中華蟾蜍DNA條形碼鑒定△

趙群，張恬，高波，李燈林，楊艷，李軍德*

(1.中國中醫科學院 中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.皖西學院，安徽 六安 237012；3.安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，安徽 淮北 235000)

·專題·

中華蟾蜍DNA條形碼鑒定△

趙群1,2，張恬1，高波3，李燈林3，楊艷3，李軍德1*

(1.中國中醫科學院 中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京100700；2.皖西學院，安徽 六安237012；3.安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，安徽 淮北235000)

目的：通過DNA條形碼研究鑒別中藥材中華蟾蜍BufogargarizansCantor及其混偽品的可行性。方法：從GenBank下載了6種蟾蜍屬Bufo、2種林蛙屬Rana、1種側褶蛙屬Pelophylax和1種小鯢屬Hynobius的COI線粒體基因DNA序列。用Clustal X1.81和BioEdit軟件分別對序列進行比對和編輯。利用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數法計算種內和種間的遺傳距離。用貝葉斯法和簡約法構建系統發育樹對中華蟾蜍進行鑒定。結果：構建的系統發育樹表明，中華蟾蜍的所有樣本聚類為一個單系，能很好地與其他混偽品區分。結論：COI條形碼DNA序列能夠對中藥中華蟾蜍進行準確鑒定。

中華蟾蜍；細胞色素C氧化酶I亞基基因；條形碼；鑒定

中華蟾蜍BufogargarizansCantor隸屬于蟾蜍科(Bufonidae)、蟾蜍屬Bufo，由其獲得的蟾皮和蟾酥是我國傳統名貴中藥材，該種動物為上述中藥材的重要基源動物[1-3]。研究表明，在中華蟾蜍的皮中含有的水溶性化學成分具有顯著的抗腫瘤作用，市場上已出現由其有效成分生產的抗腫瘤藥華蟾素注射液[4-5]。目前，入藥的中華蟾蜍主要來源于野生，但由于野生資源的逐年減少，市場上出現了以其他動物代替中華蟾蜍的混偽品[6]。由于混偽品中抗腫瘤活性成分低于中華蟾蜍[5，7]，必須尋找鑒定中華蟾蜍真偽的有效方法，才能保證該種中藥的臨床用藥安全和市場的有效監管。

目前，關于脊椎動物類藥材的鑒定主要依據外部形態、骨片橫斷面特征、薄層色譜法和紫外光譜吸收特征對藥材進行鑒別[2，8-9]。此外，核型和線粒體12S rRNA基因可用于中華蟾蜍與部分種類的鑒別[10-11]。然而，這些有的分辨率不高，有的復雜費時不利于推廣，有的則涉及鑒別種類較少，沒有對鑒別的可靠性和實用性作進一步研究。線粒體細胞色素C氧化酶I亞基cytochrome oxidase subunit I(COI)基因為蛋白質編碼基因，其密碼子第三位堿基受自然選擇的壓力影響較小，具有較大的變異，同時其他部位又具有一定的保守性，可以較為容易地設計通用引物，在不同物種中擴增出來，便于不同物種之間進行比較分析，用于物種的鑒定[12]。因此，COI基因可以作為DNA條形碼的分子標記。本研究以COI基因為分子標記，研究用其鑒別中藥材基源動物中華蟾蜍及其混偽品的可行性。

1 材料與方法

1.1材料

用于構建中華蟾蜍及其混偽品系統發育樹的內群和外群的COI基因序列均來自于美國國家生物技術信息中心(NCBI)的GenBank。用于構建系統發育樹內群的序列來自于6種蟾蜍屬Bufo、2種林蛙屬Rana和1種側褶蛙屬Pelophylax，詳細信息見表1。外群則包括來自于小鯢屬Hynobius中國小鯢Hynobiuschinensis的3條COI線粒體基因部分DNA序列(GenBank登錄號為JN165870、JN165869和JN165868)。

用于待檢真偽的蟾皮藥材購于安徽亳州藥材市場，從所購蟾皮藥材中隨機抽取3個樣本進行真偽鑒定。3個樣本分別命名為Sample1、Sample2、Sample3。

表1 中華蟾蜍及其混偽品COI序列及GenBank登錄號

1.2方法

1.2.1序列分析 用軟件ClustalX1.81對從GenBank下載的中華蟾蜍、混偽品及外群的COI基因部分序列進行比對和排序，用軟件BioEdit7.0.9.0[13]對比對后的序列進行編輯，用MEGA4.0軟件[14]統計所有序列的變異位點，利用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數法計算種內和種間的遺傳距離。

1.2.2系統發育樹的構建 基于比對和編輯過的所有COI基因部分序列，分別用貝葉斯法(Bayesianinference，BI)和簡約法(maximumparsimony，MP)對中華蟾蜍和其混偽品進行系統發育分析，構建BI和MP兩種系統發育樹。其中BI樹用MrBayes3.1.2[15]軟件構建，MP樹用PAUP*4.0beta10軟件構建[16]。構建BI樹時，由于COI基因3個密碼子區域的分子進化模式不同，因此根據3個密碼子所在的位置把整個序列分為三個部分。用MrModeltest2.3軟件[17]根據AIC(AkaikeInformationCriterion)檢驗標準分別選擇3個不同部分數據的最適進化模型。其中，第一個密碼子位點所在部分的最適模型為(GTR+G)，第二個密碼子位點所在部分的最適模型是(HKY+I)，第三個密碼子位點所在部分的最適模型是(GTR+G)。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(MarkovChainsMonteCarlo，MCMC)設置為四條鏈并運行2000000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運行兩次。每100代抽取一個樣本，共形成40002個樣本。經過分析得知，整個運行在100000代后達到平穩，這樣，總共剩余的樣本數為38002，用剩余樣本重建系統樹，并估計其后驗概率值。構建MP樹時，設置自舉重復次數bootstrapnreps為1000次，使用啟發式搜索分析自舉重復數據集，啟發式搜索設置由隨機逐步添加法產生起始樹，重復10次，采用TBR分支交換。

1.2.3待檢樣本的真偽鑒別 基因組DNA的提取：用標準苯酚-三氯甲烷抽提和乙醇沉淀方法提取待測樣本的整個基因組DNA。提取后的DNA置于-80℃中保存備用。

PCR擴增和DNA序列測定：用引物對Chmf4和Chmr4對待檢樣本的COI基因序列進行PCR擴增。其中，正向引物Chmf4的序列為5′-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3′，反向引物Chmr4的序列為5′-ACYTCRGGRTGRCCRAARAATCA-3′[18]。PCR反應總體系為25μL，包括DNA模板0.5μL(5～50ng)、上游引物和下游引物各1μL(10pmol)、10×PCRBuffer2.5μL、MgCl2(25mmol·L-1)1.5μL、dNTPs(10mmol·L-1)0.5μL、TaqDNApolymerase(5u·μL-1)0.5μL、ddH2O17.5μL。PCR反應程序為95℃預變性5min；接著進行35個循環，每個循環包括94℃變性1min，46℃退火1min，72℃復性1min；最后72℃延伸10min。PCR產物由生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序。測序引物分別為COI-C01和COI-C03，其中COI-C01的序列為5′-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATTGG-3′，COI-C03的序列為5′-ACYTCYGGRTGACCAAARAAYCA-3′[18]。

待檢樣本的真偽分析：利用ClustalX1.81和上述1.2.1序列分析步驟中的所有序列進行分析和比對。用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數法計算每個待檢樣本與其他各個物種之間的遺傳距離。按上述1.2.2方法，將該步驟中所有物種的序列與待檢樣本的序列構建BI系統發育樹和MP系統發育樹。

通過以上方法，如果待檢樣本與中華蟾蜍之間的遺傳距離小于與其他各物種之間的遺傳距離，且待檢樣本與中華蟾蜍在系統發育樹中聚類于同一分支上形成單系，則該待檢樣本為正品中華蟾蜍的蟾皮，反之則為偽品。

2 結果

2.1序列分析

中華蟾蜍、相關混偽品和外群的COI基因部分同源片段序列經過比對和編輯后，序列片斷的長度為556bp，有223個變異位點，其中包含217個簡約性信息位點(parsimony-informativecharacters)。所有序列的平均G+C含量為46.3%，中華蟾蜍的平均G+C含量為47.8%，因此中華蟾蜍與所有序列的平均G+C含量差異不大。中華蟾蜍種內遺傳距離的范圍為0.018～0.031，與其他種類的種間遺傳距離為0.112～0.294。種內最大遺傳距離為0.031，而種間最小遺傳距離為0.112。因此，中華蟾蜍的種內遺傳距離小于與其他混偽品之間的種間遺傳距離。

2.2中華蟾蜍及其混偽品的系統發育樹

通過BI法和MP法構建的系統發育樹表明，2種方法構建的系統發育樹主干基本一致，見圖1。圖1中各譜系分支的節點處標有BI樹的后驗概率值(posteriorprobability，PP)和MP樹的自舉支持度(Bootstrap，BS)。在BI和MP系統發育樹中，中華蟾蜍所有序列的單倍型均聚類為1個分支。盡管該分支在BI樹中的支持度不高(PP=0.67)，但在MP樹中，中華蟾蜍的單倍型以極高的支持度形成1個單系(BS=99)。

注：譜系分支節點上方為BI樹的后驗概率PP和MP樹的自舉支持度BS，其中，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值，斜線任何一邊為空白，表明PP值小于0.5或BS值小于50。圖1 中華蟾蜍及混偽品的系統發育樹

2.3待檢樣本的真偽鑒別結果

通過比對和分析，3個待檢樣本形成1個單倍型，該單倍型用“Sample”表示。待檢測樣本與中華蟾蜍之間的遺傳距離在0.002與0.033之間，小于與其他物種之間的遺傳距離。同時，待檢物種的單倍型Sample與中華蟾蜍的單倍型聚為1個分支形成單系，見圖2，尤其是與中華蟾蜍的其中1個單倍型Hap9以極高的支持度聚類在一起(PP=0.95；BS=93)。

注：譜系分支節點上方為BI樹的后驗概率PP和MP樹的自舉支持度BS，其中，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值，斜線任何一邊為空白，表明PP值小于0.5或BS值小于50。圖2 待檢樣本、中華蟾蜍和混偽品的系統發育樹

3 討論

3.1COI基因序列分析

中華蟾蜍及其混偽品COI基因序列分析表明，中華蟾蜍種內遺傳距離最大為0.031，而其與所有混偽品的種間遺傳距離最小為0.112。因此，中華蟾蜍種內遺傳距離小于與其他混偽品之間的種間遺傳距離，可以用COI基因序列為分子標記，用來鑒別中華蟾蜍及其混偽品。由于在COI序列中存在中華蟾蜍不同于其他混偽品的特異性堿基位點，所以可以通過特異性堿基位點設計中華蟾蜍的特異性鑒別引物，用于中華蟾蜍的快速鑒定。目前，已有很多中藥材可以通過特異性PCR進行快速鑒定[19-23]。

3.2系統發育樹分析

通過貝葉斯法和簡約法構建中華蟾蜍及其混偽品的系統發育樹可以看出，中華蟾蜍的單倍型在系統發育樹中聚類為一個單系，因此，通過構建系統發育樹，可以把中華蟾蜍與混偽品區分開，以達到鑒別中華蟾蜍正品的目的。

3.3待檢樣本的真偽鑒別

由于3個待檢樣本的單倍型與中華蟾蜍之間的遺傳距離最小，且與中華蟾蜍在系統發育樹中聚類于同一分支上形成單系，因此3個待檢樣本為正品中華蟾蜍的蟾皮。

4 結論

本研究分析結果表明，線粒體COI基因序列能夠通過比較待測樣本、中華蟾蜍和其混偽品之間的遺傳距離的遠近，以及通過構建待測樣本與這些物種之間的系統發育樹來判斷該樣本是否為中華蟾蜍的蟾皮，從而達到對待測樣本的真偽鑒定。因此，COI基因序列是較為理想的鑒定中華蟾蜍及其混偽品的DNA條形碼。

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Identification ofBufogargarizansand Its Adulterants by DNA Barcoding Technique

ZHAO Qun1,2，ZHANG Tian1，GAO Bo3，LI DengLin3，YANG Yan3，LI JunDe1*

(1.National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，Beijing，100700，P.R.China；2.West Anhui University，Lu’an 237012，P.R.China；3.Anhui China Resources Jinchan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huaibei 235000，P.R.China)

Objective：To study the feasibility of using DNA barcoding technique to identifyBufogargarizansand its adulterants based on COI gene.Methods：Sequences of partial mitochondrial DNA from cytochrome oxidase subunit I(COI)gene of 6 species fromBufo，2 species fromRana，1 species fromPelophylax，and 1 species fromHynobiuswere downloaded from the GenBank data library.The COI sequences were aligned and edited using ClustalX 1.81 and BioEdit 7.0.9.0 software，respectively.The interspecific and intraspecific genetic distances of different sequences were calculated by Kimura double parameter method using software MEGA 4.0.Based on all the aligned and edited COI sequences，the phylogenetic analyses were conducted using Bayesian inference(BI)and maximum parsimony(MP)to identifyB.gargarizansand adulterant.Results：COI sequence haplotypes of different samples ofB.gargarizanswere gathered together，formed its own monophyly，and distinguished from its adulterants by BI and MP trees.Conclusion：The COI sequence is ideal DNA barcode to identifyB.gargarizansand its adulterants correctly.

Bufogargarizans；COI；DNA barcode；identification

中央本級重大增減支項目(2060302)；蟾蜍規范化養殖技術研究(3-YFB2014005)；安徽省高校省級自然科學研究項目(KJ2016SD61)

] 李軍德，研究員，研究方向：藥用動物資源與動物藥材鑒定，E-mail：jundeli99@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.002

2016-09-02)

*[