多功能凈化柱-高效液相色譜法同時檢測食用油中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A

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(1.新疆師范大學化學化工學院,新疆烏魯木齊 830054;2.新疆合普聯科技術檢測研究院,新疆烏魯木齊 831400;3.新疆醫科大學藥學院,新疆烏魯木齊 830011)

多功能凈化柱-高效液相色譜法同時檢測食用油中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A

邢亞楠1,歐陽巧鳳2,王紹坤2,楊斌2,周曉英3,*

(1.新疆師范大學化學化工學院,新疆烏魯木齊 830054;2.新疆合普聯科技術檢測研究院,新疆烏魯木齊 831400;3.新疆醫科大學藥學院,新疆烏魯木齊 830011)

目的:研究并建立高效液相色譜法同時檢測20批食用油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的定量方法。方法:樣品經渦旋、離心提取后,采用多功能凈化柱對目標毒素凈化富集,采用SHIMADZU Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),FLD檢測器,以甲醇-0.5%乙酸水為流動相進行梯度洗脫,進樣量為10 μL,流速為0.8 mL/min,柱溫為35 ℃,改變波長熒光檢測并對方法學進行考察。結果:AFB1在0.25～40.6 ng/mL(r=0.9999),AFG1在0.5～40.4 ng/mL(r=0.9997),AFB2在0.06～10.06 ng/mL(r=0.9999),AFG2在0.06～10.08 ng/mL(r=0.9999),OTA在1.01～50.5 ng/mL(r=1.00)范圍內呈良好線性關系,5種毒素的加標平均回收率為91.40%～109.36%。樣品檢測結果表明,20批食用油樣品中有4批樣品檢測結果呈陽性,均受到黃曲霉毒素G1、G2的污染。結論:該方法準確、快速,能夠廣泛用于食用油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的定量檢測。

多功能凈化柱,高效液相色譜,黃曲霉毒素,赭曲霉毒素A

真菌毒素(mycotoxin)是產毒真菌在適宜的環境條件下產生的有毒代謝產物,目前已知有300多種結構不同的真菌毒素[1]。黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是真菌黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Asperegillusparasiticus)所產生的毒性次生代謝產物[2],已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種[3],其中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)較為常見,AFT是迄今為止發現的毒性最強的一類化合物之一[4],且具有致癌性。早在1993年,AFB1被國際癌癥研究機構(IARC)劃定為I類致癌物[5];赭曲霉毒素(Ochratoxin,OT)是赭曲霉(Asperegillusochraceus)、純綠青霉(Penicilliumviridicatum)和碳黑曲霉(Asperegilluscarbonarius)產生的有毒次級代謝產物[6],它包括7種結構類似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大,不僅有致癌、致畸和致突變作用,并且還具有腎毒性、肝毒性、免疫毒性等毒副作用。歸為ⅡB類致癌物質[7]。AFT和OTA在自然界中污染頻率較高污染范圍較廣,它們易存在于花生、棉籽、玉米、小麥和稻米等農作物中從而帶來食品安全隱憂[8]。

鑒于AFT和OTA的危害,逐漸有國家對其制定了嚴格的限量標準和分析檢測方法[9]。目前為止,用于檢測AFT和OTA的方法主要有酶聯免疫法(ELLSA)[10],它是一種用于快速篩查的定性方法,容易出現假陽性的結果需要進一步確證;液相色譜法(HPLC)[11],常用于化合物的分離與分析同樣具有靈敏快速、高選擇性等優點;液質聯用法(LC-MS/MS)[12],是將色譜與質譜優勢相結合的方法,具有高效快速,靈敏度高等優點但分析成本較高;考慮到經濟與適用性,本實驗選擇HPLC法對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA五種毒素進行分離與檢測。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇、乙腈 色譜純,美國Sigma公司;氯化鈉、冰醋酸 分析純,天津盛森精細化工有限公司;黃曲霉毒素混合對照品:AFB1:2.03 μg/mL、AFG1:2.02 μg/mL、AFB2:0.503 μg/mL、AFG2:0.504 μg/mL 批號:L14311A,Romer Labs;赭曲霉毒素A對照品:OTA:10.01 μg/mL 批號:L13391B,Romer Labs;棉籽油10批、花生油5批、玉米油5批 隨機購于市場。

LC-20A液相色譜系統配備RF-20A熒光檢測器、Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 日本SHIMADZU公司;DC-12氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司;QL-866渦流混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;HC-3018R高速離心機 科大創新有限股份公司;XS105型萬分之一電子天平 德國梅特勒-托利多儀器有限公司;milli-Q超純水機 美國Millippore公司;MycoSep?226多功能凈化柱(5 mL) Romer Labs。

1.2對照品溶液配制

精密吸取200 μL黃曲霉毒素混合對照品、50 μL赭曲霉毒素A對照品溶液分別于10 mL棕色容量瓶,用乙腈溶解并定容,配制成AFB1:40.6 ng/mL,AFG1:40.4 ng/mL,AFB2:10.0 ng/mL,AFG2:10.1 ng/mL,OTA:50.5 ng/mL的混合儲備液,于-20 ℃保存。使用時用乙腈稀釋成AFB1:20.3、10.1、5.07、1.02、0.510、0.255 ng/mL,AFG1:20.2、10.1、5.05、1.01、0.505、0.253 ng/mL,AFB2:5.03、2.51、1.26、0.251、0.126、0.0629 ng/mL,AFG2:5.04、2.52、1.26、0.252、0.126、0.0630 ng/mL,OTA:25.2、10.0、5.05、2.52、1.01 ng/mL的系列黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A混合對照品溶液。

1.3樣品提取、凈化與富集

稱取食用油樣品(25±0.01) g于離心試管,加入5 g NaCl并加入提取液乙腈-水(84∶16,V/V)至100 mL,振蕩,渦旋5 min,靜置,準確吸取10 mL于15 mL離心管中,以10000 r/min離心10 min,取8 mL上清液至MycoSep?226萃取柱的玻璃套管中,將MycoSep?226萃取柱的紅色橡膠頭插入套管內,緩慢將萃取柱推入套管底部,使提取液通過固定相進入管中,取5 mL管中的凈化液置于小試管中,在80 ℃條件下氮氣吹至0.2 mL,用甲醇定容至1 mL,渦旋1 min,過0.45 μL有機濾膜,供HPLC檢測。

1.4色譜條件

色譜柱為SHIMADZU Inertsil ODS-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);以0.5%乙酸為流動相A,甲醇為流動相B,按表1進行梯度洗脫，流速:0.8 mL/min,柱溫:35 ℃,進樣量:10 μL。檢測器為熒光檢測器(FLD)。

表1 梯度洗脫Table 1 The gradient elution program

注:λEx指熒光最大激發波長,λEm指熒光最大發射波長。

1.5數據處理

采用LC Solution軟件進行分析,采用Origin 8.0軟件繪制色譜圖。

2 結果與討論

2.1專屬性

取黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A混合對照品溶液、陰性食用油樣品供試品溶液和加標陰性食用油樣品供試品溶液(添加濃度為AFB1:3 ng/mL,AFG1:3 ng/mL,AFB2:0.8 ng/mL,AFG2:0.8 ng/mL,OTA:4 ng/mL)按1.4中的色譜條件進樣檢測,記錄色譜圖,如圖1～圖3所示。由圖1可知,AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA的保留時間分別為7.6、9.1、10.6、13.1、25.0 min,各色譜峰的分離度均大于1.5。由圖2、圖3可看出,陰性樣品中不存在明顯干擾峰,且選用的MycoSep?226多功能凈化柱能夠針對兩種毒素對樣品進行凈化且效果明顯,表明在選定色譜條件下共存成分對AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA的測定沒有干擾。

表2 線性、LOD和LQD實驗結果Table 2 Results of linear,LOD and LQD

表3 日內與日間精密度實驗結果Table 3 The results of intraday and daytime precision test

圖1 AFT、OTA混合對照品溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram of AFT and OTA standard solution 注:1:AFG2,2:AFG1,3:AFB2,4:AFB1,5:OTA;圖3同。

圖2 經過凈化的陰性樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of negative samples after purified

圖3 經過凈化的陰性加標樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of negative spiking samples after purified

2.2線性關系及檢出限、定量限

取1.2中經稀釋的AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA系列混合對照品溶液,按1.4中色譜條件進樣檢測。以濃度C為橫坐標(x),以所對應的峰面積A為縱坐標(y),做回歸曲線。

根據信噪比S/N=3和S/N=10確定方法檢測限(LOD)和定量限(LQD),AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA的線性回歸方程、變異系數、線性范圍及檢出限、定量限見表2。

結果表明,5種毒素的濃度與峰面積呈良好的線性關系,R2=0.999,LOD和LQD均低于國家標準GB/T 5009.23-2006[15]。

2.3精密度

取AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA的對照品溶液濃度分別為(AFB1:10.1 ng/mL,AFG1:10.1 ng/mL,AFB2:2.51 ng/mL,AFG2:2.52 ng/mL,OTA:10.0 ng/mL),按1.4中的色譜條件,分別在同一天內連續進樣6次和在連續的5 d進樣測定,記錄峰面積見表3,結果顯示,AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA日內與日間RSD=3.0%,表明儀器精密度良好,符合實際檢測要求。

2.4穩定性與重復性

表4 穩定性與重復性實驗結果Table 4 The results of stability and repeatability test

表5 回收率實驗結果Table 5 The results of recovery test

稱取(25±0.01) g食用油陰性樣品,按AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA為10.1、10.1、2.5、2.5、50 μg/kg的添加水平添加混合對照品溶液,按1.3中方法制備供試品溶液,于配制后0、2、4、6、12、24 h分別進樣,記錄峰面積并計算RSD值(表4),結果顯示RSD=4.0%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

稱取(25±0.01) g食用油陰性樣品6份,按AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA為10.1、10.1、2.5、2.5、50 μg/kg的水平添加混合對照品溶液,按1.3中方法制備供試品溶液,分別進樣測定,記錄峰面積(表4)RSD=3.0%,結果表明本方法重復性良好。

2.5回收率

稱取9份陰性食用油(25±0.01) g,分別置于100 mL具塞試管中,分別精密加入含量為AFB1:1.6、3.2、8 μg/kg,AFG1:1.6、3.2、8 μg/kg,AFB2:0.4、0.8、2 μg/kg,AFG2:0.4、0.8、2 μg/kg,OTA:2、4、10 μg/kg,3個濃度水平的的黃曲霉毒素和赭曲霉A毒素的混合對照溶液,每個濃度水平重復3次。按1.3方法制備供試品溶液,每個水平重復三次,回收率計算公式如下:回收率(%)=(加標樣品測得濃度/加標濃度)×100,結果見表5,黃曲霉毒素的平均加樣回收率為91.40%～109.36%,其RSD不高于3.8%,赭曲霉毒素A的平均加樣回收率為93.2%～98.1%,RSD低于3%。表明該方法提取食用油中5種毒素損失較小,方法適用性較好。

2.6樣品分析

稱取食用油(25±0.01) g,按照1.3方法對20批食用油(棉籽油10批、玉米油、花生油各5批)進行提取、凈化和富集,并應用1.4中的方法進行黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的檢測,結果見表6。10批棉籽油中4批檢測結果呈陽性,AFG2的污染水平在2.87～3.46 μg/kg之間,AFG1的污染水平在5.89～16.76 μg/kg之間。

表6 樣品分析檢測結果Table 6 The results of sample analysis

注:-表示未檢出。3結論

本研究建立了多功能凈化柱-高效液相色譜法同時檢測20批食用油樣品中AFT和OTA含量的方法,結果表明,其中有4批棉籽油均受到毒素AFG2和AFG1的污染,且含量超過歐盟(EU)165/2010[16]中的限量標準:用于人類直接食用或作為配料的花生、油料種子、堅果、干制水果、谷物及其制品的黃曲霉毒素總含量不超過4 μg/kg。由于食用油的基質復雜,對于其中的真菌檢測分析不易獲得準確結果,本研究考察MycoSep?226多功能凈化柱對樣品基質的凈化的情況,結果表明,該處理方法操作簡單、快捷且能有效的富集目標毒素使之與基質成分分離,可廣泛應于凈化農作物、食品及中藥材中的基質成分的凈化,為HPLC的檢測分析提供一定基礎,對方法學考察的結果表明,該方法能夠滿足對樣品靈敏、快速、高通量、低溶劑的檢測要求,能夠準確用于食用油中AFT和OTA的定量分析,在監控食用油中AFT和OTA的殘留量方面具有較高的實用價值。為廣泛應用于檢測農作物、食品及中藥材中AFT和OTA提供一定研究基礎。

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[16]EU.Commission Regulation(EC)No 165/2010[S]. 2010.

SimultaneousdeterminationofaflatoxinandochratoxinA
inedibleoilbymultifunctionalpurificationcolumnandhighperformanceliquidchromatography

XINGYa-nan1,OUYANGQiao-feng2,WANGShao-kun2,YANGBin2,ZHOUXiao-ying3,*

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China;2.Xinjiang Hope Link Detection Technology Institute,Urumqi 831400,China;3.College of Pharmacy,Xingjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective:A quantitative method for simultaneous detection of aflatoxin B1,B2,G1,G2and ochratoxin A in 20 batches of edible oil was carried out by high performance liquid chromatography. Methods:After the sample was vortexed and centrifuged,the target toxin was purified by multifunctional purification column,using SHIMADZU Inertsil ODS-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm),FLD detector and methanol(A)/0.5% acetic acid water(B)by gradient elution,the injection volume was 10 μL,flow rate was 0.8 mL/min,column temperature at 35 ℃,then wavelength fluorescence was changed to detect aflatoxin B1,B2,G1,G2,ochratoxin A and study on methodology. Results:The linear ranges of AFB1,AFG1,AFB2,AFG2and OTA were 0.25～40.6 ng/mL(r=0.9999),0.5～40.4 ng/mL(r=0.9997),0.06～10.06 ng/mL(r=0.9999),0.06～10.08 ng/mL(r=0.9999)and 1.01～50.5 ng/mL(r=1.00). The average recovery rate of five mycotoxins was 91.40%～109.4%. The results showed that 4 batches of 20 samples of edible oil were positive and tested by aflatoxin G1and G2. Conclusion:The method is accurate and rapid,and can be widely used for the quantitative detection of aflatoxin B1,B2,G1,G2and ochratoxin A in edible oil.

multifunction cleanup column;high performance liguid chromatography;aflatoxin;ochratoxin A

2017-01-10

邢亞楠(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物的分離與分析，E-mail：xingyanan26@qq.com。

*通訊作者:周曉英(1968-)，女，碩士，教授，研究方向：中藥質量標準，E-mail：zhouxiaoying4@163.com。

新疆省高校企業聯合基金(20161001)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)16-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.046