三嗪類除草劑免疫分析技術的研究進展

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(1.河北北方學院農林科技學院,河北張家口 075000; 2.河北北方學院食品安全研究中心,河北張家口 075000)

三嗪類除草劑免疫分析技術的研究進展

韓正政1,劉媛1,2,王健1,2，*,張俊花1,黃偉1

(1.河北北方學院農林科技學院,河北張家口 075000; 2.河北北方學院食品安全研究中心,河北張家口 075000)

在針對三嗪類除草劑的檢測中,免疫分析技術的發展已越來越受到社會的關注,并成為研究的熱點。本文主要介紹了免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的幾個關鍵技術環節,即半抗原及人工抗原的設計合成、抗體的制備以及各種免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的應用,并對目前存在的問題和今后的發展方向進行了討論。

免疫分析技術,三嗪類,除草劑,農藥殘留

三嗪類除草劑(triazine herbicides)自20世紀50年代問世以來,被廣泛用作抑制農田中雜草生長的高效除草劑,其分子結構以六元環為主體由三個C和三個N對稱排列,所以也可稱作“均三氮苯類除草劑”。常見的三嗪類除草劑品種有阿特拉津(atrazine)、西瑪津(simazine)、撲滅津(propazine)等,主要作用原理是通過抑制植物的光合作用來達到除草的目的。但是由于土壤和水中殘留的三嗪類除草劑對環境安全和人體健康都有嚴重的影響[1],因此早在2007年歐盟就已全部禁用。而此類物質在我國仍然被大量生產和使用,這無疑增大了我國的環境和食品安全風險。

針對三嗪類除草劑,常用檢測方法包括:高效液相色譜法、液-質聯用法等[2]。雖然這些方法靈敏、準確,但樣品需要繁雜的前處理過程,而且檢測時間長,儀器昂貴,技術要求高,不適合大量樣品的快速檢測,因此迫切需要一種快速、價廉的檢測方法作為上述儀器分析方法的補充。免疫分析法(IA)以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎,具有靈敏、簡便、分析量大、成本低等優點,非常適宜于復雜基質中痕量組分的分析以及大批量的檢測和篩選實驗[3],已成為分析技術研究的重要領域[4]。美國化學會(AOAC)甚至將免疫分析技術與液相色譜、氣相色譜一同列為農藥殘留檢測的三大支柱技術。

早在1968年,Centeno等人第一次將放射性免疫分析(RIA)應用于馬拉硫磷和DDT的檢測,自此免疫學檢測技術就正式應用到了農藥殘留檢測當中[5]。到1980年,Hammock和Mumma發表的有關農藥半抗原與載體蛋白的連接方法及抗體制備的綜述性論文,極大地推動了免疫分析法在農藥殘留檢測中的應用[6]。1985年又由Huber[7]建立了阿特拉津酶免疫定性定量分析方法并研制出了阿特拉津酶聯免疫試劑盒,從而揭開了免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的應用。國內最早關于農藥免疫分析的文獻,是黃葵編譯的Freia Jung等[8]關于免疫分析技術在農藥分析中應用的綜述性文章,系統介紹了農藥半抗原的設計合成及與載體蛋白的偶聯、抗體的制備、免疫方法的選擇、樣品制備及結果鑒定等內容。本文將重點介紹針對三嗪類除草劑的半抗原及抗體合成的基本原理及研究動態,各種免疫檢測方法的應用進展以及未來的發展方向,以期為免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的進一步應用提供理論參考。

1 半抗原與人工抗原的設計及合成

農藥通常的相對分子質量都小于1000,必須與如載體蛋白等這樣的大分子物質偶聯后才能刺激機體產生抗體,否則不具備針對農藥抗原決定蔟的特異性,這也是小分子免疫分析的基本模式。免疫分析法建立的關鍵因素是半抗原的結構是否合理,并能否以此制備穩定且有良好免疫原性的人工抗原。因此,首先需要合成可直接與載體偶聯,并最大程度模擬待測分子結構的半抗原。半抗原的典型結構中應具備適當的末端活性基團,諸如-SH、-NH2、-COOH和-OH等;同時活性基團與載體之間也應具備4～6個碳鏈長度的間隔臂。然后再將載體蛋白與半抗原結合而制成人工抗原。載體蛋白不是單純地起運載作用,也不僅是增加半抗原的相對分子質量,而是依靠“免疫原性”這一本身的結構特異性誘導體液抗體的產生進而誘導其對半抗原農藥分子的識別,這種現象被稱為載體效應[9]。

常用的載體蛋白有卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)及多聚賴氨酸(PLL)等。科研工作者經過大量的研究工作,建立了多種多樣的偶聯方法,最終解決了如何將半抗原的農藥小分子偶聯到大分子載體蛋白上的問題。所建立的方法原理一般都是基于利用小分子中的活性部位與蛋白質上的羧基、氨基、巰基、酚基或羥基進行化學反應。常用的偶聯反應方法很多,包括重氮化法、混合酸酐法、戊二醛法和碳二亞胺法等,具體選擇哪種方法主要考慮農藥小分子及其半抗原的分子結構[10-11]。ELISA包被用的人工抗原與免疫用的人工抗原需采用不同的載體蛋白,以免檢測系統因為載體蛋白的干擾而受到影響[12]。較常采用的免疫載體蛋白為BSA,而OVA常作為包被用載體蛋白。而且最好采用不同的合成路線制備免疫原及包被原。每種農藥可利用多種人工合成的半抗原,不同的載體蛋白和偶聯劑合成多種人工抗原,再通過免疫反應得出的免疫效果及特異性，篩選出較好的人工抗原。

大多數三嗪類半抗原的制備都是沿用上世紀90年代Goodrow等[13]的操作步驟。當時,他們利用Schlaeppi等[14]報道的方法將阿特拉津上的氯原子轉變成了羥基,制備出了阿特拉津羥基衍生物,作為半抗原使用。隨后,Goodrow的研究團隊又對三嗪類除草劑半抗原的設計進行了一系列的優化。他們利用“尺寸排阻”效應設計半抗原,認為半抗原的特征取代基應小于目標分子的取代基,從而產生的多克隆抗體就不會識別大于目標分子的分析物。他們發現在多數檢測阿特拉津的ELISA實驗中,抗體其實能更好的識別撲滅津。在交叉反應實驗中,6位的異丙氨基對撲滅津的識別率是阿特拉津的2.5倍;如果是更小的乙氨基的話,對阿特拉津識別率是100%,西瑪津識別率40%,撲滅津識別率降到了72%[13-15]。隨后,他們用更小的甲基取代基,西瑪津和阿特拉津的識別率分別為100%和75%,撲滅津的識別率降低到13%。接下來以硫代替氯作為連接結構,2-巰基丙酸為間隔臂,分別以乙氨基-乙氨基和乙氨基-異丙氨基為取代基的三嗪類除草劑的半抗原就被用來制備多克隆抗體。結果發現前者相比后者極大地提高了對西瑪津的識別率(約15倍),對撲滅津識別率降低了一半,相似的結果在Lawruk等的結果中也得到證實。

2 抗體的制備

抗體的發展主要經歷了多克隆抗體(Pabs)、單克隆抗體(Mabs)及基因工程抗體3個重要階段。

Pabs可從免疫原免疫動物血清中直接獲得,是應用歷史最悠久且獲取最容易的抗體制備方法。Mabs來源于免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合后篩選出的細胞株,此種細胞株能穩定分泌目標分析物的抗體。在試劑盒研發方面,Mabs比Pabs更具優勢,因為前者可以無限量地生產均質抗體。而對于Pabs來說,針對同一只動物的多次采血所獲得的抗血清也存在差異?；谝陨显?近年來關于免疫分析檢測農藥殘留的相關文獻報道中,Mabs所占比例呈逐年上升趨勢。表1中列出了近年來針對三嗪類除草劑的單抗和多抗的使用情況。盡管許多報道都列出了Mabs相對于Pabs的優勢,但在多數競爭性免疫檢測中使用的還是多克隆抗體。有很多原因可以解釋這一現象,一個原因是傳統的雜交瘤融合生產抗體的方式既復雜又昂貴,另一個原因就是針對人工抗原的特異性抗體的篩選也是一大難題[16]。

由于無論是Pabs還是Mabs,其制備方法都耗費高、耗時長且需要動物實驗,發展應用受到限制。而基因工程抗體卻正以其低免疫原性、高產量等優點,逐漸成為了抗體應用研究的熱點?；蚬こ炭贵w應用DNA重組技術及基因突變方法改造目標抗體基因的編碼序列,來產生自然界中本不存在的蛋白質分子。重組抗體技術,如“噬菌體展示技術”等可通過克隆來生產抗體片段,所產片段能在生長繁殖迅速的大腸桿菌中大量表達,并保持完整的抗體功能,從而極大縮短了特異性抗體的制備時間。ScFv和Fab片段是最常用的抗體片段,比完整的IgG分子具有更高的特異性。重組抗體技術加速了不依賴于動物實驗的新抗體技術的發展。近十幾年來,基因工程抗體及相關技術在農藥殘留分析領域研究和應用得到了迅猛發展,有代表性的如1982年Wie[17]將抗體的Fab片段和ScFv片段應用于莠去津殘留的分析上,測定結果的精確性和準確性較為理想。2002年Karl Kramer[18]建立了針對三嗪類除草劑的類特異性基因抗體庫,并采用免疫磁性分離(IMS)方法從21個脾細胞群中篩選針對三嗪類除草劑的特異性抗體基因,大大提高了目的基因在抗體庫中的比例。

表1 單克隆抗體和多克隆抗體在三嗪類除草劑免疫分析中的應用Table 1 Applications of monoclonal antibodies and polyclonal antibodies in immunoassay of triazine herbicides

3 免疫分析方法及在三嗪類除草劑檢測中的應用

農藥殘留的免疫分析方法是在已有免疫學實驗的基礎上建立起來的,因此它的免疫學反應原理及操作過程都與其他免疫檢測方法相類似。按不同的標記物分為:放射性免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、化學發光免疫分析(CLIA)等。

3.1放射性免疫分析(RIA)

RIA是以諸如I125、P32、H3等放射性元素標記抗原或抗體,用液體閃爍計數器等儀器測定β射線或γ射線的放射性強度,從而測定抗體或抗原量的分析方法。徐德武等[27]采用H3標記的阿特拉津半抗原建立了快速檢測阿特拉津的RIA分析法。研究表明自來水的殘留阿特拉津添加回收率為88.5%～107.5%,運河水則為87.4%～110.9%,說明此法對水樣中阿特拉津殘留分析具有較好的準確性。雖然RIA法特異性強、靈敏度高、技術相對成熟,但它所帶來的放射性污染卻難以處理,并對人體健康造成潛在危害,因而極大限制了該技術的應用范圍。目前該技術已不在三嗪類除草劑快速檢測中使用。

3.2酶免疫分析(ELISA)

ELISA法是目前非放射性免疫快速檢測三嗪類除草劑的主流技術。ELISA法的原理是利用酶標記的抗體或抗原進行免疫反應,將免疫反應的高靈敏性和高特異性有機結合在一起,具有簡便、靈敏、快速等優點。國外的相關研究起步較早,Huber[7]于1985年就建立了阿特拉津酶免疫定性定量分析方法,并進行了相關試劑盒研發。隨后,Goodrow研究團隊[9-13]一直致力于三嗪類除草劑的半抗原合成及抗體制備的研究,并建立了檢測阿特拉津、西瑪津和撲滅津等三嗪類除草劑的ELISA檢測方法。德國、美國等發達國家已經開發出了應用于食品和環境中三嗪類除草劑分析的商品試劑盒。Eline P Meulenberg[28]等人已將三嗪類除草劑的類特異性ELISA試管試劑盒應用于水樣的檢測,結果顯示假陽性率為10%,假陰性率為47%,有可能是操作試管時遇到的實際問題降低了檢測的準確性。

近些年來,許多文獻相繼報道了對于傳統ELISA方法的改進。Jasdeep Kaur[29]等將小分子半抗原直接包被在微量滴定板上來檢測阿特拉津和2,4-D。他們將聚苯乙烯先后用HNO3和APTES處理,使其表面帶有與小分子半抗原連接的氨基,改造后的滴定板表現出了良好的親和性和穩定性。用該方法檢測水樣中的阿特拉津,IC50非常低,可達到0.02 ng·mL-1,線性范圍為0.01～1000 ng·mL-1。Hanna Barchanska[30]等建立了一種適合于野外大批量樣品檢測使用的快速試管ELISA,用以檢測牛奶中的阿特拉津。經HPLC檢測確證可知,ELISA結果靈敏性更高,因為一些樣品中的阿特拉津被ELSA檢出,而HPLC未檢出。Elena V Yazynina[31]等利用陰陽離子聚電解質之間的靜電相互作用,建立了聚電解質ELISA檢測阿特拉津,大大縮短了ELISA的檢測時間,使原來60 min的抗原抗體結合的孵育時間,縮短為了8 min和5 min的兩個步驟。優化后的檢測只需40 min,靈敏度為0.03 ng·mL-1,在0.05～1 ng·mL-1范圍內檢測變異系數為1.4%～8.0%。

同時,國內也有部分科研團隊建立了ELISA快速檢測三嗪類除草劑的方法。單國民[32]以三嗪類除草劑的結構特征為依據,合成得到3種不同半抗原,并制備出3種相應的高效抗體,從而建立了檢測阿特拉津、撲滅津和西瑪津的ELISA方法,最低檢測限分別為1.0、0.5和2.0 ng·mL-1。鄧安平等[33-34]采用ELISA法分別對水樣和土壤中阿特拉津的含量進行了檢測,得出水樣中阿特拉津測定的線性范圍為0.05～5.00 ng·mL-1,最低檢出限達0.018～0.022 ng·mL-1;隨后又對土壤樣品中阿特拉津的分離和測定做了研究,發現測定線性范圍為0.05～5.00 ng·mL-1,最低檢測限在0.018～0.024 ng·mL-1范圍內,線性相關系數r=0.9922。胡曉航等[35]采用建立的ELISA方法對土壤中的阿特拉津殘留進行定量分析,最低檢出限為0.04 μg·kg-1,實驗證明該方法具有較好的重復性和精確度。

3.3熒光免疫分析(FIA)

熒光免疫分析是標記免疫技術中最早進行研究的,它集免疫反應的特異性和熒光的敏感性于一身,靈敏度較分光光度法提高約10～100倍。該方法用熒光物質標記抗體或農藥半抗原分子,并制備特異性熒光物,兩者可發生特異性結合,利用特定熒光分析儀測定熒光物質受激發光照射后發出的熒光強度或偏振幅度等,制得農藥濃度—熒光強度曲線,進而實現對農藥殘留的定性定量分析。近年來,在傳統熒光抗體技術的基礎上,發展和建立了各種免疫熒光測定法,具體方法有以下幾種:時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、熒光偏振免疫分析(FPIA)、熒光激發共振能量轉移免疫分析(FRETIA)和熒光淬滅免疫分析(FQIA)。

Reimer等[36]成功制備了多克隆抗體,并以銪離子(Eu3+)作為示蹤物,利用TRFIA檢測水樣中的阿特拉津殘留,檢測限為(0.05±0.03) ng·mL-1,IC50為(0.17±0.08) ng·mL-1,重復實驗的相對偏差為5%。與ELISA比較,TRFIA在準確性、穩定性上均具有優勢。Chio等[37]建立了一步檢測阿特拉津的FPIA方法,檢出限為3 ng·mL-1,相對標準偏差小于3%,與草凈津和西瑪津的交叉反應分別為1%和30%。Schobel[38]的研究小組成功運用FRETIA法對水中西瑪津進行檢測,以熒光染料 Cy5和Cy5.5分別標記抗體和待測西瑪津衍生物半抗原,檢測限為10 ng·mL-1,線性范圍0.3～200.0 ng·mL-1。Matveeva等[39]采用反膠束體系免疫熒光淬滅法測定阿特拉津,最低檢測限為0.15～0.20 ng·mL-1,線性范圍30～40 ng·mL-1。

3.4化學發光免疫分析(CLIA)

CLIA法是將化學發光或生物發光體系與免疫分析相結合而建立起來的一種新型標記免疫測定技術,具有靈敏度和特異性高等特點。該法是將化學發光物質標記在農藥半抗原或抗體上,待免疫反應結束后,加入氧化劑而發光,通過測量化學發光強度來繪制標準曲線從而測定待測農藥的濃度。與其他免疫分析法相比,該方法用于三嗪類除草劑的檢測還相對較少,有著廣闊的發展前景。Samsonova等[40]以5種抗體的混合物為基礎建立了競爭CLIA法,并對環境樣品中3種三嗪類除草劑(阿特拉津、特丁津和莠滅凈)進行檢測,檢出正確率達70%～100%,該研究為環境監測中多組分分析提供了新的思路。Tudorache等[41]建立了一種旨在檢測阿特拉津的磁性粒子化學發光酶免疫法,該法將抗體固定于磁性粒子表面,該磁性粒子被磁場作用固定于檢測板底部,酶標記阿特拉津和待測物競爭結合抗體,然后加入發光底物液(魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚)進行測定,該方法的檢出限為 3 pg·L-1,IC50為37 pg·L-1,線性范圍為 10～1000 pg·L-1。

4 三嗪類除草劑免疫分析的新進展

4.1免疫分析技術與其他技術的聯用

免疫分析方法和理化分析方法的聯合使用,可將免疫分析法的高靈敏性、高特異性和理化分析的高分離能力有機結合起來,是今后檢測技術發展的方向之一。Marja E等[42]用固相萃取(SPE)的方法對尿液樣品進行前處理,排除其中的干擾物,再用ELISA法檢測其中的阿特拉津代謝物,使檢測的靈敏度相比于以往的報道提高了10倍。此外,將免疫分析法與高效液相色譜法(HPLC)聯用,可大大降低分離樣品時有機溶劑的用量,使靈敏性大大提高。研究表明免疫分析與氣相色譜/質譜(GC/MS)聯用可減少農藥中結構類似物分析時的交叉反應,從而降低假陽性[5]。

4.2多組分分析物免疫分析

多組分分析物免疫分析(MIA)是指在同一樣品中,同時測定兩種或兩種以上的相關分析物的免疫分析方法。目前,用于農藥多殘留組分免疫測定的主要有熒光免疫分析法(FIA)、金免疫層析分析法(GICA)、免疫生物傳感器(IS)等方法。這些免疫分析方法的核心環節就是制備出能夠識別全部一類農藥的類特異性抗體。目前用于多殘留檢測的抗體主要通過以下方法獲得,類特異性抗體的制備,“多決定簇”人工抗原制備,雙特異性單克隆抗體技術的應用以及重組抗體或單鏈抗體技術的應用。目前,針對三嗪類除草劑的多殘留分析主要是通過設計合成具有三嗪類特征環狀結構的半抗原,進而得到類特異性抗體,來實現多種三嗪類除草劑的同時檢測。有許多因素能夠影響到多殘留分析結果的準確性,其中半抗原的設計合成,半抗原與載體的連接方式,抗體的種類和特征以及免疫分析方法的選擇等都應該值得特別關注[43]。

4.3免疫傳感器

生物傳感器最可能成為一種快速、靈敏、特異性強、可再生的檢測工具。免疫傳感器(IS)是生物傳感器的一種,是基于固相免疫分析的生物傳感器。它是一種便攜微型化的檢測裝置,能夠通過抗體特異性識別目標物,并產生與濃度值相對應的可轉換信號。IS包括以下三部分:①生物部分—抗體?？贵w使得傳感器具有特異性和敏感性特征。②轉換器。轉換器可將抗體與目標物特異性結合后產生的光、熱等物理化學信號轉換成電信號。③電部分。擴大化和數字化轉換器所產生的電信號,便于實驗結果的統計和保存。在農藥殘留檢測中,與免疫化學技術相結合的轉換器主要有電化學轉換器、光學轉換器及壓力轉換器等。自20世紀90年代后期,免疫傳感器技術在三嗪類除草劑檢測中得到了迅猛發展[44-46],從而使免疫檢測手段朝著自動化、簡便化、快速化的方向發展。目前主要困擾免疫傳感器發展的問題是合適的抗原或抗體的制備、傳感器的使用壽命以及信號的穩定性等方面有待進一步完善[47]。

4.4流動注射免疫分析技術

流動注射免疫分析(FIIA)是由流動注射分析(FIA)與競爭酶免疫技術結合而成,是現代免疫檢測技術的主要發展方向之一。FIIA的靈敏度可以通過標記物的選取、多重標記、檢測手段靈敏度的提高來實現。FIIA分析所需時間可由 ELISA的1.5 h縮短至6.5 min。Milan Fránek 等[48]用FIIA方法分析阿特拉津、西瑪津和2,4-D的含量,并對混合抗體的反應器的制備進行了嘗試。該方法的不足之處是穩定性較差,抗體和酶標半抗原的使用量較大,一次只能檢測一個樣品,以上方面有待進一步改進。

5 結論與展望

在針對三嗪類除草劑的檢測中,研究者們日益注重免疫分析技術的開發和應用,使該領域成為研究熱點。免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的幾個關鍵技術環節,即半抗原及人工抗原的設計合成、抗體的制備以及各種免疫分析技術在三嗪類除草劑檢測中的應用均得到了不斷開發和充實。免疫分析技術將會在三嗪類除草劑殘留快速檢測中發揮越來越重要的作用。目前,市場上已有商業化生產的三嗪類除草劑殘留免疫檢測試劑盒問世。但是該技術的研究和開發應用仍存在很多尚待解決的問題。例如針對一類或一種三嗪類除草劑分子的特異性半抗原的設計合成,高效的標準化抗體的生產技術以及多殘留檢測技術的研發等都有待進一步完善,以上問題的深入研究必將成為免疫技術在三嗪類除草劑檢測中未來的發展方向。

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Researchprogressofimmunoassayonthedetectionoftriazineherbicides

HANZheng-zheng1,LIUYuan1,2,WANGJian1,2,*,ZHANGJun-hua1,HUANGWei1

(1.College of Agriculture and Forestry Science and Technology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China; 2.Food Safety Research Center,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China)

In the detection of triazine herbicides,the development of immunoassay has gotten more and more social attention and it has been the research hotspots. In this study,several key steps of immunoassay on the determination of triazine herbicides were introduced. These steps contained design and synthesis of hapten and artificial antigen,preparation of antibody and the application of many kinds of immunoassay on the detection of triazine herbicides. Besides,the current problems and the prospect of the field were also discussed.

immunoassay;triazine;hrbicides;pesticide residues

2017-01-11

韓正政(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：農藥殘留檢測技術，E-mail:498233705@qq.com。

*通訊作者:王健(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品安全檢測技術，E-mail:xuanyuanjian0228@126.com。

河北省現代農業技術體系蔬菜產業創新團隊建設項目(HBCT2013050208)；國家公益性行為(農業)科研專項(201203094)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)16-0324-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.061