金花葵花總黃酮的提取及體外抗氧化活性

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(遼寧石油化工大學,化學化工與環境學部,遼寧撫順 113001)

金花葵花總黃酮的提取及體外抗氧化活性

王菲,孫一焱,解長海,宋力,孫志宇,孫家龍，陸光

(遼寧石油化工大學,化學化工與環境學部,遼寧撫順 113001)

采用響應面法對金花葵花總黃酮的溶劑提取條件進行優化,并通過人工構建自由基來考察金花葵花總黃酮的體外抗氧化能力。實驗結果表明,金花葵花總黃酮的最適提取條件:乙醇濃度75%(V/V)、液料比30∶1,提取溫度60 ℃,提取時間2.50 h,在此條件下的黃酮得率為126.67 mg/g干重。體外抗氧化實驗表明:金花葵花總黃酮對超氧陰離子自由基有很強的清除能力,IC50為207.1 μg/mL,且效果優于VC;金花葵花總黃酮對DPPH自由基和羥基自由基有較強的清除作用,IC50分別為37.5 μg/mL和754.7 μg/mL,金花葵花總黃酮對Fe3+的具有一定的還原作用,是VC的83%,但均稍差于VC。金花葵花總黃酮具有較高的體外抗氧化能力。

金花葵花,總黃酮,提取,抗氧化活性

金花葵(HibiscusmanihotL.),又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉,為錦葵科秋葵屬一年生草本植物[1]。金花葵花中含有黃酮、蛋白質、高聚糖膠、膳食纖維、微量元素硒、鋅和多種不皂化物等,其中黃酮類化合物是主要活性成份[2]。金花葵自然分布在河北地區,是近瀕臨絕種的植物之一。因其功效漸被認知,目前已經有很多金花葵種植基地,多分布在太行山東部山麓地區,晉中晉南地區。金花葵花在二百多種秋葵植物中最具食用、藥用價值,具有清利濕熱、消炎鎮痛之功效[3-5]。金花葵的油脂除能食用外,還可作為高檔潤滑油和加工化妝品的高級原料。現代醫學研究表明,黃酮類化合物有較高的生物活性和藥用價值,如抗氧化、抗病毒、抗過敏、抗糖尿病、護肝、防癌、降低血管脆性、改善血管通透性、降低膽固醇和血脂、防治老年人的高血壓和腦溢血等功效[6-9]。故從金花葵花中提取黃酮,研究金花葵花中黃酮的生物活性十分必要。

金花葵花中總黃酮的提取方法多采用溶劑浸提法,故找到此法的最佳提取條件至關重要。本實驗以金花葵花為原料,以乙醇為溶劑,采用溶劑浸提法提取金花葵花總黃酮,通過單因素結合響應面優化實驗來確定金花葵花總黃酮的最佳提取條件,并通過人工構建自由基對金花葵花總黃酮的體外抗氧化能力進行研究,為其深加工和綜合開發利用提供科學理論基礎。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

金花葵花 遼寧恒生實業集團有限公司;蘆丁標準品 色譜純,合肥博美生物科技有限公司;無水乙醇、硝酸鋁、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、水楊酸、過氧化氫、硫代巴比妥酸、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、鹽酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-苦基苯肼 色譜純,購自Sigma公司;去離子水 實驗室自制。

ALC-1100.2電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;DUG-9021A電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;All basic分析研磨機 德國IKA公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-2600可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;LGJ-10型冷凍干燥機 軍事醫學科學院實驗儀器廠研制、北京四環科學儀器廠制造。

1.2實驗方法

1.2.1 金花葵花總黃酮的提取 將金花葵花置于50 ℃烘箱內進行烘干處理24 h,取出后粉碎,過60目篩,裝瓶待用。準確稱取金花葵花粉末若干,加入一定量不同體積分數的乙醇溶液,分別在不同的液料比、水浴時間和水浴溫度下進行提取,再在4000 r/min下離心5 min,取上清液即為黃酮粗提液。

1.2.2 黃酮得率的測定 金花葵花總黃酮粗提液中黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[10-11],測定波長為510 nm,以吸光度為縱坐標,含量為橫坐標,繪制標準曲線,標準曲線方程為:y=0.1633x+0.0049,R2=0.9999。按下式進行黃酮得率的計算:

式中:C-由回歸線方程計算出濃度(mg/mL);D-測定液定容的體積(L);V-提取液的體積(mL);m-樣品質量(g);B-吸取測定的體積(mL)。

1.2.3 金花葵花總黃酮提取條件的優化 金花葵花總黃酮提取條件的優化是采用單因素預實驗結合響應面優化實驗來實現的。單因素實驗預實驗具體實施過程是以已烘干粉碎的金花葵花粉末為原料,乙醇溶液為提取溶劑,考察不同的乙醇濃度(V/V)、液料比、提取溫度和提取時間對金花葵花總黃酮得率的影響。根據單因素預實驗結果,設計自變量的取值范圍及實驗水平,如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.4 金花葵花總黃酮的純化 在1.2.3實驗所得最優條件下制備得到粗提液,進行旋轉蒸發濃縮后,進行聚酰胺柱層析純化,上樣液質量濃度為4.68 mg/mL,pH為4～5,吸附流速為1.5 mL/min,上樣量為1.5 BV,以3 BV的水沖洗樹脂柱,5 BV的80%乙醇溶液以1.5 mL/min的速率洗脫效果最佳,所得洗脫液經冷凍干燥后即得到金花葵花總黃酮純化物,其純度為75.2%。

1.2.5 金花葵花總黃酮體外抗氧化作用研究

1.2.5.1 清除DPPH自由基的測定 精確稱取DPPH 9.7 mg,加入少量無水乙醇溶解后,以體積分數為95%的乙醇溶液定容至250 mL,制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL已配制的DPPH溶液,分別加入1 mL不同濃度的金花葵花總黃酮純化液,以95%乙醇補足到4 mL,混勻,放置30 min后,在517 nm處測定樣品吸光值As,以95%乙醇為空白對照,測定Ac[12]。以蒸餾水作參比,VC為陽性對照。按下式計算清除率及IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

式中,Ac-空白的吸光度;As-樣品的吸光度。

以樣品濃度與清除率作圖,清除率為50%時所需樣品的濃度,即半數抑制濃度IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.2.5.3 清除羥基自由基(·OH)的測定 利用H2O2與Fe2+反應產生,在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質,該物質在510 nm下有最大吸收。反應體系中含8.8 mmol/L H2O21 mL,10 mmol/L FeSO41 mL,10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL,分別加入不同濃度金花葵花總黃酮純化液1 mL,最后加H2O2啟動反應,37 ℃反應0.5 h,在510 nm下測定樣品吸光度As。空白管以1 mL蒸餾水代替樣品,操作方法同上,可測得空白管的吸光度Ac[14]。以蒸餾水作參比,VC為陽性對照。按下式計算清除率及IC50。

清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.2.5.4 還原力的測定 取不同濃度的金花葵花總黃酮純化液1 mL于試管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL質量分數1% K3Fe(CN)6混勻,于55 ℃恒溫水浴中溫育20 min后,迅速冷卻,加入2.5 mL質量分數10%的三氯乙酸混合后,以3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數0.1%的FeCl3溶液,充分混合,靜置10 min后,于700 nm處測定樣品吸光度值As,吸光度越大,表示還原能力越強[15]。空白管以1 mL蒸餾水代替樣品,操作方法同上,可測得空白管的吸光度Ac。用蒸餾水作參比,VC為陽性對照。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

還原力=As-Ac

1.3數據處理

采用Design-Expert 8.05軟件分析實驗數據。

2 結果與分析

2.1響應面法對金花葵花總黃酮提取條件的優化

2.1.1 實驗方法和設計 在單因素實驗基礎上,以乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間作為自變量,金花葵花總黃酮得率為響應值,進行四因素三水平Box-Behnken的中心組合實驗設計。Box-Behnken實驗設計及結果如表2所示。根據表2的實驗結果,用Design-Expert 8.05統計分析軟件進行多元回歸分析,主要分析結果見表3。

經過對實驗數據的多元回歸分析,響應變量和實驗變量的關系如下列二元多次方程:

Y=127.32-0.93A+2.10B-2.76C-0.49D-0.075AB-1.07AC-1.55AD-0.17BC+0.75BD+2.73CD-1.32A2-5.14B2-10.06C2-3.61D2

金花葵花黃酮得率的方差分析結果見表3,在本實驗所涉及范圍內,該模型p<0.0001,極顯著。模型的決定系數R2=0.9271,說明該模型與實際實驗擬合良好,誤差小,證明應用響應面優化法得到的提取條件提取金花葵花黃酮是可行的。失擬項的p值是0.0839,大于0.05,不顯著,表明方程的擬合不足檢驗不顯著,本實驗無其他因素的顯著影響。與此同時,一個很低的變化系數值1.94%,清楚的顯示出很高的精密度等級和實驗值的可靠性。二次響應曲面回歸方程能很好的擬合本實驗所得結果,該模型可以用于金花葵花黃酮提取實驗的理論預測。從p值可知,四個因素對黃酮得率的影響強弱依次為:乙醇濃度>提取時間>提取溫度>液料比。各個實驗因子對其響應值的影響不僅是簡單的線性關系,一次項中一次項B、C對響應值的影響為極顯著,交互項中CD的影響為顯著,平方項中B2、C2、D2的影響為極顯著。

2.1.2 響應面圖解析 圖1表示乙醇濃度、液料比、提取時間和提取溫度中任意兩個變量取零時,其余兩個變量對黃酮得率的影響。

從各個因素兩兩相互作用的響應面圖形觀察發現,曲線走勢越陡,其影響越顯著。由響應面圖和p值的分析可知,交互項CD,即乙醇濃度和液料比的響應面圖走勢較陡,影響顯著。

2.1.3 驗證實驗 根據響應面分析軟件的預測,得到最佳提取條件:乙醇濃度73.32%、液料比29.67∶1、水浴溫度57.11 ℃、水浴時間為2.60 h,此時黃酮得率理論預測值為127.856 mg/g干重。為了檢驗實驗結果是否與實際情況一致,故根據上述實驗條件預測值進行驗證實驗,考慮到實際操作的便利,將提取條件修正:乙醇濃度75%(V/V)、液料比30∶1、水浴溫度60 ℃、水浴時間為2.50 h。在此條件下進行三次平行實驗,得到金花葵花總黃酮實際得率平均值為126.67 mg/g干重,與預測值接近,可見該模型能較好地模擬和預測實驗產率。

表3 Box-Behnken實驗回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance Box-Behnken test of regression equation

圖1 乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間及其兩兩相互作用對黃酮得率影響的響應面圖Fig.1 The response surface graph showing the effects of ethanol concentration,liquid to material,extraction temperature,extraction time and their interaction effect on the yield of flavonoids

注:**為極顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.2金花葵花總黃酮的抗氧化實驗研究

2.2.1 金花葵花總黃酮清除DPPH自由基能力 由圖2可知,金花葵花總黃酮對DPPH自由基的清除率隨濃度增大而增強,且具有明顯的量效關系,VC亦是。金花葵花總黃酮對DPPH自由基的IC50為37.5 μg/mL,VC的IC50為25.1 μg/mL,說明金花葵花總黃酮對DPPH自由基的清除率稍差于VC,表明金花葵花總黃酮對DPPH自由基具有較強的清除作用。

圖2 金花葵花總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用 Fig.2 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on DPPH radical

2.2.2 金花葵花總黃酮清除超氧陰離子自由基能力 由圖3可知,金花葵花總黃酮具有清除超氧陰離子自由基的作用,清除率隨著黃酮濃度增大而增強,且具有明顯的量效關系,VC亦是。金花葵花總黃酮的IC50為207.1 μg/mL,VC的IC50為334.6 μg/mL。說明金花葵花總黃酮對超氧陰離子自由基有的清除作用強于VC,表明金花葵花總黃酮具有很強的清除超氧陰離子自由基的能力。

圖3 金花葵花總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on superoxide anion radical

2.2.3 金花葵花總黃酮清除羥基自由基能力 由圖4可知,金花葵花總黃酮具有清除羥基自由基的作用,清除率隨著黃酮濃度增加而增強,且具有明顯的量效關系,VC亦是。金花葵花總黃酮的IC50為754.7 μg/mL,VC的IC50為673.1 μg/mL。說明金花葵花總黃酮對羥基自由基有一定的清除作用,但稍差于VC。

圖4 金花葵花總黃酮對羥自由基清除能力Fig.4 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on scavenging hydroxyl radicals

2.2.4 金花葵花總黃酮的還原力 由圖5可知,在一定濃度范圍內,金花葵花總黃酮的還原力隨濃度增大而增強,且具有明顯的量效關系,VC亦是。金花葵花總黃酮濃度為200 μg/mL時,吸光度為0.835,而VC濃度為200 μg/mL時,吸光度為1.006,表明金花葵花具有較強的還原能力,但低于同濃度VC的還原力。金花葵花總黃酮還原力大約是VC還原力的83%。說明金花葵花總黃酮對Fe3+具有較好的還原作用,但稍差于VC。

圖5 金花葵花總黃酮和VC的還原力Fig.5 The reducing ability of flavonoids and ascorbic acid

綜上所述,金花葵花總黃酮對DPPH自由基的清除能力和對Fe3+的還原能力具有較強的作用,但稍差于VC;對超氧陰離子自由基具有很好的清除能力,且好于VC;對羥基自由基有一定的清除作用但差于VC。說明金花葵花總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。

3 結論

金花葵花總黃酮的最適提取條件:乙醇濃度75%(V/V)、液料比30∶1,提取溫度60 ℃,提取時間2.50 h,在此條件下的黃酮得率為126.67 mg/g干重。

金花葵花總黃酮的體外抗氧化活性實驗表明:金花葵花總黃酮對超氧陰離子自由基具有很強的清除能力,且效果好于VC;金花葵花總黃酮具有較強的對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用以及對Fe3+的還原作用,但稍差于VC。綜上所述,金花葵花總黃酮具有較強的體外抗氧化能力。

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ExtractionoftotalflavonoidsfromHibiscusmanihotL.flowerandtheirantioxidantactivityinvitro

WANGFei,SUNYi-yan,XIEChang-hai,SONGLi,SUNZhi-yu,SUNJia-long,LUGuang

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Environmental Engineering,Liaoning Shihua University,Fushun 113001,China)

This test used solvent extraction of flavonoids fromHibiscusmanihotL. flower by using response surface methodology to optimize the extraction conditions,and the antioxidant activityinvitrowas evaluated by artificial free radicals in detail. The optimal extraction conditions were as follows:the volume fraction of ethanol 75%,ratio of liquid to solid 30∶1,extraction temperature 60 ℃,extraction time 2.5 h. Under this optimum conditions,the actual yield of flavonoids was 126.67 mg/g dry weight. The total flavonoids inHibiscusmanihotL. flower had a good scavenging effect on superoxide anion radical with a 50% inhibition concentration(IC50)of 207.1 μg/mL and which was better than that of ascorbic acid. The extracts also had a good scavenging effect on DPPH radical and hydroxyl radical with IC50of 37.5 μg/mL and 754.7 μg/mL respectively,which were a little lower than that of ascorbic acid. The extract also showed a certain reduction ability and it was 83% times as much as that of ascorbic acid. In general,total flavonoids fromHibiscusmanihotL. flower had a high antioxidant activity.

HibiscusmanihotL. flower;total flavonoids;extraction;antioxidant activity

2017-02-07

王菲(1982-)，女，博士，講師，主要從事食品生物技術方面研究，E-mail:107806708@qq.com。

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2016006)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)16-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.035