植物乳桿菌YS-1對惡唑酮誘導BALB/c小鼠結腸炎的預防作用

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(1.重慶第二師范學院重慶市功能性食品協同創新中心,重慶 400067; 2.重慶第二師范學院重慶市功能性食品工程技術研究中心,重慶 400067; 3.重慶第二師范學院功能性食品研發重慶市工程實驗室,重慶 400067; 4.重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶 400067)

植物乳桿菌YS-1對惡唑酮誘導BALB/c小鼠結腸炎的預防作用

孫鵬1,2,3,4,易若琨1,2,3,4,趙欣1,2,3,4,*

(1.重慶第二師范學院重慶市功能性食品協同創新中心,重慶 400067; 2.重慶第二師范學院重慶市功能性食品工程技術研究中心,重慶 400067; 3.重慶第二師范學院功能性食品研發重慶市工程實驗室,重慶 400067; 4.重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶 400067)

利用動物實驗,就植物乳桿菌YS-1(LP-YS1)對結腸炎的預防效果進行研究。實驗將小鼠分為五組,分別為正常組、模型組、LB(保加利亞乳桿菌)處理組、低、高濃度LP-YS1(植物乳桿菌YS-1)處理組,分別涂抹(0.20 mL)和灌腸(0.15 mL)1%惡唑酮溶液誘導BALB/c小鼠結腸炎。分別檢測各組小鼠疾病活動指數(DAI)值、結腸重量/結腸長度比值、血清細胞因子水平(IL-2和IL-10)和結腸組織抗氧化相關指標(MPO、NO、MDA、GSH)和nNOS、eNOS、iNOS、c-Kit、SCF、IL-8、CXCR2等的mRNA表達。實驗結果顯示,LP-YS1顯著降低(p<0.05)結腸炎小鼠的DAI,并能抑制結腸炎造成的結腸長度縮短,提高結腸重量/結腸長度比值,還可顯著降低(p<0.05)結腸炎小鼠結腸組織MPO、NO、MDA活性和提高GSH活性,并顯著提高(p<0.05)結腸炎小鼠血清中的IL-2水平和降低IL-10細胞因子水平。RT-PCR結果表明,LP-YS1可顯著上調(p<0.05)結腸炎小鼠結腸組織中的nNOS、eNOS、c-Kit、SCF表達和下調iNOS、IL-8、CXCR2表達。LP-YS1結腸炎具有良好的預防效果,且高濃度的LP-YS1具有更好的預防效果。

植物乳桿菌,惡唑酮,結腸炎,BALB/c小鼠，mRNA表達

潰瘍性結腸炎(UC)是一種炎癥性腸病,并且具有癌變的潛在危險,發病年齡多在20～50歲,嚴重地威脅生活質量[1]。UC的發病機制和治療方法是目前的研究熱點;發現病癥,并且維持病癥不加劇是控制和治療UC的重要原則[2]。臨床上治療UC的藥物在長期服用后都會產生副作用,尋找無副作用的能緩解UC的功能性食品也是UC研究的一個重要方面[3]。目前的研究表明,腸道菌群與UC有密切的聯系,腸道菌群參與了黏膜免疫反應,細菌是炎癥性腸病的重要促發因素,通過調節腸道菌群,防止菌群失調,增加益生菌數量,有助于緩解UC[4-5]。

牦牛酸乳是一種青藏高原少數民族地區常見的自然發酵食品,營養成分十分豐富。研究表明,牦牛酸乳有多種生理活性作用,包括抗氧化、降低膽固醇和提高免疫力[6]。青藏高原地區具有特殊的自然發酵環境,同時牦牛乳、藏族特有的發酵器皿,包括特殊的發酵微生物,都使牦牛酸乳的風味及品質與普通發酵乳有較大差異[7]。本研究中使用的植物乳桿菌YS-1(LactobacillusplantarumYS-1，LP-YS1)是從青海玉樹藏族自治州的牦牛酸乳中分離、純化和鑒定后得到的一株具有良好體外抗胃酸、抗膽鹽效果的植物乳桿菌。前期對青藏高原牦牛酸乳中乳酸菌的腸道生理活性作用進行了初步研究,發現牦牛酸乳分離乳酸菌具有抗氧化作用[8]和便秘預防效果[9]。在本研究中以LP-YS1為研究對象,首次觀察了LP-YS1對惡唑酮誘導結腸炎的預防作用,研究結果將對進一步開發LP-YS1積累一定的理論依據,有利于LP-YS1的開發利用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

惡唑酮 美國Sigma公司;MPO、NO、GSH、MDA、SOD測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;IL-2、IL-10血清細胞因子測定試劑盒 美國BioLegend公司;Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉錄酶 美國Invitrogen公司;ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II 日本TAKARA公司;RT-PCR引物nNOS、eNOS、iNOS、c-Kit、SCF、IL-8、CXCR2 天根生化科技有限公司;其余試劑 均為國產分析純;植物乳桿菌YS-1 由本研究組從青海玉樹地區自然發酵牦牛酸乳中分離,保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏號:CCTCC M 2016747);保加利亞乳桿菌(20249) 購自中國工業微生物菌種保藏管理中心;雄性7周齡SPF級BALB/c(體重25～30 g)小鼠50只 購自重慶醫科大學動物實驗中心,動物許可證號:SCXK(渝)2012-0001。

Biomate3S紫外可見光分光光度儀、A200PCR儀、LUX多功能性酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;Tancon2500PCR凝膠成像儀 上海天能科技有限公司;ICEN-24R高速冷凍離心機 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 動物分組及干預 將50只BALB/c小鼠隨機分成5組:正常組、模型組、LB(保加利亞乳桿菌)處理組、低、高濃度LP-YS1(植物乳桿菌YS-1)處理組,每組10只。正常組和模型組正常飼養,不進行其他處理;LB處理組及低、高濃度LP-YS1處理組小鼠每日分別按濃度1.0×109、1.0×108和1.0×109CFU/mL灌胃2 mL,連續灌胃26 d。實驗開始后第15 d,所有小鼠的腹部按2 cm×2 cm面積進行剃毛,正常組小鼠腹部涂抹0.2 mL 乙醇(99%);其他各組小鼠腹部涂抹0.2 mL惡唑酮溶液(1%質量比,99%乙醇為溶劑)。實驗開始后第19 d,小鼠禁食24 h后,對其實施麻醉(0.1 mL/10 g的水合氯醛),然后用硅膠管鈍頭從小鼠肛門插入腸道深3.5 cm處,正常組小鼠注入0.15 mL的50%乙醇溶液,其他各組小鼠注入0.15 mL的1%惡唑酮溶液(質量比,50%乙醇為溶劑),20 s后拔出導管,同時將小鼠倒置30 s[5]。實驗開始后第26 d對全部小鼠進行斷頸處死并收集血漿,取小鼠結腸組織,對結腸的重量和長度進行測量。同時對疾病活動指數(Disease activity index,DAI)進行測定,DAI=(體重下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3。

表1 DAI評分標準Table 1 The standard of DAI score

1.2.2 小鼠結腸組織中MPO、NO、GSH、MDA和SOD含量的測定 將洗凈的小鼠結腸組織和9倍結腸質量的生理鹽水混合,采用超聲粉碎(600 W、1 min),將結腸組織勻漿,然后按試劑盒說明書對小鼠結腸組織中MPO、NO、GSH和MDA含量進行測定[10]。

1.2.3 小鼠血清炎癥相關細胞因子的測定 取小鼠血清,采用ELISA法按試劑盒說明書測定小鼠血清中的IL-2和IL-10細胞因子含量[10]。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.4 RT-PCR法測定結腸組織相關表達 取小鼠的小腸組織勻漿,加入RNAzol后提取結腸組織的總RNA,然后將總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。取2 μL稀釋后的總RNA 提取液,在其中依次加入1 μL的oligodT18、RNase、dNTP、MLV酶和10 μL的5×Buffer,在條件37 ℃ 120 min,99 ℃ 4 min,4 ℃ 3 min下合成cDNA。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法(94 ℃ 5 min一次,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環30次,72 ℃ 5 min一次)擴增nNOS、eNOS、iNOS、c-Kit、SCF、IL-8和CXCR2的mRNA表達(表2),同時以持家基因GAPDH作為內參進行擴增。最后用含1%溴化乙錠瓊脂電泳檢查PCR擴增產物,并用Image1.44軟件進行半定量分析[10]。

1.3數據統計

將所有實驗測定重復進行三次,然后取三次實驗結果的平均值,使用SAS 9.1統計軟件,采用one-way ANOVA方法分析各組數據在α=0.05水平上相互是否具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 LP-YS1對結腸炎癥狀的影響

表3 各組小鼠的DAI值Table 3 DAI value of each group mice

注:不同字母表示差各組之間存在顯著差異(p<0.05);表4～表9同。

由表3可知,用惡唑酮灌腸小鼠后,模型組小鼠的DAI值逐漸增加,且顯著(p<0.05)高于其他4組。正常組小鼠的DAI值在整個實驗周期中均顯著(p<0.05)低于其他各組,LB處理組小鼠的DAI略高于LP-YS1低濃度處理組,但顯著(p<0.05)高于LP-YS1高濃度處理組。結腸炎會導致機體體重減輕并出現腹瀉和出血等癥狀,以體重、大便性狀和便血作為計分標準的DAI可以作為衡量結腸炎程度的標準[9]。DAI指數顯示LP-YS1可以顯著(p<0.05)降低惡唑酮誘導的結腸炎癥狀,且隨著LP-YS1濃度的增加效果更為明顯。結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值同樣也是結腸炎程度的標準,結腸炎小鼠的結腸長度較正常小鼠更短、結腸重量/結腸長度比值更低[11]。本研究的實驗結果顯示,LP-YS1高濃度處理組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度比值顯著(p<0.05)低于正常組小鼠,但高于其他各組(表4)。同時。LP-YS1低濃度處理下小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度比值略高于LB處理組。

表4 各組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度比值Table 4 Colon length and colon weight/colon length of each group mice

2.2 LP-YS1對小鼠結腸組織MPO、NO、GSH和MDA水平的影響

由表5可知,模型組小鼠結腸組織中的MPO、NO、MDA水平最高,GSH水平最低。相比于模型組,LB和LP-YS1灌胃均可以顯著降低(p<0.05)結腸炎小鼠結腸組織中的MPO、NO、MDA水平和提高GSH水平,且高濃度的LP-YS1作用最強,使MPO、NO、MDA水平僅高于正常組小鼠,而GSH水平僅低于正常組小鼠(p<0.05)。結腸中MPO(髓過氧化物酶)活性增加表明發炎組織中中性粒細胞聚集降低[12]。在結腸炎癥過程中iNOS生成NO會加劇結腸組織的損傷,而且隨著NO的含量增加,MPO活性也隨之增強,使得炎癥加劇[3]。結腸炎還可以導致ROS(活性氧)和RNS(活性氮)大量產生,繼而引發氧化應激毒性反應,使結腸組織發生炎癥損傷[13]。發生炎癥反應后ROS的大量生成將破壞機體氧化/抗氧化平衡,降低結腸組織中的GSH的含量,大量的脂質過氧化反應加劇脂質過氧化的終產物MDA的產生[14]。

表5 各組小鼠結腸組織的MPO、NO、GSH和MDA含量Table 5 MPO,NO,GSH and MDA contents of colon tissue of each group mice

表7 LP-YS1對小鼠結腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達的半定量分析(相對對照組表達倍數)Table 7 Semi-quantitative analysis mRNA expression of nNOS,eNOS and iNOS of LP-YS1 on colon tissue of mice(folds of control group)

2.3 LP-YS1對小鼠血清細胞因子IL-2和IL-10水平的影響

由表6可知,模型組小鼠血清的IL-2水平顯著低于正常組(p<0.05),但IL-10水平顯著高于正常組(p<0.05)。乳酸菌灌胃后,LP-YS1高濃度處理組的IL-2水平顯著高于(p<0.05)LP-YS1低濃度處理組、LB處理組和模型組,同時,LP-YS1低濃度處理組和LB處理組的IL-2水平也顯著高于(p<0.05)模型組。而小鼠血清IL-10的水平則呈現相反的趨勢,LP-YS1高濃度處理組僅顯著高于正常組(p<0.05),LP-YS1低濃度處理組則顯著低于模型組(p<0.05)。惡唑酮誘導的結腸炎是一種Th2細胞介導的炎癥,炎癥產生的機制是Th2/Th1之間的免疫網絡失衡導致炎腸炎,細胞因子IL-2和IL-10分別由Th1和Th2細胞產生,均與結腸炎直接相關,過低的IL-2水平和過高的IL-10水平均意味結腸炎程度加深[4]。

表6 各組小鼠血清細胞因子IL-2和IL-10水平的影響Table 6 IL-2 and IL-10 serum levels of each group mice

2.4 LP-YS1對小鼠結腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達的影響

由圖1和表7可知,相對于模型組,LP-YS1和LB處理組小鼠結腸中nNOS、eNOS表達更高(p<0.05),iNOS表達更低(p<0.05),且LP-YS1高濃度處理組效果優于LP-YS1低濃度處理組和LB處理組。NOS分為神經型NOS(nNOS)、內皮型NOS(eNOS)和誘生型NOS(iNOS),研究證實eNOS產生的NO對控制結腸組織損傷有關鍵作用,iNOS產生的過量NO則加速結腸炎癥損傷,nNOS下調也使iNOS表達加強同時大量釋放NO[15]。

圖1 LP-YS1對小鼠結腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達的作用Fig.1 Effects of LP-YS1 on nNOS,eNOS and iNOS mRNA of colon tissue of mice

2.5 LP-YS1對小鼠結腸組織c-Kit和SCF mRNA表達的影響

由圖2和表8可知,相對于模型組,LB和LP-YS1可以顯著(p<0.05)上調c-Kit和SCF mRNA表達,且高濃度的LP-YS1處理小鼠結腸中的c-Kit和SCF表達顯著(p<0.05)高于除正常組外其他組小鼠。潰瘍性結腸炎不僅表現出腹瀉和便血,同時還出現結腸動力紊亂,研究證明ICC(Cajal間質細胞)與結腸動力有關,從而直接參與結腸炎進程[16]。出現炎癥性腸病時,SCF對維持ICC數量和功能有直接作用,SCF是c-Kit的天然配基,SCF/Kit信號途徑受到損傷后ICC的增殖和分化均會下降,從而加重結腸炎[17]。

圖2 LP-YS1對小鼠結腸組織c-Kit和SCF mRNA表達的作用Fig.2 Effects of LP-YS1 on c-Kit and SCF mRNA of colon tissue of mice

組別c-Kit表達SCF表達正常組3.74±0.33a12.40±0.68a模型組1.00±0.16e1.00±0.08dLB處理組2.38±0.20d4.82±0.26cLP-YS1低濃度處理組2.61±0.22c4.88±0.24cLP-YS1高濃度處理組3.43±0.27b10.27±0.59b

2.6 LP-YS1對小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達的影響

由圖3和表9可知,模型組小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達顯著高于其他各組(p<0.05),高濃度LP-YS1處理組小鼠結腸中的IL-8和CXCR2 mRNA表達顯著(p<0.05)低于除正常組外其他各組小鼠,低濃度LP-YS1處理組小鼠的表達與LB處理組接近,均低于模型組(p<0.05)。IL-8有炎性活性和趨化作用,CXCR2是IL-8受體,IL-8和CXCR2均與結腸癌的發病有關,研究也證實結腸癌狀態下會出現IL-8和CXCR2的高表達[18],本研究也得到了相似的結果。

圖3 LP-YS1對小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達的作用Fig.3 Effects of LP-YS1 on IL-8 and CXCR2 mRNA of colon tissue of mice

表9 LP-YS1對小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達的半定量分析(相對對照組表達倍數)Table 9 Semi-quantitative analysis of mRNA expression of IL-8 and CXCR2 of LP-YS1 on colon tissue of mice(folds of control group)

3 結論

研究LP-YS1對惡唑酮誘發的結腸炎小鼠的抑制作用,實驗結果顯示LP-YS1可以顯著降低結腸炎小鼠的DAI,抑制結腸炎造成的結腸長度縮短,提高結腸重量/結腸長度比值。LP-YS1能明顯降低結腸炎小鼠結腸組織MPO、NO、MDA含量、IL-10水平,并提高GSH含量及血清中的IL-2水平。通過對結腸組織中mRNA水平的檢測還發現LP-YS1可以上調nNOS、eNOS、c-Kit、SCF表達和下調iNOS、IL-8、CXCR2表達。由此可以看出LP-YS1可以有效的預防惡唑酮誘導的結腸炎,具有益生菌開發的潛質。

[1]樊慧麗,陳玉梅. 潰瘍性結腸炎的發病機制和治療進展[J]. 中國全科醫學,2012,15(1B):228-230.

[2]孫芳美. 潰瘍性結腸炎的發病機制與治療進展[J]. 中國醫藥指南,2012,10(12):445-447.

[3]韋宜賓,劉錕榮,陳國忠. 中藥治療潰瘍性結腸炎研究進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報,2015,17(3):222-224.

[4]崔海宏,陳村龍,孫勇,等. 潰瘍性結腸炎患者腸黏膜菌群改變及抗體反應[J]. 中國微生態學雜志,2003,15(3):151-155.

[5]孫勇,丁彥青. 潰瘍性結腸炎患者腸道菌群與病理變化關系的探討[J]. 現代消化及介入診療,2009,14(1):26-28.

[6]吳春生,舒暢,李鍵,等. 牦牛酸乳中乳酸菌的研究進展及前景展望[J]. 食品工業,2012(9):135-139.

[7]吳春生,李鍵,騫宇,等. 牦牛乳及牦牛酸乳營養價值的研究現狀[J]. 乳業科學與技術,2012,35(3):43-46.

[8]周小芳,易若琨,趙欣.LactobacillusfermentumZhao的小鼠抗皮膚老化效果[J]. 重慶第二師范學院學報,2016,29(5):160-167,170.

[9]Qian Y,Suo HY,Du MY,et al. Preventive effect ofLactobacillusfermentumLee on activated carbon-induced constipation in mice[J]. Experimental and Therapeutic Medicine,2015,61(9):272-278.

[10]馮霞,趙欣. 不同容器發酵水豆豉預防CCl4誘導肝損傷的研究[J]. 現代食品科技,2016,37(7):338-342.

[11]Strober W,Fuss IJ,Blumberg RS. The immunology of mucosal models of inflammation[J]. Annual Review of Immunology,2002(20):495-549.

[12]Mustafa A,El-Medany A,Hagar HH,et al. Ginkgo biloba attenuates mucosal damage in a rat model of ulcerative colitis[J].

Pharmacological Research,2006,53(4):324-330.

[13]Osman N,Adawi D,Ahrné S,et al. Probiotics and blueberry attenuate the severity of dextran sulfate sodium(DSS)-induced colitis[J]. Digesrive Disease and Sciences,2008,53(9):2464-2473.

[14]Fiocchi C. Inflammatory bowel disease:new insights into mechanisms of inflammation and increasingly customized approaches to diagnosis and therapy[J]. Current Opinion in Gastroenterology,2004,20(4):309-310.

[15]周國勝. 一氧化氮與炎癥性腸病[J]. 安徽醫藥,2002,12(11):1010-1012.

[16]李慧,陸宗海,陳蕾,等. 潰瘍性結腸炎小鼠結腸Cajal間質細胞及干細胞因子的變化[J]. 南京醫科大學學報:自然科學版,2009,29(5):648-651.

[17]Galli SJ,Tsai M,Wershil BK. The c-kit receptor,stem cell factor,and mast cells. What each is teaching us about the others[J]. American Journal of Pathology,1993,142(4):965-974.

[18]朱鋒,王曉兵,劉適,等. CXC趨化因子受體2和白細胞介素-8在炎癥性腸病患者中的表達及其意義[J]. 胃腸病學,2016,21(6):331-335.

PreventiveeffectsofLactobacillusplantarumYS-1onoxazolone-inducedBALB/cmicecolitis

SUNPeng1,2,3,4,YIRuo-kun1,2,3,4,ZHAOXin1,2,3,4,*

(1.Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;3.Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.College of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education, Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

In this study,the colitis preventive effects ofLactobacillusplantarumYS-1(LP-YS1)were studied using an animal experiment. The mice were divided into five groups,which were normal group,model group,LB(Lactobacillusbulgaricus)treated group,low and high concentrations of LP-YS1(LactobacillusplantarumYS-1)treated groups,the research object smeard(0.20 mL)and clystered(0.15 mL)1% oxazolone induced colitis in BALB/c mice were detected respectively. The mice DAI value,colon weight/length ratio,serum(IL-2 and IL-10 cytokine levels)and colon tissue index(MPO,NO,MDA,GSH levels and nNOS,eNOS,iNOS,c-Kit,SCF,IL-8,CXCR2 mRNA expression)were used for determination of preventive effects of LP-YS1. The experiment results showed that LP-YS1 significantly reduced(p<0.05)DAI of colitis mice. It could also inhibit the colon length shortening caused by colitis and increase the weight/length ratio of colon. LP-YS1 could significantly reduce the activity of MPO,NO,MDA and increase the activity of GSH in colon tissue of mice with colitis(p<0.05). LP-YS1 also could significantly increase the serum IL-2 cytokine level and reduce IL-10 level in mice with colitis(p<0.05). RT-PCR results also showed that LP-YS1 could significantly increase(p<0.05)nNOS,eNOS,c-Kit,SCF expression and decrease iNOS,IL-8,CXCR2 expression in colon tissue of mice. Thus,it can be seen that LP-YS1 has a good preventive effect on oxazolone induced experimental colitis.

Lactobacillusplantarum;oxazolone;colitis;BALB/c mouse;mRNA expression

2017-02-07

孫鵬(1983-)，男，碩士，講師，研究方向：食品營養和功能性食品，E-mail:598535244@qq.com。

*通訊作者:趙欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養和功能性食品，E-mail:zhaoxin@cque.edu.cn。

重慶高校創新團隊建設計劃資助項目(CXTD201601040)；重慶市基礎科學與前沿技術研究項目(cstc2016jcyjA0820)；重慶第二師范學院校級科研項目(KY2015TBZC)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)16-309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.058