響應曲面法優化超聲波輔助提取黑果枸杞中花青素工藝

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(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610025)

響應曲面法優化超聲波輔助提取黑果枸杞中花青素工藝

姚思敏薔,單虹宇,于雅靜,呂遠平*

(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610025)

采用超聲波輔助提取黑果枸杞中花青素,以花青素得率為評價指標,研究黑果枸杞中花青素的提取工藝。在單因素實驗基礎上,選取乙醇體積分數、液料比、提取溫度和提取時間四個顯著影響因素,并利用響應曲面法優化黑果枸杞花青素的提取工藝。結果表明,最佳提取方法為:乙醇體積分數72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取時間16 min、提取溫度38 ℃。在此條件下花青素平均得率為(9.16±0.059) mg/g，與預測值相比其相對誤差為0.43%。與未用超聲波輔助提取方法相比,得率增加了近1倍,且用時較短。

黑果枸杞,花青素,超聲波輔助提取,響應曲面法

黑果枸杞(LyciumruthenicuMurr)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.),是民族醫藥常用藥材[1],為多年生野生灌木,主要分布于西北及西藏等荒漠地區[2]。研究表明,成熟的黑果枸杞含有豐富的花青素(Anthocyanidins),所含花青素含量分別為藍莓、紫甘藍、紫薯、葡萄的1.75、1.91、4.45、10.72倍[3]。研究發現,花青素具有較強的抗氧化活性,具有改善心血管疾病、防止腦神經老化、預防癌癥等多種生理功能[4-6]。

目前常見的黑果枸杞色素提取方法有有機溶劑提取法、超臨界流體萃取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和超聲波輔助提取法。有機溶劑提取法存在耗時長、提取率低、溶劑殘留等問題;超臨界流體萃取法生產成本較高,適用范圍較窄;微波輔助提取法提取雜質較多,設備要求高;酶法提取時酶和色素難以分離[7]。超聲波輔助提取法是借助超聲波產生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應來強化提取過程,從而提高物質的提取率,具有效率高、時間短、成本低、提取量大、無需加熱等特點[8],同時可以避免高溫對提取成分的影響。因此本實驗利用超聲波輔助提取黑果枸杞中花青素,并采用響應曲面法對提取工藝進行優化[9],以期獲得黑果枸杞花青素的最佳提取工藝,為其資源的深度開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新疆黑果枸杞 新疆烏魯木齊水磨溝區西域百草匯;氯化矢車菊素標準品 四川省維克奇生物科技有限公司;鹽酸、無水乙醇等 均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

410HT型超聲清洗機 深圳科利爾電子科技有限公司;ESJ210-4A型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;LD-Y300A型粉碎機 永康頂帥五金制品有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 花青素檢測中標準曲線的繪制 以試劑空白(乙醇)為參比,對黑果枸杞色素提取液在180～800 nm處進行光譜掃描,花青素提取液在545 nm處有明顯特征吸收,利用與黑果枸杞色素提取液的強吸收峰一致的氯化矢車菊素作為標準品。用紫外-可見分光光度計測定氯化矢車菊素在180～800 nm波長范圍內的紫外可見光光譜性質。配制0.1 mg/mL的氯化矢車菊素標準溶液,分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于50 mL容量瓶中,用pH1.0、體積分數75%的乙醇溶液定容,即配制成1、2、3、4、5 μg/mL的氯化矢車菊素標準溶液。在545 nm處檢測吸光度值,繪制出氯化矢車菊素標準曲線,并得出回歸方程。

1.2.2 花青素得率測定 吸取1 mL花青素提取液,用pH 1.0、體積分數75%的乙醇溶液稀釋30倍,測定溶液在545 nm處的吸光度值,根據氯化矢車菊素標準曲線方程計算樣液中的花青素含量。連續測定三次,取三次實驗結果平均值作為樣品中花青素含量。花青素得率計算公式如下:

式中:m為稱取干燥后的黑果枸杞粉質量,g;V為花青素提取液體積,mL;n為稀釋倍數;c為回歸方程計算得出的測試樣液中花青素濃度,μg/mL。

1.2.3 超聲波輔助提取 將曬干的黑果枸杞去梗后打碎成粉,過60目篩,40 ℃干燥12 h備用。稱取1.00 g黑果枸杞粉置于100 mL錐形瓶中,按照液料比30∶1 (mL/g)加入pH 3.0、體積分數75%的乙醇溶液,在40 ℃下超聲(超聲功率為240 W)提取20 min,真空抽濾后將濾液用相應提取劑定容至100 mL容量瓶中制成花青素提取液備用。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溶劑種類對花青素得率的影響 分別選取酸性的水、乙醇、甲醇、丙酮作為提取溶劑,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察溶劑種類對花青素得率的影響。

1.2.4.2 溶劑體積分數對花青素得率的影響 分別選取體積分數為65%、70%、75%、80%、85%、90%的酸性溶液作為提取溶劑,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察溶劑體積分數對花青素得率的影響。

1.2.4.3 液料比對花青素得率的影響 分別選取液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL/g),其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察液料比對花青素得率的影響。

1.2.4.4 提取時間對花青素得率的影響 分別選取提取時間為5、10、20、30、40、50、60 min,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察提取時間對花青素得率的影響。

1.2.4.5 提取溫度對花青素得率的影響 分別選取提取溫度為20、30、40、50、60、70 ℃,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察提取溫度對花青素得率的影響。

1.2.4.6 pH對花青素得率的影響 分別選取pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察pH對花青素得率的影響。

1.2.4.7 提取次數對花青素得率的影響 將真空抽濾后的濾渣提取1、2、3、4、5次,其他條件同1.2.3所示進行單因素實驗,考察提取次數對花青素得率的影響。

1.2.5 響應面優化實驗 在單因素實驗中,液料比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度對花青素提取影響較大,因此選取這四個因素進行響應面優化實驗[10-12],以花青素得率為評價指標,優化超聲波提取黑果枸杞花青素的最佳工藝條件。實驗設計中的水平及編碼表見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiments

1.3數據處理

采用Origin 8.0對單因素實驗數據進行處理,利用響應面設計軟件Design Expert 9.0進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1花青素檢測

2.1.1 氯化矢車菊素的紫外吸收特征 由圖1可知,氯化矢車菊素標準溶液在204、280～310和545 nm處均有吸收峰,由于204及280～310 nm為近紫外光區,該波長下的顯色基團較多,而545 nm在可見光范圍內且吸光度值也較高,同時檢測黑果枸杞提取液在545 nm處有明顯的特征吸收,因此選取545 nm為檢測波長。

圖1 氯化矢車菊素光譜曲線Fig.1 Spectrum curve of cyanidin chloride

2.1.2 氯化矢車菊素的標準曲線 氯化矢車菊素標準曲線的回歸方程:A=0.1685c+0.0059,R2=0.99987。式中:A-吸光度,c-氯化矢車菊素濃度,μg/mL。基于最小二乘法對氯化矢車菊素標準液的濃度和吸光度的結果做線性回歸分析。得到其標準曲線見圖2。圖中氯化矢車菊素的吸光度隨其濃度變化呈線性增加關系,相關度系數較高,表明氯化矢車菊素溶液吸光度的變化可以很好地反映溶液中氯化矢車菊素濃度的變化。

圖2 氯化矢車菊素標準曲線Fig.2 Standard curve of cyanidin chloride

2.2單因素實驗

2.2.1 溶劑種類對花青素得率的影響 當利用酸性的水、甲醇、乙醇和丙酮作為提取溶劑時,所得黑果枸杞花青素得率如圖3所示。甲醇和乙醇提取效果優于水和丙酮,但因甲醇具有毒性,乙醇較為安全且價格最為低廉,因此選擇乙醇作為適宜的提取溶劑來提取,并進一步探究出適宜的乙醇溶劑的體積分數。

圖3 溶劑種類對花青素得率的影響Fig.3 Effect of solvent type on anthocyanin yield

2.2.2 乙醇體積分數對花青素得率的影響 由圖4可知，在實驗范圍內,花青素得率隨著乙醇體積分數的增加先升高后下降。這可能由于花青素在植物體內以氫鍵和疏水鍵與蛋白質、多糖等物質相連,有機溶劑可以促進氫鍵的斷裂,從而變為小分子溶解到溶劑中[13]。而隨著乙醇體積分數的增加,可能會溶解出醇溶性雜質,爭奪與花青素結合的乙醇-水分子,從而使花青素得率下降[14]。因此選擇75%作為黑果枸杞花青素提取的適宜體積分數。

圖4 乙醇體積分數對花青素得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on anthocyanin yield

2.2.3 液料比對花青素得率的影響 由圖5可知,在液料比為30∶1 (mL/g)時,黑果枸杞中的花青素充分溶出,此時的花青素得率最高,后隨著液料比持續增加,曲線趨于平緩(略有降低)。這是因為繼續增大液料比也無法推動花青素的進一步溶出,反而可能會使一些醇溶性雜質溶出搶奪乙醇-水分子,從而影響花青素溶解于溶劑中,使花青素得率略有下降。因此選定液料比30∶1 (mL/g)作為黑果枸杞花青素提取的適宜液料比。

圖5 液料比對花青素得率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on anthocyanin yield

2.2.4 提取時間對花青素得率的影響 根據圖6可知,花青素得率上升至提取時間為20 min時達到最高點,當大于20 min后花青素得率下降。超聲波產生的空化作用可以破壞黑果枸杞細胞壁,增加溶劑穿透力,使溶劑充分、快速滲透到細胞內部,有效溶解花青素。但超聲時間過長,可能會對花青素的結構造成影響,使花青素得率下降[15];而超聲時間較短時,部分花青素還未溶出。因此選取提取時間10～30 min這一適宜范圍。

圖6 提取時間對花青素得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on anthocyanin yield

2.2.5 提取溫度對花青素得率的影響 由圖7可知,當提取溫度為40 ℃時花青素得率達到最大。這可能是由于溫度的升高,分子熱運動速率加快,溶質的溶解速率隨之加快,溶解度亦會增加。但花青素對熱較為敏感,溫度過高可能對花青素的穩定性造成影響,使其分解,得率有所下降。因此選定30～50 ℃作為適宜的提取溫度范圍。

圖7 提取溫度對花青素得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield

2.2.6 pH對花青素得率的影響 圖8顯示pH對花青素得率的影響。花青素呈弱酸性,在酸性條件下穩定性比較強,花青素得率較高,但是pH過低,花青素易離解成離子狀態,造成過濾困難,損失較大。當pH為3.0時花青素得率達到最大。因此選取pH3.0作為適宜的提取劑pH。

圖8 pH對花青素得率的影響Fig.8 Effect of solvent pH on anthocyanin yield

2.2.7 提取次數對花青素得率的影響 圖9為提取次數對花青素得率的影響。提取一次得到的花青素為9.03 mg/g,提取率達到94.5%,表明提取一次就可以把花青素基本全部提取出來。

圖9 提取次數對花青素得率的影響Fig.9 Effect of extraction number on anthocyanin yield

2.3響應面優化實驗設計

在單因素實驗的基礎上,選取對乙醇提取花青素得率影響顯著的四個因素(液料比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度)進行響應面優化實驗,以花青素得率為評價指標,確定超聲波提取黑果枸杞花青素的最佳工藝條件。Box-Behnken實驗設計[16-19]及結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Analysis results of regression and variance

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

圖10 液料比和乙醇體積分數對花青素得率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and ethanol concentration on anthocyanin yield

根據回歸方程,做出響應面分析圖,各因素的交互作用見圖10～圖15。從圖中可以看出各因素在提取過程中的交互作用,響應面圖的曲面越陡,交互作用越顯著,反之越不顯著[20]。比較圖10～圖15可知,圖10～圖13曲面較陡,表明液料比(A)和乙醇體積分數(B)、液料比(A)和提取時間(C)、液料比(A)和提取溫度(D)、乙醇體積分數(B)和提取時間(C)的交互作用較顯著。圖14中可以看出提取溫度上升的幅度比乙醇體積分數稍陡,說明提取溫度對花青素得率的影響較液料比大。圖15中提取溫度上升幅度明顯大于提取時間的上升幅度,說明提取溫度對花青素得率影響比提取時間對其的影響大,與方差分析結果一致。

圖11 液料比和提取時間對花青素得率影響的響應面圖Fig.11 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and extraction time on anthocyanin yield

圖12 液料比和提取溫度對花青素得率影響的響應面圖Fig.12 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and extraction temperature on anthocyanin yield

圖13 乙醇體積分數和提取時間對花青素得率影響的響應面圖Fig.13 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on anthocyanin yield

圖14 乙醇體積分數和提取溫度對花青素得率影響的響應面圖Fig.14 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on anthocyanin yield

圖15 提取時間和提取溫度對花青素得率影響的響應面圖Fig.15 Response surface plot showing the interactive effects of extraction time and extraction temperature on anthocyanin yield

在模型濃度范圍內選擇出發點,使用快速上升法進行優化得到的黑果枸杞花青素提取的最佳方法為:乙醇體積分數72.11%、液料比27.21∶1 (mL/g)、提取時間15.92 min、提取溫度38.21 ℃,花青素理論得率9.20 mg/g。考慮到實際操作,將提取工藝參數修正為乙醇體積分數72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取時間16 min、提取溫度38 ℃。以上述條件進行3次驗證實驗,花青素得率為(9.16±0.059) mg/g,與理論花青素的得率相比,其相對誤差為0.43%,表明模型可靠。

2.4超聲波輔助提取法與乙醇溶劑提取法比較

在乙醇體積分數、液料比、提取溫度相同的條件下,采用乙醇溶劑提取法提取黑果枸杞中的花青素2 h,花青素得率為(4.71±0.032) mg/g。而超聲波輔助提取的花青素得率為(9.16±0.059) mg/g,得率為前者的將近2倍,且比溶劑提取法縮短了100 min。由此可知,超聲波輔助提取法是一種高效省時的花青素提取方法。

3 結論

響應曲面法優化超聲波輔助乙醇提取黑果枸杞中花青素的最優方案為:乙醇體積分數72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取時間16 min、提取溫度38 ℃,花青素實際得率為(9.16±0.059) mg/g,與理論花青素的得率為測值相比,其相對誤差為0.43%。用乙醇溶劑提取法得到的花青素得率為(4.71±0.032) mg/g,得率僅為超聲波輔助提取的一半左右,且耗時較長。表明超聲波輔助提取技術具有耗時短、效率高等優點,可為今后黑果枸杞花青素的提取提供參考依據。

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Optimizationofultrasonic-assistedextractionprocessforanthocyaninsfromLyciumruthenicuMurrbyresponsesurfacemethodology

YAOSi-minqiang,SHANHong-yu,YUYa-jing,LVYuan-ping*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610025,China)

Response surface methodology was employed for the ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins fromLyciumruthenicuMurr. Anthocyanin yield was selected as evaluation index to investigate anthocyanin extraction process fromLyciumruthenicuMurr. On the basis of one-factor-at-a-time experiments,response surface methodology was used to optimize the extraction process of anthocyanins fromLyciumruthenicuMurr with four significant impact factors such as ethanol concentration,liquid-to-solid ratio,extraction time,extraction temperature. The results showed that the optimum conditions were as follows:72% of ethanol concentration,27∶1 (mL/g)of liquid-to-solid ratio,16 min of extraction time,38 ℃ of extraction temperature. Under these conditions,the actual average yield was(9.16±0.059)mg/g,relative error of 0.43% compared with the predicted value and incresed nearly 1-fold compared with that obtained without ultrasonic treatment.

LyciumruthenicuMurr;anthocyanins;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

2017-01-15

姚思敏薔(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:747294934@qq.com。

*通訊作者:呂遠平(1971-)，女，博士，教授，研究方向：食品科學與工程，E-mail:364943477@qq.com。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)16-0210-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.039