屬3株，青霉屬1株，葡萄孢屬2株，膠帚霉屬1株，鐮刀菌屬16株，枝孢屬5株，交鏈孢屬1株，束絲核菌屬2株，組絲核菌屬3株。結論：凹葉厚樸內生真菌的種群存在著極其豐富的多樣性特征，為合理利用凹葉厚樸藥用成分及保護凹葉厚樸藥用植物資源提供理論依據。

凹葉厚樸；內生真菌；多樣性

凹葉厚樸為多年生禾本科植物，為木蘭科木蘭屬植物厚樸的一個亞種[1]，是我國特產樹種，主產浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品習稱溫樸，產量大[2]，是我國傳統的特有珍貴中藥材。凹葉厚樸其性溫，味苦、辛；具有溫中化痰引滯、下氣的功效；用于消炎滅菌、痰飲喘滿、胸腹脹滿、腸梗阻等癥[3]。其主要藥效成分是厚樸酚與和厚樸酚，兩種化合物均具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗神經變性、抗抑郁等多種藥理活性。陜西屬于凹葉厚樸的邊緣產區，主要產于安康、漢中一帶。

在采收樹齡上，傳統認為凹葉厚樸種植16年后方可采剝進行利用，然而近年來對于厚樸及凹葉厚樸藥理活性的研究深入，藥材需求量的不斷增加，大批凹葉厚樸未到采種年齡就被提前砍伐，由于過度濫伐森林和大量剝去樹皮藥用，導致凹葉厚樸的分布范圍迅速縮小，成年野生植株極少見，已處于瀕危狀況。

據不完全統計，除了分離出產生紫杉醇內生真菌的藥用植物外，至少有130多種的藥用植物被研究過內生真菌[4]。通過相關查閱與調查，秦嶺地區凹葉厚樸內生真菌研究報道較少。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 采自陜西省漢中市洋縣華陽古鎮金絲猴溝和四川省都江堰的凹葉厚樸根、莖，置于無菌袋中，4℃冰箱保存。經我院雷國蓮教授鑒定為木蘭科木蘭屬凹葉厚樸Magnoliaofficinalissubsp.biloba(Rehd.et Wils.)Cheng et Law。

1.1.2培養基 CPDA培養基；查氏培養基

1.1.3主要儀器 人工氣候箱(LRH-250-G-S，廣東省醫療器械廠)；雙層恒溫培養振蕩器(ZHWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司)等。

1.2方法

1.2.1內生真菌分離與純化 取新鮮健康的凹葉厚樸的根、莖，根、莖截成5cm小段，刮去外表皮直至露出韌皮部即可，流動水沖洗24h，將沖洗好的材料移入超凈工作臺中，無菌水沖洗3次，75%乙醇消毒10～30s，而后用0.1%升汞漂洗(5～10min)，無菌水沖洗3次。手術刀剝下根皮，枝皮，使用手術剪剪成0.5cm×0.5cm的小塊，接入已倒好的馬鈴薯培養基。置于28℃培養箱中培養3～7d。

取切口處新長出的菌絲及時轉接至新鮮PDA培養基上培養。待菌落出現后，根據長出時間的不同、菌落形態以及顏色的差異，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進行分離培養，如此反復純化多次后即可得到一個純菌株，置入4℃冰箱中保存。

1.2.2內生真菌形態觀察 制片檢查：純培養物接種于CA培養基，28℃下倒置培養，待剛長出菌絲時，將無菌的蓋玻片斜插入平板內(插片法)[5]，繼續培養至菌絲爬滿蓋玻片，將玻片取出，在顯微鏡下觀察其特征。參考真菌鑒定手冊對其分類地位進行初步鑒定[6]。

2 結果及分析

2.1結果

從凹葉厚樸中共分離出34株內生真菌，其中從陜西洋縣中分離得到20株內生真菌，從四川都江堰中分離得出14株內生真菌。結果見表1和表2，在厚樸內生真菌中，從數量上看，以鐮刀菌屬Fusarium為優勢種群，包含菌株占總菌株數的47%。

表1 凹葉厚樸內生真菌的種群組成

表2 不同采集地點凹葉厚樸內生真菌的數量及種類分布情況

部分屬種代表性菌落形態及顯微形態特征見圖1-7。

圖1 SC-2束絲核菌屬Ozonium sp.

圖2 SC-4枝孢屬Cladosporium sp.

圖3 SC-9交鏈孢屬Alternaria sp.

圖4 SC-13膠帚霉屬Gliocladium sp.

圖5 SC-14組絲核菌屬Phacodium sp.

圖6 YX-4鐮刀菌屬Fusarium sp.

圖7 YX-13葡萄孢屬Botrytis cinerea sp.

2.2結果分析

厚樸酚與和厚樸酚是從厚樸及凹葉厚樸中提取出來的天然產物，具有抗氧化、調節腸功能和抗胃潰瘍、中樞抑制、肌肉松弛、降壓和抗聚集、提高免疫、抗過敏、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理活性，現今臨床藥用厚樸酚主要來源于從瀕危植物厚樸及凹葉厚樸組織中提取，但已嚴重破壞自然資源，不利于厚樸資源保護。然而根據植物內生真菌共生的內生真菌的理論，植物內生真菌可能產生與宿主植物相同或相似，具有生物活性的次級代謝產物，為獲得厚樸酚這一天然產物開辟了一條新途徑。但由于產量較低，仍不能滿足工業化生產需求。篩選高產內生真菌菌株，進行菌種改良及工程菌株的構建是解決目前內生真菌發酵生產厚樸酚主要途徑。

本次實驗材料分別采自四川都江堰和陜西漢中，共分離到34株內生真菌，經鑒定為1綱、3目、4科、9屬。凹葉厚樸內生真菌的種群組成可以看出凹葉厚樸內生真菌在種類上存在著極其豐富的多樣性特征。在凹葉厚樸內生真菌中，從數量上可以看，以鐮刀菌屬為優勢菌群，包含菌株占總菌株數的47%。

從四川都江堰和陜西漢中采集的凹葉厚樸植株中均分離到了一定數量、類群不同的內生真菌，表明內生真菌在凹葉厚樸中廣泛存在。不同采集地點的凹葉厚樸中內生真菌的優勢菌群不同。采集于四川都江堰的凹葉厚樸優勢菌體為枝孢屬，采集于陜西漢中的優勢菌體為鐮刀菌屬。采集于四川都江堰的凹葉厚樸植株中的內生真菌在種類上相對于采自陜西漢中顯得豐富，認為這與采集地的具體環境、凹葉厚樸的樹齡，以及材料采集時間有關。

在有關厚樸的研究報道中也可發現，不同采集地點的厚樸所含內生真菌的優勢菌體不同，采集于峨眉山唐山的優勢菌體為青霉屬，采集于都江堰市虹口鄉的優勢菌體為曲霉屬。采集于峨眉山的厚樸植株中的內生真菌在種類上較之采自都江堰者顯得豐富，鐮孢屬為兩個不同來源厚樸的共有菌群[7]。

藥用植物中蘊藏著豐富的內生真菌，內生真菌在植物中的分布受組織與年齡結構的影響。本次實驗發現，內生真菌在凹葉厚樸根中分布最多，共21株，莖次之，共13株。根中所含內生真菌主要是常見的土壤和根部或由根部傳導的真菌，由于凹葉厚樸根處于土壤中，并通過土壤吸收植物所需養分，內生真菌利用植物的營養成分來生長繁殖，所以根中內生真菌含量最高；而凹葉厚樸莖將根部吸收的營養傳輸到植物各部分，且莖長期暴露與環境之中，所以莖中內生真菌含量低于根部內生真菌的含量。

本實驗通過對凹葉厚樸內生真菌的分離及初步鑒定，對凹葉厚樸所含內生真菌進行了初步研究，為豐富凹葉厚樸內生真菌種群的多樣性提供實驗依據，同時為利用內生真菌研究凹葉厚樸藥用成分提供初步基礎，為更加合理有效的利用藥用植物資源提供實驗依據。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010:235.

[2] 張貴君.現代中醫藥材商品通鑒[M].北京：中國中醫藥出版社，2001：1234.

[3] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：人民衛生出版社，1995：218.

[4] 姜威，金文藻，張月琴，等.東北紅豆杉內生真菌代謝產物的化學研究[J].中國抗生素雜志，1998，23(4)：263-266.

[5] 劉士旺.真菌形態的幾種觀察方法[J].生物學通報，1998，33(10)：45.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[7] 龐蕾，嚴鑄云，郭曉恒，等.厚樸內生真菌的研究(I)：菌種分離及其鑒定[J].時珍國醫國藥，2006，17(10)：2013-2014.

Preliminary Study on Diversity of Endophytic Fungi in QinLingMagnoliaofficinalissubsp.biloba

GENG Zhi*

(Shanxi Institute of International Trade Commerce，Xi’an 712046，China)

Objective：Through the study on the endophytic fungus of theMagnoliaofficinalissubsp.biloba，in order to enrich the diversity of endophytic fungus of the Magnolia officinalis subsp.biloba，to promote the development of research on the medicinal plant resources.Methods：Isolated the endophytic fungus from QinlingM.officinalissubsp.bilobawith Microbiological methods，Take the Microscopic morphology observation to identificat.Results：34 strains of endophytic fungi were isolated from QinlingM.officinalissubsp.biloba，among them 14 strains were isolated from Dujiangyan of Sichuan，The Cladosporium is dominant bacterial community.20 strains were isolated from Hanzhong of Shaanxi，the Fusarium is dominant bacterial community.The appraisal result is：1 class 3 orders 4 families 9 genus.aspergillus is 3 strains，penicillium is 1strain，Botrytis is 2 strains，Gliocladium is 1strain，Fusarium is 16 strains，Cladosporium is 5 strains，Alternaria is 1 strain，Rhizoctonia is 2 strains，Phacodium is 3 strains.Conclusion：The endophytic fungi ofM.officinalissubsp.bilobahave rich population diversity，Based on available for using the Component ofM.officinalissubsp.bilobaand protecting the resources ofM.officinalissubsp.biloba.

Magnoliaofficinalissubsp.biloba；Endophytic fungi；diversity

陜西省教育廳2014年科學研究計劃(專項項目)，編號：14JK2010

] 耿直，講師，研究方向：生物工程及植物生物技術研究；E-mail：gengyzx1226@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.019

2016-04-07)

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