復合微生物肥料對香蕉枯萎病防控作用研究

汪軍　梁昌聰　周游　王國芬　楊臘英　劉磊　黃俊生

摘 要 采用盆栽試驗，研究以枯草芽孢桿菌BLG010和淡紫擬青霉E16這2株防控香蕉枯萎病的專利菌株制備的3種復合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）對香蕉枯萎病發病率、香蕉生長指標、病原尖孢鐮刀菌FOC和生防菌株BLG010和E16在香蕉根際定殖情況的影響。結果表明：（1）施用CMF1、CMF2和CMF3均明顯降低香蕉枯萎病的發病率，分別降至60.00%，44.44%，26.67%；（2）與對照相比，CMF1、CMF2和CMF3處理能夠顯著提高香蕉生物量，株高、莖圍、地下部和地上部鮮重，分別提高24.46%～44.80%，40.17%～101.43%，18.78%～47.06%，75.88%～109.11%；FOC數量下降11.57%～49.07%，BLG010和E16在根際中的定殖量分別提高27.55%和32.80%；（3）共聚焦顯微鏡觀察發現根際中尖孢鐮刀菌熒光強度減弱，體積縮小；（4）相關性分析表明，香蕉枯萎病發病率與尖孢鐮刀菌FOC數量呈正相關，E16菌株數量與BLG010菌株數量呈正相關。施用復合微生物肥料不僅提高了對香蕉枯萎病的防治效果，而且促進香蕉生長和提高根際的生防菌株數量，具有較大生防潛力。

關鍵詞 淡紫擬青霉 ；枯草芽孢桿菌 ；香蕉枯萎病 ；復合微生物肥料 ；定殖

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.08.009

Abstract Three types of compound microbial fertilizer， CMF1， CMF2 and CMF3， were prepared from Bacillus subtilis BLG010 and Paecilomyces lilacinus E16 which could control Fusarium wilt of banana， and were used for pot culture trial to observe the effect of CMF1， CMF2 and CMF3 on disease incidence of Fusarium wilt， banana growth index， and colonization of Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）， B. subtilis BLG010 and P. lilacinus E16 in banana rhizosphere. The results showed that treatments CMF1， CMF and CMF3 reduced significantly the disease incidence of Fusarium wilt to 60.00%， 44.44% and 26.67%， respectively. Compared with control， the CMF1， CMF and CMF3 treatments could promote the biomass of banana， the plant height， the stem thickness， the fresh weight of aerial and underground part of banana by 24.46%～44.80%， 40.17%～101.43%， 18.78%～47.06% and 75.88%～109.11%， respectively， reduced the number of FOC by 11.57%～49.07% and increased colonization of BLG010 and E16 in the rhizosphere by 27.55% and 32.80%， respectively. The confocal laser scanning microscope showed that the volume and the fluorescence intensity of FOC were reduced. The correlation analysis showed that the number of FOC was positively correlated with the disease incidence， and that the number of BLG010 was positively correlated with the number of E16. Compound microbial fertilizer could not only increase the controlling effect on Fusarium wilt of banana， but also promote the growth of banana and the number of antagonistic strains， indicating a wide application prospect.

Keywords Bacillus subtilis ； Paecilomyces lilacinus ； Fusarium oxysporum f. sp. cubense ； compound microbial fertilizer ； colonization

香蕉枯萎病是目前危害香蕉的一種毀滅性土傳病害，病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusarium. oxysporum f. sp. cubense，目前對該病的防治仍缺乏有效的方法。生物防治具有綠色、安全的優勢，是近年來的研究熱點[1-4]。擬青霉[5-9]和芽孢桿菌[10-15]對尖孢鐮刀菌均具有拮抗活性，是防治土傳病害的優良菌株。選擇優質有機質等營養與高效拮抗菌株（芽孢桿菌、擬青霉等）制備復合微生物肥料，可補充生防菌在土壤中定殖所需關鍵營養，提高病害防控效果[1，14-16]，但是目前的研究還比較淺顯。淡紫擬青霉（Paecilomyces. lilacinus）E16和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）BLG010 2個菌株是中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所選育出的對尖孢鐮刀菌具有較強拮抗作用的專利高效菌株[17-18]，同時利用BLG010菌株和E16菌株與有機質等營養制備獲得的復合微生物肥料CFM已獲正式登記[微生物肥（2016）準字2028號]，對枯萎病等土傳病害具有較好的控制效果。本研究在此基礎上通過盆栽試驗比較了BLG010和E16菌株制備的復合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）對香蕉生長指標、枯萎病防治效果及病原尖孢鐮刀菌FOC、生防菌株BLG010和E16在香蕉根際定殖情況等的影響，并對其作用機理進行了初步探討，以期為復合微生物肥料的推廣應用提供科學依據。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及植株

供試生防菌：淡紫擬青霉E16菌株、具有硫酸鏈霉素抗性的枯草芽孢桿菌BLG010菌株；供試病原菌：攜帶GFP標記的尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種FOC由本實驗室保存；供試植株：5片葉巴西香蕉苗。

1.1.2 土壤、培養基及肥料

供試健康土：未種植過香蕉的沙壤土（番木瓜土，海南儋州番木瓜基地），pH值為5.9，有機質含量22.85 g/kg，速效氮（N）含量810 mg/kg，速效磷（P）含量480 mg/kg，速效鉀（K）含量7 410 mg/kg。

供試病土：接種FOC到PD液體培養基中，置于28℃、180 r/min搖床振蕩培養5 d 后，于室溫以10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀物即為含孢子的菌懸液，活孢率達到5.8×108 CFU/mL。將FOC孢子懸浮液接入上述供試健康土壤中，調整土壤中FOC濃度為4.2×104 CFU/g土。

供試培養基：FOC采用尖孢鐮刀菌選擇性培養基[19]，E16采用選擇性培養基[20]，BLG010采用含有200 μg/mL鏈霉素的LB培養基。

供試肥料：有機肥OF由海南寶綠春農業開發有限公司生產；3種復合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）由2株專利菌株E16和BLG010與雞糞等有機物料通過復配制成，制備方法參考文獻[21-22]及復合微生物肥料行業標準（NY/T798-2015），由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所研制，海南寶綠春農業開發有限公司生產。供試肥料基本性狀見表1。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

盆栽試驗：往每個塑料盆（底面直徑20 cm，高30 cm）中裝入500 g病土，分為5個處理：（1）對照（CK）（不施用任何物質）；（2）OF（接入3%OF，充分混勻）；（3）CMF1（接入3% CMF1）；（4）CMF2（接入3%CMF2）；（5）CMF3（接入3% CMF3）。各處理移栽香蕉苗50棵，重復3次，置于溫室大棚（溫度26～31℃），常規水肥管理。

1.2.2 統計方法

發病率：香蕉移苗后，每天觀察香蕉生長情況，每隔20 d記錄發病的植株數量，計算累積發病率。發病率/%=發病株數/（總株數）×100。

植株生長狀況測定：香蕉移栽后82 d，測定株高、莖圍、地上部和地下部鮮質量等生長指標，測定方法參照文獻[5]。

香蕉根際病原菌FOC、生防菌BLG010和E16的數量測定：每隔20 d取根際土樣1次，測定方法參考文獻[5]，采用稀釋涂平板法[21]，略作修改，統計FOC、E16和BLG010等土壤微生物數量。

香蕉根際病原菌FOC形態觀察：取香蕉根際土樣按照一定比例稀釋、過濾后，濃縮離心，利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus Fluoview-FV1000）觀察土壤中FOC的熒光強度和形態變化。

對移栽22 、52 和82 d的香蕉枯萎病發病率與根際FOC、E16、BLG010數量進行相關性分析。

1.2.3 數據分析

試驗數據利用SAS 9.0統計分析軟件和Excel進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對香蕉枯萎病發病率的影響

在香蕉移植后82 d，各處理的發病率見圖1。CK發病率達到96.67%，施用不含生防菌株的有機肥處理（OF）發病率為72.22%，含有菌株E16的CMF1處理的發病率為60.00%，含有菌株BLG010的CMF2處理的發病率為44.43%，含有菌株E16和BLG010的CMF3處理的發病率為26.67%，防效達到71.08%。結果表明，枯草芽孢桿菌BLG010菌株較淡紫擬青霉E16菌株能更好地防治香蕉枯萎病，尤其是2個專利菌株復配的復合微生物肥料CMF3效果最優。

2.2 不同處理對香蕉生長指標的影響

由表2可知，不同處理對香蕉生長的影響顯著，與CK比較，OF顯著促進了假莖圍生長，而對株高、地下部和地上部重量則無明顯促生作用；CMF1、CMF2和CMF3的株高、假莖圍、地下部和地上部重量均有顯著的提高，促生作用依次表現為CMF3>CMF2>CMF1>OF>CK。CMF1、CMF2和CMF3對株高、莖圍、地下部和地上部鮮重的提高幅度分別為24.46%～44.80%、40.17%～101.43%、18.78%～47.06%、75.88%～109.11%。

2.3 不同處理對香蕉根際FOC、E16和BLG010定殖的影響

到第82天，利用不同選擇性培養基檢測香蕉根際病原菌FOC、生防菌E16和BLG010的菌量（Log CFU/g）。結果表明（表3），復合微生物肥料不僅能有效降低病原菌尖孢鐮刀菌數量，還能提高生防菌株E16和BLG010數量；同時含有生防菌E16和BLG010的復合微生物肥料CMF3處理效果優于含有單一生防菌株E16或BLG010的復合微生物肥料處理。具體表現為：與對照比較，復合微生物肥料處理顯著降低土壤中的病原菌FOC數量，以含有E16和BLG010菌株的CMF3處理效果最為顯著，其次為CMF2，CMF1次之，三者對根際FOC定殖的抑制效果分別為49.07%，19.18%，11.57%。生防菌株E16和BLG010均能在土壤中保持存活，CMF3處理的香蕉根際E16定殖量比CMF1處理提高了32.80%，而其BLG010定殖量比CMF2處理提高了27.55%。

2.4 不同處理根際對尖孢鐮刀菌FOC形態的影響

利用共聚焦顯微鏡觀察的結果表明（圖2），對照（CK）和有機肥OF處理中孢子形態呈橢圓形，病原菌FOC在根際以小孢子形態存在；經過3種復合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）處理的單個孢子體積減小50%以上，FOC熒光強度顯著減弱，形態不規則。總體而言，經CMF1和CMF3處理后主要表現為FOC孢子體積減小，經CMF2處理后主要表現為FOC孢子邊緣不規則和體積減小。endprint

2.5 香蕉根際FOC、E16和BLG010數量相關性分析

對栽培22 、52 和82 d的香蕉枯萎病發病率與根際FOC、E16、BLG010數量進行相關性分析。結果表明（表4），香蕉枯萎病發病率與FOC數量呈極顯著正相關關系；E16與BLG010數量呈極顯著正相關關系；其余指標間無顯著相關關系。

3 討論

淡紫擬青霉能產生類植物生長素[23]，通過營養競爭抑制病原菌生長[6]，具有防病促生作用[17，23-24]。芽孢桿菌具有分泌拮抗物質、抑制和降解病原真菌的作用[17]。本研究選用2株高效專利拮抗菌株（枯草芽孢桿菌BLG010和淡紫擬青霉E16），分別比較了單一菌株和混合菌株制備的復合微生物肥料對香蕉枯萎病的防控作用，結果發現，施用復合微生物肥料的CMF1、CMF2和CMF 3處理都明顯降低了香蕉枯萎病的發病率，3個處理的發病率分別降至60.00%，44.43%，26.67%；與對照相比，CMF1、CMF2和CMF3處理能夠顯著提高香蕉生物量，株高、莖圍、地下部和地上部鮮重的提高幅度為24.46%～109.11%，CMF3促生作用最佳，其次為CMF2、CMF1，推測功能不同的混合菌株效果優于單一菌株，而單一菌株中BLG010菌株對香蕉生長的促進效果優于E16菌株，BLG010菌株分泌拮抗促生物質的功效較E16菌株更佳，二者復配后功效最佳。

香蕉枯萎病的發生與發病程度均與根際尖孢鐮刀菌數量有相關性[5，25]，生防菌成功定殖是發揮功效的前提[5，26]。因此應調控適合生防菌生長的土壤環境，提高其在土壤中的營養利用率和定殖水平，使其快速占據生態位點和分泌能有效抑制病原菌的代謝產物，從而降低土壤中尖孢鐮刀菌數量，這是控制枯萎病的有效途徑。本研究也發現，應用3種復合微生物肥料后，香蕉根際的病原菌FOC數量下降了11.57%～49.07%，其中CMF3效果最佳，其次為CMF2，CMF1次之；CMF3較CMF1和CMF2提高了生防菌BLG010和E16的根際定殖量，分別提高了27.55%和32.80%；首次應用共聚焦顯微鏡觀察，直觀地發現根際FOC呈現孢子畸形和體積減小，同時，相關性分析發現，香蕉枯萎病發病率與FOC數量正相關，BLG010和E16正相關。可能原因是施用復合微生物肥料后土壤有機質等營養物質含量和C/N等處于均衡狀態，促進了BLG010和淡紫擬青霉E16對有機質、肥料和微量元素等營養物質的循環利用和增殖，形成優勢菌群，達到競爭和分泌活性物質、抑制病原菌FOC和控制病害的目的，同時表明施用復合微生物肥料對香蕉根際病原菌、生防菌等土壤微生物種群的影響是復雜的。

單一菌株制劑或有機肥對土傳病害的防治效果不穩定，難以應用于田間環境，含有拮抗菌株芽孢桿菌的生物有機肥顯著降低香蕉枯萎病發病率[13，15，26]，促進香蕉生長，增加土壤細菌豐度，降低病原菌豐度[26]。本研究選擇功能不同的2株高效生防菌株與有機肥等營養復配制備新型復合微生物肥料，補充生防菌株在土壤中定殖和分泌活性物質所需的關鍵營養，減少了病害發生，同時提供香蕉生長所需養分，與前人研究結果（生物有機肥優于傳統的生防菌株制劑或有機肥）一致。本研究限于盆栽試驗，田間應用效果還有待評價，同時復合微生物肥料中的淡紫擬青霉和枯草芽孢桿菌在土壤中競爭營養物質、占據生態位點和分泌抑菌物質的協同防病機理還需深入研究。

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