添加含磷與非磷保水劑對牦牛肉肉糜蛋白質氧化的影響

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(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

添加含磷與非磷保水劑對牦牛肉肉糜蛋白質氧化的影響

張杰,唐善虎*,李思寧,鄭渝川,侯曉衛

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

以添加復合磷酸鹽、乳酸鈉和檸檬酸三鈉作為保水劑制作牦牛肉肉糜,以不添加任何保水劑處理的為對照,通過測定牦牛肉肉糜色度值、表面疏水性、總巰基含量和羰基含量,探討三種保水劑的抗蛋白氧化性,并比較三者抗蛋白氧化性的差異。實驗結果表明:在4 ℃冷藏條件下,7 d貯藏期間,保水劑確實可以延緩肉糜的蛋白氧化,保水劑的種類顯著影響牦牛肉肉糜中蛋白質的氧化程度(p<0.05);其中檸檬酸三鈉對肉色的改善效果最佳,在第7 d時比其它組的色度值都低為1.26;復合磷酸鹽對降低蛋白質表面疏水性的效果最好,在第7 d時表面疏水性為108.70 nmol/mg,僅比第1 d增加了12.73%;乳酸鈉對保護蛋白質巰基和減少羰基生成的效果最好,在第7 d時與其它組相比巰基值最大為94.94 nmol/mg,羰基值最小為25.25 nmol/mg。本研究為減少肉制品中蛋白質氧化提供了新途徑。

肉糜,復合磷酸鹽,保水劑,蛋白質氧化

在過去的十幾年人們對脂類的氧化已經做了深入探討,但卻忽略了蛋白氧化在食品體系中的影響。直到最近幾年,人們才逐漸認識到蛋白氧化對食品和人體健康造成的危害,就有部分學者對其進行研究。Lund等[1]研究發現高氧的氣調包裝會導致豬背最長肌的蛋白發生氧化,從而增加滴水損失,降低肉的嫩度;Liu等[2]的研究發現蛋白質被氧化后,其消化率下降,營養價值降低;Ooizumi等[3]發現蛋白質氧化后的產物易與其他物質作用,改變蛋白原有的性能如凝膠性等。為了降低蛋白氧化程度,有學者通過添加抗氧化劑來延緩,例如秦春君[4]的研究發現三種植物酚類(迷迭香酚類物質、蘋果酚類物質、葡萄籽酚類物質)具有突出的抗氧化活性,這種性質與螯合肌紅蛋白中鐵離子,抑制高鐵肌紅蛋白的生成有關。彭新穎等[5]將乳清分離蛋白(WPI)的水解產物用于生肉糜的加工中,發現WPI水解物可以有效的抑制食物的氧化。除了以上抗氧化劑外,現已發現部分保水劑也具有一定的抗氧化性。例如有研究表明磷酸鹽有一定的抗氧化性[6],具體表現在可以延緩蛋白質中巰基的氧化變化、防止肉制品的變色(肌紅蛋白的氧化)等[7],在食品加工中常將多種磷酸鹽互配使用以達到既保水又抗氧化的目的;乳酸鈉是水分保持劑,但最初卻作為肉及肉制品中的抗菌劑[8]使用,最近幾年的研究成果證實了乳酸鹽類在改善牛肉的色澤方面也有一定的效果[9];檸檬酸三鈉又名檸檬酸鈉,在食品、飲料工業中用作酸度調節劑、風味劑和穩定劑,后有文獻報道可提高肉的離子強度、pH和螯合金屬離子[10],因而對蛋白質的氧化也有一定緩解作用。但是有關不同保水劑在肉制品中抗蛋白氧化性能的比較卻幾乎沒有報道,特別是在牦牛肉肉糜的產品加工中尚無報道。

因此,本研究通過測定牦牛肉肉糜在儲藏期間色澤、表面疏水性、巰基含量和羰基含量四指標的變化,探討保水劑對牦牛肉肉糜中蛋白質氧化是否具有緩解作用,并將非磷保水劑(乳酸鈉和檸檬酸三鈉)與含磷保水劑(復合磷酸鹽)作對比,探討三種保水劑的抗蛋白氧化性,并比較三者抗蛋白氧化性的差異。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

牦牛肉 選取由四川省阿壩紅原縣國中食品有限責任公司提供自然放牧、健康無病牦牛的腿肌,屠宰后去除多余的脂肪,-20 ℃下貯藏;復合磷酸鹽(六偏磷酸鈉∶焦磷酸鹽∶三聚磷酸鈉=1∶2∶1)、乳酸鈉、乳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸三鈉、氯化鈉(NaCl)、鹽酸(HCl)、二硝基苯腙(DNPH)、三氯乙酸(TCA)、乙醇、磷酸、乙酸乙酯、鹽酸胍、溴酚藍(BPB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 均購于成都科龍化工試劑廠;考馬斯亮藍試劑 天津市天新精細化工開發中心;5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、牛血清白蛋白 美國Sigma。

TDZ5-WS離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司;LD510電子秤 沈陽龍騰電子有限公司;UV-1000紫外可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限責任公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;CR-400型色差儀 日本Minolta公司;MP511型實驗室pH計 上海三信儀表廠;Joyoung/九陽JYL-D05絞肉機 九陽股份有限公司;FSH-2A可調高速組織勻漿機 江蘇金壇市醫療儀器廠;QL-901漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 牦牛肉肉糜的制作 將牛肉去除筋膜洗凈后,用絞肉機絞碎,隨機分成四組每份肉糜的質量為50 g,第一組為空白對照未做任何處理;第二組加入復合磷酸鹽0.3%(焦磷酸鈉∶三聚磷酸鈉∶六偏磷酸鈉=2∶1∶1);第三組加入乳酸鈉0.2%;第四組加入檸檬酸三鈉1.2%,并且各處理組同時加入0.15%氯化鈣和0.25%乳酸鈣。充分混勻后制成肉餅并用保鮮膜包裹放入盒中,于4 ℃保存,在第1、3、5、7 d測定各指標。

1.2.2 指標的測定方法

1.2.2.1 色度值的測定 使用色差計分別測定第1、3、5、7 d的a*值和b*值,每塊肉糜取3個點進行測定,計算色度值Y,然后取平均值[11]。

Y=b*/a*

式中,Y代表色度值,b*為黃色度,a*表示紅色度。

1.2.2.2 牦牛肉中肌原纖維蛋白的提取 參考Koutina等人[12]的方法并稍有修改。具體步驟為:取4 ℃冷藏經處理的牦牛肉肉糜3 g,添加于其4倍體積的0.05 mol/L Na2HPO4提取緩沖溶液(0.1 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA,用HCl調pH至7.0)經勻漿至均質液,離心15 min(2000 r/min),棄上清液,重復以上操作兩次。將經過三次提取的沉淀與4倍體積0.1 moL/L NaCl漂洗液,勻漿30 s,離心15 min(2000 r/min),棄上清液,加入8倍體積0.1 moL/L NaCl的漂洗液后再勻漿,用4層的紗布過濾去除結蹄組織后,用0.1 mol/L HCl調整溶液的pH為6.0,離心15 min(2000 r/min),棄上清液,將沉淀密封于容器中冷藏,于24 h內測定相關指標的變化。蛋白質濃度的測定參照考馬斯亮藍G-250法,用標準牛血清白蛋白做標準曲線。

1.2.2.3 牦牛肉肉糜肌原纖維蛋白表面疏水性的測定 根據Chelh等[13]使用的方法測定牦牛肉肉糜肌原纖維蛋白的表面疏水性。將肌原纖維蛋白溶解于20 mmol/L,pH6.0的磷酸鹽緩沖溶液中,使蛋白質的濃度變為5 mg/mL,取1 mL的蛋白溶液加入200 μL的溴酚藍(BPB,1 mg/mL)溶液后混勻室溫下放置10 min,然后離心15 min(7000 r/min),將上清液稀釋10倍后在595 nm下測定吸光度值A。實驗空白樣為未加樣品的磷酸鹽緩沖溶液。用溴酚藍的含量表征蛋白質的表面疏水性,表面疏水性的計算公式如下:

1.2.2.4 牦牛肉肉糜肌原纖維蛋白中巰基含量的測定 按照Koutina等[12]報道的方法并有改動。取1 mL濃度約為4 mg/mL的蛋白溶液加入4 mL含有6 mol/L鹽酸胍、1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.3),混合均勻后取4.5 mL樣品溶液加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的100 mmol/L Tris-HCl溶液(pH7.6)混合,在25 ℃下靜置25 min,對照組用提取緩沖液代替樣品,在412 nm處測定其吸光值。巰基含量(nmol/mg蛋白)使用摩爾吸光系數13600 L·mol-1·cm-1。

1.2.2.5 牦牛肉肉糜肌原纖維蛋白中羰基含量的測定 采用DAPH比色法[14],取1 mL 4 mg/L的肌原纖維蛋白溶液放入離心管中,每管中加入1 mL 10 mmoL/L的DNPH溶液,并設置一組空白對照,將反應體系放于黑暗中室溫(25 ℃)反應40 min,并且每隔5 min漩渦振蕩一次使反應充分。隨后加入1 mL 20%的TCA(三氯乙酸溶液),搖勻后離心(12000 r/min,10 min,4 ℃),棄上清液。沉淀用1 mL的乙醇-乙酸乙酯溶液(體積比為1∶1)洗滌3次,避免DNPH的干擾。最后將沉淀溶解于3 mL,6 mol/L的鹽酸胍溶液,于37 ℃水浴15 min。將溶液在12000 r/min的條件下離心5 min,取上清液于紫外分光光度計370 nm的條件下測定吸光度值。蛋白質羰基衍生物的含量(nmol/mg 蛋白)用摩爾消光系數為22000 L/(mol·cm)計算。

表1 各組樣品在4 ℃儲藏期間色度值的變化Table 1 Changes of chromatic value of each sample during storage at 4 ℃

注:表中同一時間不同的小寫字母表示添加不同保水劑對肉糜色澤影響的差異顯著性(p<0.05)。

表2 各組樣品在4 ℃儲藏期間蛋白質溴酚藍結合量的變化Table 2 Changes of bromophenol blue combination of each sample during storage at 4 ℃

注:表中數據為均值±標準差,同列上標字母不同表示差異顯著(p<0.05)；表3、表4同。1.3數據處理

數據使用SPSS V19.0統計軟件計算出3次重復測量所得的平均值,以平均值±標準差的形式表達,并進行ANOVA分析和Duncan顯著性檢驗,不同顯著性數據用不同字母標記。

2 結果與分析

2.1添加不同保水劑對牦牛肉肉糜色澤的影響

肉的顏色是衡量肉品質好壞的一項重要指標,人們可以通過視覺加以鑒別,從而判斷肉質。肌紅蛋白是肉的呈色物質,它有脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白三種存在形式,三者之間的比例決定了肉色,其中高鐵肌紅蛋白是不被期望的肉色,含量越高表示褐變越嚴重[15-16]。

由表1可知,四組樣品的肉色色度值隨著時間的延長都不同程度地上升即肉色都逐漸偏黃。經過處理的牦牛肉肉糜的色澤好于未處理組。從第1～7 d,未處理組的色度值始終最大,檸檬酸三鈉組的色度值始終最小;將各處理組內部相比較發現肉色在前3 d時變化不顯著(p>0.05),3 d后顏色均發生了顯著的變化(p<0.05);在貯藏的7 d內,復合磷酸鹽和乳酸鈉對肉色的護色效果無顯著性差異(p>0.05)。三種添加劑對肉色有護色作用的原因是:復合磷酸鹽的加入可以改變離子濃度,影響金屬離子與血紅素鐵的相互作用,從而使肌紅蛋白的穩定性提高[17],故對肉色變黃有延緩作用;乳酸鈉因在肉中酶的作用下可以生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,從而使高鐵肌紅蛋白還原酶的活性變大,抑制褐變反應[18];檸檬酸三鈉可以提高pH,較高的pH環境可以增加肌紅蛋白的穩定性[19]。綜上所述,復合磷酸鹽、乳酸鈉和檸檬酸三鈉都可以抑制肌紅蛋白的氧化,減緩高鐵肌紅蛋白的形成,從而達到提高肉色穩定性的目的,三者中檸檬酸三鈉的改善效果最佳,在第7 d時色度值最小為1.26。

2.2添加不同保水劑對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質結構保持穩定的一大要素是疏水基團與親水基團之間的平衡,且疏水相互作用是穩定蛋白質結構最重要的作用力,它會影響蛋白質與其他分子之間的相互作用[20]。疏水基團都埋藏于蛋白質結構的內部,只有蛋白質的高級結構發生變化如裂解、氧化等,這些疏水性殘基才會被暴露。吳偉[21]的研究發現氧化能夠改變蛋白質的構象,使內部的疏水基團暴露導致蛋白質的表面疏水性增大。Li等[22]的研究也發現蛋白質空間結構的展開會導致蛋白質表面疏水性的增加。因此測定蛋白質的表面疏水性在一定程度上可以反映其表面疏水性氨基酸的相對含量,從而體現蛋白質結構的變化程度,進一步推知蛋白質的氧化程度。

表3 各組樣品在4 ℃儲藏期間總巰基含量變化Table 3 Changes of total sulfhydryl content of each sample during storage at 4 ℃

表4 各組樣品在4 ℃儲藏期間總羰基含量變化Table 4 Changes of total carbonyl content of each sample during storage at 4 ℃

肌原纖維蛋白表面疏水性的測定參考了Chelh[13]的測定方法,用溴酚藍的結合量來表征蛋白質的疏水性;溴酚藍的結合量越大,則蛋白質的表面疏水性越大。由表2可知隨著時間的延長，各組的溴酚藍結合量都變大,但處理組中溴酚藍結合量隨時間的變化相對于未處理組的變化要小。在貯藏第1、3 d時,未處理組、復合磷酸鹽組和乳酸鈉組的組內間溴酚藍結合量變化顯著(p<0.05),但檸檬酸三鈉組內間溴酚藍結合量變化不顯著(p>0.05);在貯藏第5、7 d時,各處理組內部間差異不顯著(p>0.05),可能是由于鹽溶性的肌原纖維蛋白在低濃度的鹽溶液中疏水基團的暴露程度很低,從而對肌原纖維蛋白表面疏水性影響小[23];或者低濃度的鹽進入肌原纖維的內部,使內部的巰基發生交聯,而對蛋白質的空間結構影響小,蛋白質結構展開程度低,從而疏水性變化不明顯[24]。但是,添加復合磷酸鹽的處理組溴酚藍結合量始終最低,且貯藏第7 d與第1 d的增加量也比其它組小為13.84 μg。綜上所述,經復合磷酸鹽處理的牦牛肉肉糜對蛋白質疏水性的影響最小,其次為檸檬酸三鈉和乳酸鈉。

2.3添加不同保水劑對肌原纖維蛋白巰基含量的影響

肉中的蛋白質主要分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和基質蛋白三大類,其中肌原纖維蛋白中的肌球蛋白含有巰基最多,大約有40多個,位于肌球蛋白的頭和尾部。但是蛋白結構的變化會導致巰基的位移[25]。巰基是一種具有高反應活性的基團,部分埋藏于蛋白質的內部,環境的變化往往會使它暴露,發生氧化,形成二硫鍵或者進一步氧化為磺酸類以及其它產物[26],從而導致蛋白質變性。通常蛋白質氧化程度與巰基含量成反比[27]。但是巰基的減少可能是氧化形成了二硫鍵,也可能是蛋白質發生了降解[28]

由表3可知，四組樣品中總巰基含量都經歷了先升高后下降的變化趨勢,其中未處理組無論是升高還是下降變動幅度都最大。在第3 d時各組的總巰基含量均上升,可能是由于氧化破壞蛋白質的空間結構使本埋藏在內部的巰基大量的暴露,所以總巰基含量升高,或者是由于內源性酶的作用使蛋白質聚合體展開,逐步分解使巰基不斷暴露[29]。而巰基的氧化又是一個快速的過程,所以在第5 d時各組中總巰基含量明顯減少(p<0.05)。復合磷酸鹽組相比于其它處理組,巰基的含量偏低,在第7 d時巰基的含量最低,含量為77.60 nmol/mg,即復合磷酸鹽對巰基的保護能力較差,分析原因可能是其中的三聚磷酸鈉發生了水解,使蛋白質結構松散、展開,導致本埋藏在內部的巰基暴露發生氧化,從而使總巰基減少[7];檸檬酸三鈉和乳酸鈉處理組對巰基的保護好,在第7 d時的含量分別為89.49 nmol/mg和94.94 nmol/mg,分析原因可能是其離子態可以螯合金屬離子,從而降低了蛋白質的氧化程度[30]。實驗結果表明:復合磷酸鹽、乳酸鈉和檸檬酸三鈉在一定程度上都能夠緩解牦牛肉中肌原纖維蛋白巰基含量的減少,但是乳酸鈉的效果最好。

2.4添加不同保水劑對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

羰基是有機官能團由碳氧原子通過雙鍵連接形成,可由易受自由基攻擊的含有NH2或NH的肽鍵及氨基酸側鏈的斷裂產生,例如可直接由精氨酸、脯氨酸或者賴氨酸的殘基氧化形成或者蛋白質發生α-酰胺反應在N段形成α-酮酯酰衍生物,再被氧化為羰基[31]。羰基是蛋白質氧化損傷的主要標志性物質[32],且相對較容易測定。

由表4可以看出，四組的總羰基含量都呈上升趨勢,分析原因可能是牦牛肉肉糜中的肌原纖維蛋白里含有可以促進蛋白質氧化的物質,例如:金屬離子、亞鐵血紅素以及各種氧化酶,因此隨著時間的延長,總羰基含量增加。但是氧化的程度因添加的保水劑種類不同而異,其中未處理組的上升趨勢最明顯,且在第7 d時羰基含量最高為44.48 nmol/mg;其次為復合磷酸鹽,從第1 d的6.73 nmol/mg上升到了37.48 nmol/mg,分析原因可能是在較高濃度的鹽溶液中,肌肉易失水,從而導致蛋白質更易變性;與其余各組相比,在第7 d時總羰基含量最低的為乳酸鈉,即25.25 nmol/mg。以上結果均說明無磷保水劑乳酸鈉和檸檬酸三鈉在降低羰基含量方面優于含磷保水劑復合磷酸鹽,且無磷保水劑中乳酸鈉的效果最好。

3 結論

本實驗重點研究了添加不同保水劑對肉糜色澤和肌原纖維蛋白氧化程度的影響,通過對比未處理組、添加含磷保水劑組和無磷保水劑組的實驗結果,得到以下結論:

3.1 未處理組的各項指標都明顯比處理組差(p<0.05),可見三種保水劑復合磷酸鹽、乳酸鈉、檸檬酸三鈉對牦牛肉肉糜肌原纖維蛋白質的氧化都有一定的緩解作用,但是隨著貯藏時間的延長,蛋白的氧化程度還是有所上升,可見保水劑對于維持理性狀態的效果不理想。

3.2 保水劑的種類影響其作用效果,其中檸檬酸三鈉對肉色的改善效果最佳,復合磷酸鹽對降低蛋白質表面疏水性的效果最好,乳酸鈉對保護蛋白質巰基和減少羰基含量的效果最好。

3.3 無磷保水劑在延緩蛋白質氧化方面優于含磷保水劑。

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Effectsofphosphorusandphosphorus-freeagentonproteinoxidationofyakmeatbatters

ZHANGJie,TANGShan-hu*,LISi-ning,ZHENGYu-chuan,HOUXiao-wei

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

With no addition of any water-holding agent as the control group,compound phosphate,sodium lactate and trisodium citrate was added to prepare yak meat batters. Color value,surface hydrophobicity,total sulfhydryl content and carbonyl content of yak meat batters were determined,and the capacities for protein oxidation were compared among different treatments. The results showed that during the 7 days of storage at 4 ℃,water retaining agents could defer protein oxidation,and the types of agent significantly affected the extension of oxidation of protein in yak meat batters(p<0.05). Among them,the effect of trisodium citrate on the improvement of flesh color was best,and the color value was 1.26 which was the lowest than other groups at the 7th day. The effect of compound phosphate on surface hydrophobicity was best,and the value was 108.70 nmol/mg which was only increased by 12.73% on the 7th day. The effect of sodium lactate on the protection of total sulfhydryl and the reduction of carbonyl content was best. At the 7th day,compared with other groups the maximum of total sulfhydryl content was 94.94 nmol/mg and the minimum of carbonyl content was 25.25 nmol/mg in sodium lactate group. This study provided a new way to reduce the oxidation of protein in meat products.

batters;compound phosphate;water retaining agents;protein oxidation

2017-01-09

張杰(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全，E-mail：1019460876@qq.com。

*通訊作者:唐善虎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：stang01@126.com。

國家科技支撐計劃(2015BAD29B02)；四川省科技支撐計劃項目(2016NZ0005)。

TS251.52

:A

:1002-0306(2017)16-0234-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.044