高效液相色譜法測定利伐沙班中的有關物質

黃艷+陳雪云+楊雪峰

[摘要]目的 建立利伐沙班的有關物質測定方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm），以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（80∶20）為流動相A，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（10∶90）為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為250 nm。結果 利伐沙班與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間的分離度均>2.0，檢測限為0.2～0.5 ng，定量限為1.0～2.0 ng。結論 該方法適用于利伐沙班有關物質的測定。

[關鍵詞]高效液相色譜法；利伐沙班；有關物質；測定

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）08（c）-0078-04

[Abstract]Objective To establish a method to determine the related substance in Rivaroxaban.Methods HPLC method was used，column was Diamonsil C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase A was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，adjusted to pH 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （80∶20），the mobile phase B was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （10：90），which was used as gradient elution The detection wavelength was 250 nm.Results The resolution of rivaroxaban and its related substance was above 2.0，detection limit was 0.2-0.5 ng，quantification limit was 1.0-2.0 ng.Conclusion The method is suitable for the determination of related substance in Rivaroxaban.

[Key words]HPLC；Rivaroxaban；Related substance；Determination

利伐沙班（Rivaroxaban）是一種Xa因子抑制劑，對Xa因子具有高度的選擇性[1-5]，于2008年在加拿大首先上市，用于髖或膝關節置換術后靜脈血栓栓塞癥的預防，有極好的體內活性和生物利用度，是可以口服的新型抗凝藥，具有良好的應用前景[6-13]。根據利伐沙班的合成工藝，可能存在的有關物質有乙酰草酰胺（雜質A）、二-草酰胺-尿素（雜質B）、脫氯化合物（雜質C）、氧代鄰苯二甲酰亞胺（雜質D）、4，5-二氯化合物（雜質E）、二胺（雜質F）和三胺（雜質G）等。為了保證藥品的安全性，現對自制的利伐沙班原料藥有關物質測定方法進行研究，建立了高效液相色譜法（HPLC）不加校正因子的主成分自身對照法測定利伐沙班的有關物質。該方法準確、簡便，能有效控制利伐沙班的質量。

1儀器與試藥

島津LC-2010AHT液相色譜儀，乙腈為色譜純，水為雙蒸水，乙酸銨、25%四甲基氫氧化銨、冰醋酸均為分析純，利伐沙班（自制，批號為20140801、20140901、20140902），利伐沙班對照品（MedChem Express，批號為03201），雜質A、B、C、D、F對照品均購自Cato Research Chemicals Inc，雜質E、G對照品均購自Quality Control Chemicals Inc。

2方法與結果

2.1溶液的配制

精密稱取利伐沙班適量，加溶劑[流動相A-流動相B（4∶1）]超聲溶解并稀釋制成每1毫升中約含0.4 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置20 ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2色譜條件與系統適用性試驗

采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（80∶20）為流動相A，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（10∶90）為流動相B，梯度洗脫（0～20 min，90% A；20～40 min，90% A→50% A；40～60 min，50% A；40～61 min，50% A→90% A；41～75 min，90% A）；檢測波長為250 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min。分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并制成各對照品溶液及混合溶液；精密量取上述溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，混合溶液結果見圖1。理論塔板數按利伐沙班主峰計算為68 877，利伐沙班與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間的分離度均>2.0。endprint

2.3進樣精密度

取“2.2”項下的混合溶液20 μl注入液相色譜儀，連續進樣6次測定，結果各色譜峰面積的RSD均<2.0%（利伐沙班RSD=1.16%、雜質A RSD=0.52%、雜質B RSD=0.44%、雜質C RSD=0.36%、雜質D RSD=1.15%、雜質E RSD=0.67%、雜質F RSD=0.62%、雜質G RSD=0.39%），提示該方法的進樣精密度良好。

2.4專屬性試驗

精密稱取利伐沙班約20 mg，共6份，分別置50 ml量瓶中，按以下條件試驗：一份加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加0.3%的過氧化氫溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，用1mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，用1 mol/L鹽酸溶液2 ml中和，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加溶劑適量，置沸水浴中加熱2 h，取出，放冷至室溫，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份于（4500±500）lx照射5 d，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述6種溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖2。

2.5檢測限和定量限

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1毫升中約含利伐沙班5 μg的溶液，分別逐級稀釋，取20 μl注入液相色譜儀，經分析，利伐沙班的檢測限為0.5 ng（S/N≈3）、定量限為2.0 ng（S/N≈10），雜質A的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質B的檢測限為0.2 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質C的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質D的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質E的檢測限為0.2 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質F的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質G的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10）。

2.6線性關系試驗及校正因子的測定

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋成每1 毫升中約含各組分1 μg的溶液，分別精密量取該溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0置10 ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（μg/ml）對峰面積作標準曲線，線性回歸方程、校正因子等結果見表1。校正因子的測定顯示，各雜質的校正因子均沒有超出0.9～1.1的范圍，可直接采用不加校正因子的主成分自身對照法進行限量檢查。

2.7溶液穩定性試驗

取批號為20140901的供試品溶液，分別放置0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h后測定，結果主峰峰面積的RSD=0.76%，各雜質峰峰面積的RSD均<2.0%（雜質A RSD=1.06%、雜質B RSD=0.71%、雜質C RSD=0.64%、雜質D RSD=1.84%、雜質E RSD=1.62%、雜質F RSD=0.92%、雜質G RSD=1.23%、總雜質RSD=0.59%），提示供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.8供試品有關物質檢查

取3批供試品，按照“2.1”項下的方法制備溶液，按照“2.2”項下的色譜條件，采用不加校正因子的主成分自身對照法測定有關物質，結果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1毫升中約含各對照品10 μg的溶液，按照分光光度法[14-15]于190～400 nm波長范圍內掃描，利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G均在250 nm波長處有最大吸收，參照利伐沙班片進口注冊標準，將有關物質檢測波長確定為250 nm[16]。

3.2色譜條件優化

實驗過程中發現，將乙酸銨溶液與乙腈線下預先混合能改善基線漂移；另外，在流動相中加入四甲基氫氧化銨能有效地改善拖尾，提高分離度。

3.3專屬性試驗

利伐沙班在高溫、強光及氧化條件下雜質均無明顯變化，且未產生新的降解雜質；在強堿破壞條件下，雜質B、雜質C及相對保留時間0.714處有所增加，其他雜質均無明顯變化；酸破壞條件下，雜質C及相對保留時間0.714處未知雜質有所增加，其他雜質均無明顯變化，欲知此未知雜質具體是什么物質，還有待進一步研究。另外，通過安捷倫色譜工作站提供的“全波長法”分析以上色譜圖中，利伐沙班純度指數值均>0.990，提示主峰均為單一物質峰，且降解產物峰、已知雜質峰均與主峰的分離度滿足檢測要求。

[參考文獻]

[1]高娜娜，孫宏斌.利伐沙班衍生物的合成及Xa因子抑制活性[J].中國藥科大學學報，2011，42（5）：392-399.

[2]柯永勝.新型抗凝藥物直接Xa因子抑制劑利伐沙班[J].中國臨床藥理學與治療學，2009，14（4）：361-367.

[3]康銀花.國外新型抗凝藥物的臨床研發動態[J].中國新藥雜志，2013，22（1）：53-58.

[4]閻小青.抗凝藥物的臨床應用現狀[J].天津藥學，2014，26（6）：48-50.

[5]宋文奇，趙夢華，徐寶元.新型口服抗凝藥物臨床應用研究進展[J].血栓與止血學，2014，20（3）：138-140.

[6]孫云波，王磊，神興勤，等.D-二聚體異常患者人工全膝關節置換術后利伐沙班藥物抗凝的安全性和有效性分析[J].中國修復重建外科雜志，2014，28（8）：955-959.

[7]楊禮慶，王程，沈濤，等.口服利伐沙班預防人工全髖關節置換術后深靜脈血栓的臨床研究[J].中國臨床藥理學雜志，2013，29（4）：260-261.

[8]周健，劉忠達，林偉龍.髖關節置換術后利伐沙班預防下肢深靜脈血栓的療效與安全性[J].中國臨床藥理學雜志，2015，31（12）：1106-1108.

[9]陳俊南，PRANESH Kumar Yadav，唐贏，等.利伐沙班和依諾肝素預防人工膝關節置換術后下肢深靜脈血栓的臨床研究[J].中國臨床藥理學雜志，2016，32（2）：108-110.

[10]趙志剛，謝林，丁凡，等.利伐沙班預防關節置換術后下肢深靜脈血栓的臨床前瞻性對照研究[J].中國矯形外科雜志，2016，24（7）：619-622.

[11]錢建敏，舒建國.利伐沙班預防髖關節置換術后深靜脈血栓形成60例[J].中國藥業，2012，21（5）：65-66.

[12]史占軍，嚴格，肖軍，等.利伐沙班預防全膝關節置換術后靜脈血栓栓塞癥的臨床研究[J].中華關節外科雜志（電子版），2014，8（6）：713-717.

[13]袁靜，黃長江，張俊偉，等.利伐沙班的合成[J].中國新藥雜志，2010，19（23）：2185-2187.

[14]國家食品藥品監督管理局藥品審評中心.化學藥物雜質研究技術指導原則[S].2005.

[15]國家藥典委員會.中國藥典（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[16]國家食品藥品監督管理局.利伐沙班片進口注冊標準JX 20080077[S].2009.

（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：祁海文）endprint