動物藥材分子鑒別現狀與策略△

黃璐琦，袁媛，蔣超，田曉軒

(1.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心 北京 100700；2.天津中醫藥大學 天津300193)

·專題·

動物藥材分子鑒別現狀與策略△

黃璐琦1*，袁媛1，蔣超1，田曉軒2

(1.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心 北京 100700；2.天津中醫藥大學 天津300193)

筆者于2011年提出的動物藥分子鑒定的策略與目標已初步完成，即先后提出中藥分子鑒定原則、研制推出動物藥材分子鑒定試劑盒、發展中國動物藥材DNA條形碼及其標準鑒定數據庫。本文在此基礎上，進一步對近5年動物藥材分子鑒別的科研、技術、產業化發展現狀與問題進行總結，提出進一步加強動物分類學基礎研究、擴大研究品種，完善基礎數據庫建設，針對關鍵技術難點開發更為有效、快速的檢測方法，促進標準制定或修訂和產業化發展等策略。

動物藥材；分子鑒定；關鍵問題；核心技術

動物藥材在中醫藥行業中具有重要地位，《中華人民共和國藥典》2010版(以下簡稱《中國藥典》)收載了蘄蛇、烏梢蛇的特異性PCR鑒別方法，成為中外藥典收載的第一個中藥分子鑒定方法，標示著DNA鑒定手段已從實驗室進入了廣泛應用階段[1]。2011年作者曾對動物藥材分子鑒定研究的現狀及問題進行了總結和分析，并提出擴大研究品種、加快動物藥材分子鑒定試劑盒的研制和推廣，全面啟動動物藥材DNA條形碼研究計劃，建立動物藥材分子鑒定標準數據庫等研究策略等[2]。在過去的5年里，隨著分子生物學技術的發展和分子鑒定理論不斷完善，中藥分子鑒定原則的提出，中國動物藥材DNA條形碼的發展與分子鑒定數據庫的建立，相繼研制推出了蘄蛇、烏梢蛇、冬蟲夏草等動物藥材分子鑒定試劑盒，表明2011年提出的動物藥分子鑒定的策略與目標已初步完成。目前已通過DNA分子標記鑒定的動物藥材包括土鱉蟲、地龍、蜈蚣、水蛭等蟲類；蛤殼、珍珠母等介類；金錢白花蛇、烏梢蛇、蛤蚧等蛇蜥類；龜甲、穿山甲、鹿茸、鹿角、羚羊角、鱉甲等角甲類；阿膠等膠霜類；麝香、蛇膽等囊膽類；桑螵蛸等外分泌物類藥材以及海龍、海馬等海洋藥物(詳見表1)。動物藥材DNA分子鑒定技術開始呈現多樣性，鑒定范圍從屬、種鑒別擴大到居群、品種與產地，檢測材料也從原動物、藥材、飲片擴大到中成藥，鑒定需求正在逐步從定性檢測向定量檢測方向發展。

1 動物藥材分子鑒定關鍵問題

1.1動物分類學基礎及分子鑒定標準化

動物藥材的分子鑒定，首先依賴于對其原動物進行準確的分類學鑒定。然而不同種類動物的分類學研究進展存在嚴重的不平衡，如相對于鳥類、獸類等大型動物，昆蟲等無脊椎動物的分類研究進展緩慢，導致其物種的區分、鑒定和命名工作遠未完成。加之世界范圍傳統分類學研究人員的缺乏，且如不具備相關形態學經驗，僅依靠檢索表難以完成動物的準確分類鑒定，也造成部分動物藥材的原動物分類基礎薄弱。

另一方面，在獲取標準動物藥材之后，還需采取標準化手段建立動物藥材分子鑒定方法。以動物通用條形碼標記COⅠ為例，根據國際生命條形碼數據標準，每個DNA條形碼都要有完整的憑證標本信息、采集信息和測序峰圖的原始文件，且應及時上傳生命條形碼數據系統(BOLD，http：//boldsystems.org/)和/或GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數據庫。而事實上，早期分類學研究團隊發表的數據常不能嚴格執行以上要求，導致后續以此類研究為基礎的動物藥材分子鑒定工作，存在假陽性或假陰性可能。

目前在已完成《中國藥用動物志》的基礎上，中國動物藥材DNA條形碼研究計劃制定了統一的“藥用動物DNA條形碼試驗樣品采(收)集規范”，以及實驗研究基本路徑和實施方案；通過各協作組專家、同仁的齊心努力，已順利完成了蛇類、蛤蚧類、哈蟆油類、龜甲類、水蛭類、海馬類、魚類、虻蟲類、桑螵蛸、斑蝥、鹿茸類、羚羊角類等十二大類正品及其偽混品之分子系統學及COⅠ和或/CytbDNA條形碼鑒定研究，以期為動物藥材準確、快速鑒定奠定理論與技術基礎。

1.2種下水平鑒定問題

與植物藥類似，在動物藥(如阿膠)中同樣存在道地藥材鑒別、野生與家養品鑒別等難題。而目前最為通用的動物DNA條形碼技術是物種水平鑒定的工具，其分子標記的選擇可有效區分同屬近緣物種。而針對種下水平(如不同地理居群、品種與產地)，隨著高通量測序技術普及，可依賴基因組(包括線粒體基因組)、轉錄組數據，設計開發新的分子標記。且細胞器基因組本身，也有望作為“超級條形碼”，解決快速分化的近緣物種鑒定問題[3]。

表1 部分代表性動物藥材DNA分子鑒定匯總

表1(續)

表1(續)

2 動物藥材分子鑒定研究現狀

目前中藥分子鑒定技術，較為公認的方式有3類[62-63]：(1)DNA擴增指紋，如AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增長多多態性)、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，簡單重復序列間區多態性)以及由之派生出的SCAR(Sequence-Characterized Amplified Region，序列特異性擴增區)等；(2)分子雜交信號，如Southern雜交及DNA芯片技術等；(3)核酸序列分析，如DNA測序、DNA barcoding技術(DNA 條形碼技術)、AS-PCR(Allele-Specific PCR，位點特異性PCR技術)、HRM分析(High Resolution Melting，高分辨率熔解曲線分析)以及派生出的依據序列差異進行區分的各種新型擴增與檢測方法等，這些方法多已應用于動物藥材分子鑒定。

2.1DNA擴增指紋技術

系指使用通用引物對基因組進行擴增，通過擴增條帶差異進行檢測(RAPD，AFLP、DAMD、SSR等)或對擴增條帶進行后續處理(RAPD-SCAR等)以鑒定中藥的技術，如通過RAPD技術依其條帶差異鑒別中藥材海龍[29]以及從RAPD中轉化出蟲草特異性的SCAR鑒別冬蟲夏草[13]等。DNA擴增指紋技術只要篩選通用引物即可鑒定，不需要待測物種的基因組信息，能在短時間內篩選大量位點信息，尤其適合于物種及以下分類階元的鑒定；鑒定過程可無需DNA測序，成本較低。主要缺陷包括引物較短(9～10bp)，DNA聚合酶、擴增體系、反應條件等變化都可能影響實驗重復性，最終影響鑒定結果。同時由于擴增指紋是一種隨機擴增技術，不區分目標序列與外源污染物，而微生物易滋生的特點致使其在動物藥鑒定中應用困難。近年來隨著DNA序列的積累和基于特異性序列鑒別技術的發展，DNA擴增指紋技術在動物藥鑒定日漸減少，但對種下遺傳多樣性分析和居群鑒定方面仍有一定優勢，亦有選擇重現性好的特異性條帶進行測序轉化為SCAR標記進行動物藥鑒定的研究。

2.2分子雜交信號技術

系指將待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸序列通過堿基配對形成可以檢測的雙螺旋片段，通過靶序列凝膠電泳圖譜差異(Southern雜交)或固定在固相基質上不同位置的探針分子雜交信號(DNA芯片雜交)進行鑒定的一種技術，其中DNA芯片雜交因其探針密度大、檢測方便等優勢廣泛用于物種鑒定。如Geoffrey等根據常見肉類16SrRNA序列差異設計特異性探針點制于芯片上，通過PCR擴增含探針序列的16S區域后在芯片上進行雜交，可同時鑒別牛、羊、豬、馬等32種肉類，混偽檢出限可達1%[64]。DNA雜交技術最大的優勢是中到高通量的信息位點集成，能同時檢測混合生物樣本中的多個組分，利于摻雜檢測，結合探針短，可用于部分降解的材料，并且根據不同探針標記類型可鑒定未知遺傳背景(如SSH雜交，SuppressionSubtractionHybridization[65])和已知遺傳背景的物種，適合的分類元可從種上到種下(如DArT芯片，DiversityArraysTechnology[66])；但與基于PCR的方法相比，DNA分子雜交技術耗時長，且較松弛的雜交條件可能產生交叉雜交而導致假陽性[62]，同時探針篩選和條件確定工作量大，由于目標DNA只與特定的探針結合，對于中高通量芯片來說物料消耗大，成本高。目前DNA分子雜交技術在植物藥和食品鑒定中研究較多，還未見有動物藥DNA分子雜交技術的研究報道。近年來DNA條形碼研究積累了大量物種序列信息，針對條形碼上序列變異信息設計特異性探針點制芯片，通過樣品條形碼片段擴增后進行芯片雜交和熒光信號分析從而進行物種鑒定，從而依據科屬制作全物種鑒定芯片表現出一定優勢[67-68]。

2.3核酸序列分析技術

核酸序列是遺傳信息的直接載體，能直接反映物種的遺傳變異從而實現中藥的分子鑒別。隨著DNA測序技術的發展，測序通量不斷增加同時價格大幅下降，利用DNA測序可以獲得大量信息標記，進而開發出簡單、特異的分子鑒定方法。目前已有多種基于核酸序列分析的鑒定方法。

2.3.1DNA測序鑒定 指擴增目的基因后對序列進行測序，通過生物信息學分析判斷物種歸屬的方法。目前DNA測序鑒定中最引人矚目的方法是DNA條形碼技術，該方法通過選擇一對通用引物，擴增一段物種間有足夠變異、易于擴增、相對較短(～700bp)的DNA片段，測序后通過特定的生物信息學方法與構建的DNA條形碼數據庫進行比對從而鑒定物種。與其他的鑒定方法相比，DNA條形碼最大的特點是通用性，并且易于實現數據共享構建全球統一的數據庫進行鑒定，在動物物種鑒定中尤為成功。《中國藥典》2015版收載的中藥DNA條形碼鑒別指導原則即為本法。

自PaulHebert等[69]對包括脊椎動物和無脊椎動物11門13320個物種的線粒體細胞色素C氧化酶亞基1(CytochromecoxdaseⅠ，COⅠ)基因序列比較分析提出DNA條形碼概念以來，COⅠ作為動物通用DNA條形碼已獲得公認，我國全面啟動動物藥DNA條形碼計劃時間較晚[1，70]，研究尚處于初級階段，許多動物藥并未測定DNA條形碼數據；對藥典中45個動物藥材的51基原物種的COⅠ序列進行了分析，表明除節肢動物門外，其在物種水平和屬水平上均能達到準確鑒定[71]。但在部分節肢動物類群中，COI序列在容易產生混偽品的同屬近緣物種間，分辨率時而不夠理想。除COⅠ外，Cytb、Nad、12SrRNA與16SrRNA序列也有望作為候選條形碼或條形碼組合進行動物藥鑒定。另一方面，對于遺傳關系復雜、分類學基礎薄弱的物種，依據DNA條形碼序列重建的系統發育關系常與已有分類學認知存在不一致，其所揭示的隱存物種多樣性，物種間關系爭議，需要謹慎細致的個案分析。

2.3.2特異性擴增鑒定 系指在正偽品差異序列上設計特異性引物進行擴增，利用引物與正品DNA序列完全匹配可進行擴增產生特定長度條帶，偽品因引物與序列不匹配發生阻滯無法產生條帶從而進行鑒定的一種方法，依據正偽品序列差異大小與引物位置，基于PCR的方法可分為特異性PCR和位點特異性PCR(AS-PCR，Allele-specificPCR)。基于擴增阻滯的原理，改變擴增方法，可實現特異性LAMP(Loop-mediatedisothermalAmplification，環介導等溫擴增技術)[11]、特異性HDA(HelicaseDependentAmplification，解旋酶依賴擴增)[72]等其他特異性擴增鑒定方式；改變檢測方法，可實現特異性熒光定量PCR鑒定，快速PCR鑒定[17]，熒光共振能量轉移(FRET，ForsterResonanceEnergyTransfer)鑒定[60]，微流控芯片鑒定及DNA試紙條鑒定[15]等；改變擴增體系，特異性PCR亦可組合成多重特異性PCR鑒定，如對蛇類藥材[18]、鹿類藥材[41]的鑒定。

主要的特異性擴增鑒定方法中，特異性PCR利用正偽品間序列變異大的區域或正品特有序列區域設計引物，因DNA序列差異大，正偽品間遺傳間斷明顯，特異性和穩健性均較好，在動物藥鑒定中應用廣泛，如阿膠[4]，龜甲[8]，蛤蚧[26]，雞內金[51]等的鑒定，2010年起《中國藥典》收載的蘄蛇和烏梢蛇聚合酶鏈式反應鑒別即為本法；位點特異性PCR則根據單個SNP變異位點，利用TaqDNA聚合酶缺少3′～5′外切酶校正活性，當引物3′ 端與混偽品錯配時造成擴增阻滯無法產生條帶從而區分正偽品[73]，已用于冬蟲夏草[10]、鹿茸[38]等動物藥鑒定。特異性擴增鑒定技術對于任意具有序列差異的物種均可鑒定，高效、快速，操作簡便、儀器依賴性低、易于制成試劑盒推廣，目前已有蘄蛇、烏梢蛇、龜甲等的鑒定試劑盒面世；該方法的主要缺點是不同中藥鑒定引物需單獨設計，不利于建立數據庫共享，對于一些含有PCR阻抑物的動物藥，可能產生假陰性結果，特異性鑒定引物設計時需要大量測序及條件優化工作。

2.3.3PCR-RFLP鑒定 系指在正偽品差異區域兩側序列設計共有引物進行PCR擴增，對擴增產物使用合適的內切酶進行酶切，根據酶切條帶譜圖差異鑒別的一種方法，如對冬蟲夏草[11]、金錢白花蛇[23]等藥材的鑒定，2012年起《中國藥典》收載的川貝母的聚合酶鏈式反應-限制性內切酶酶切圖譜多態性鑒別即為本法。該方法具有良好的重現性和準確性，適合于較低階分類元尤其是多基源的近緣物種的中藥鑒定，與基于測序的方法相比操作簡單、儀器依賴性低、易于制成試劑盒推廣；PCR-RFLP不足之處主要是要求正偽品差異序列/差異SNP位點位于限制性內切酶的識別位點上，并且其序列差異正好導致酶切能力改變，對于一些具有內切酶阻抑物的動物藥，導致酶切不完全，PCR-RFLP引物設計時需要考慮酶切前后片段分離度并且擴增序列內不含有額外的限制性內切酶識別位點。

2.3.4高通量測序技術 高通量測序技術(HighThroughputSequencing)是測序技術發展的一個里程碑，通過把整個基因組序列片段化后，通過不同手段把DNA片段分散從而使各個片段分離并測序，可以對數百萬個DNA分子進行同時測序。目前所說的高通量測序技術主要是指454焦磷酸測序、Illumina及Iontorrent二代測序以及單分子測序技術。高通量測序技術在鑒定上的突出優點是能同時對大量序列進行并行測序，通過生信分析可對基因組、轉錄組及甲基化組等組學數據進行分析獲得大量分子標記，能對未知混合生物樣本進行物種解析。如CoghlanML等對牙痛一粒丸等15種中成藥trnL內含子和16S rRNA片段的PCR擴增產物進行高通量測序，測序結果進行高通量BLAST比對解析中成藥中物種基源，發現標稱含有羚羊角的中藥存在山羊角序列[57]。

3 動物藥材分子鑒別研究發展方向

3.1鑒定標記和DNA提取方法開發多元化

不同動物藥材的來源、炮制、存儲、市場銷售情況千差萬別，不能奢求一種方法滿足所有的鑒定需求。例如，由于動物藥材含有大量營養成分，在存儲、運輸、加工過程中易滋生細菌、真菌、寄生蟲和倉儲害蟲。雖然進行DNA提取前處理時常須對動物藥材表面進行乙醇擦拭和紫外殺菌處理，但藥材內部仍可能藏有細菌、真菌和倉儲害蟲等，難以避免DNA污染。且對于水蛭、虻蟲等吸血性動物來說，其體內可能含有其它物種血液，在使用COⅠ、Cyt b等DNA條形碼鑒別方法時，會同時擴增藥材及其污染物種基因片段，影響鑒別的準確性。因此，選擇專屬性高的分子標記是保證動物藥材鑒定準確的重要發展方向。

另一方面，由于一些動物類藥材如膠類、貝殼類、分泌物、皮膜藥材，DNA降解嚴重或含量較低，造成DNA提取困難、PCR擴增難度也很大；骨骼藥材DNA提取時因須進行脫鈣處理，用時較長。這些困難也阻礙了分子鑒定技術的推廣。針對此類樣品，摸索固定最適宜的DNA提取條件，開發短片段分子標記是較合理的解決策略。

3.2加強標準研究和制定

《中國藥典》2015版共收載動物藥材50種、其中僅31種載有鑒定方法，而冬蟲夏草、海龍、海馬、蛇蛻、金錢白花蛇、鹿角、蜂蜜等常用動物藥項下無任何鑒定方法(表2)。具有鑒定項的動物藥則多以顯微和薄層鑒定為主，專屬性和特異性不強，僅蘄蛇、烏梢蛇鑒別項下收載PCR鑒定方法。除了《中國藥典》以外，有關動物藥材及飲片分子鑒定標準重點應加強行業標準、團體標準和企業標準的制定工作，推進技術方法廣泛應用。

表2 《中國藥典》2015版中收載的動物藥鑒定方法

注：*理化鑒定指通過簡單試劑顏色或狀態變化檢測的方法

3.3擴大技術推廣范圍

目前僅在經濟較發達地區科研院所、部分省級藥檢部門、極少數大型醫藥企業建有動物藥材分子鑒定實驗室，大部分機構和醫藥企業不具備動物藥材分子檢驗能力，嚴重制約了分子鑒定技術的推廣應用。隨著動物藥材分子鑒定技術改良、PCR鑒定試劑盒的商業化生產，逐步解決基礎條件薄弱問題，重點加強科研和檢驗人員隊伍建設，增加檢驗品種數量，擴大技術培訓范圍，將有力的促進動物藥材分子鑒定技術的應用。

4 展望

DNA分子標記作為遺傳信息的直接載體，不受外在形態、發育階段、取樣部位和生境差異的影響，在缺乏特征成分的動物藥鑒定中體現出明顯的優勢。DNA序列僅由A、T、C、G四種堿基組成，易于搭建數據庫實現數據共享。相對于小分子標記物，DNA標記選取可以應對屬、種乃至種下的不同層級，具有特異性高、靈敏度好的特點，且其檢測方法可以多向拓展，因而近年來在動物藥材鑒定領域得以快速發展。未來動物藥材分子鑒定應進一步加強動物分類學基礎研究、擴大研究品種，完善基礎數據庫建設，針對復雜多來源藥材和關鍵技術難點開發更為有效、快速的檢測方法(如單堿基延伸及其他信號擴增技術等)，促進標準制定或修訂和產業化發展。

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Strategy on Molecular Authentication of Animal Medicines

HUANG Luqi1*，YUAN Yuan1，JIANG Chao1，TIAN Xiaoxuan2

(1.State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)

In 2011，the authors put forward the strategies and goal of molecular identification in animal medicine.Now the goal has completed preliminaryly，including put forward the principles of Traditional Chinese medicine(TCM)molecular identification，research on the molecular identification kits，construct DNA barcode database of animal medicine and its standards.In this paper，we summarizes scientific research，technology and industrialization development of molecular identification in animal medicine in recent 5 years，further put forward to strengthen basic research of animal taxonomy，expanding research varieties，perfect the basic database construction，develop more effective and rapid detection methods to promoting standards formulated and industrialization development.

Animal medicines；molecular authentication；problem；key technology

中醫藥行業專項(201407003；201507002-4-4)

] 黃璐琦，院士，研究員，研究方向：中藥資源、分子生藥學；Tel：(010)67090001，E-mail：huangluqi01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.001

2016-09-02)

*[