脫鹽咸鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的制備及表征

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(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,湖北武漢 430070)

脫鹽咸鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的制備及表征

李博,侯燾,陳恩民,何慧*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,湖北武漢 430070)

本文以脫鹽咸鴨蛋清肽為原料,FeCl2·4H2O為鐵源,以亞鐵的螯合率和螯合物的得率為跟蹤指標(biāo),對鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的制備條件進(jìn)行優(yōu)化;并采用紅外光譜、動態(tài)光散射儀、熒光光譜、圓二色譜手段,對肽-亞鐵螯合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。單因素及正交實(shí)驗結(jié)果表明,鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的最佳螯合反應(yīng)條件:抗壞血酸(VC)與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,鴨蛋清肽溶液的濃度為4%,肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為3∶1,pH 5.5,反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)時間為40 min,乙醇的添加量為反應(yīng)液體積的7倍,在此條件下亞鐵的螯合率為65.15%,螯合物得率為44.46%。紅外光譜顯示Fe2+與肽的氨基端與羧基端相結(jié)合;熒光光譜表明隨著Fe2+的增加,熒光吸收帶從3822 nm顯著下降為3124.44 nm(p<0.05);激光粒度儀顯示肽與肽-亞鐵螯合物的半徑分別為(144.23±5.86) nm和(453.66±8.74) nm;圓二色譜顯示肽中α螺旋、β折疊的含量為28.66%±1.54%、10.02%±1.04%,而肽-亞鐵螯合物中α螺旋、β折疊的含量為16.10%±1.96%、27.33%±1.08%,兩者均發(fā)生顯著變化(p<0.05)。從結(jié)構(gòu)層面證實(shí)了肽-亞鐵螯合物的形成。

鴨蛋清肽,亞鐵鹽,螯合物,螯合率,表征

咸鴨蛋清作為蛋品加工的副產(chǎn)品,其質(zhì)量在咸鴨蛋中約占54%,因含鹽量高達(dá)7%～10%,蛋清蛋白粉中鹽含量甚至高達(dá)35%,極大程度地限制了其應(yīng)用范圍,這不僅造成了良好蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi),其排放也易污染環(huán)境[1]。目前,將富含蛋白質(zhì)的食品工業(yè)下腳料進(jìn)行酶解利用是一種趨勢[2],因此,將咸鴨蛋清進(jìn)行脫鹽進(jìn)而獲取鴨蛋清蛋白,再進(jìn)行酶解改性,不僅提高下腳料的附加值,同時可以減少環(huán)境污染,獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。咸鴨蛋清肽具有多種生理活性,易于被人體吸收,具有良好的補(bǔ)鈣[3-4]、降血壓[5]等多種功效,以此為基礎(chǔ),利用鴨蛋清肽制備肽-亞鐵螯合物,可以強(qiáng)化鴨蛋清肽補(bǔ)鐵的效果。

鐵是生物體必需的微量元素,鐵元素的缺乏會導(dǎo)致貧血。普通的無機(jī)鐵和有機(jī)酸鐵吸收率低,且口感較差,而肽-亞鐵螯合物是一種新型的生物態(tài)鐵,可直接被腸黏膜細(xì)胞吸收,吸收率遠(yuǎn)較無機(jī)鐵高,并且安全,無消化道刺激,是理想的補(bǔ)鐵劑[6]。目前,已有一些關(guān)于肽-亞鐵螯合物的報道,如鷹嘴豆蛋白肽-亞鐵螯合物[7]、烏雞低聚肽-亞鐵螯合物[6]、血紅蛋白肽-亞鐵螯合物[8]、米糠蛋白肽-亞鐵螯合物[9]、鱈魚皮膠原蛋白肽-亞鐵螯合物[10]等。但有關(guān)于鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的研究未見報道。

本研究通過正交實(shí)驗對鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的制備條件進(jìn)行優(yōu)化,采用紅外光譜、熒光光譜、動態(tài)光散射儀、圓二色譜對螯合物和肽進(jìn)行表征,以期為開發(fā)一種新型的生物補(bǔ)鐵劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

咸鴨蛋清 購于湖北神丹健康食品有限公司,蛋白含量約為10%,鹽含量約7%;氯化亞鐵、抗壞血酸、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、乙醇(95%)等 所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;PB-10Sartoius標(biāo)準(zhǔn)型pH計 德國賽多利斯股份公司;TDL-5A臺式低速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;UV-1750紫外可見分光光度計 日本Shimadza公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;RF-5031熒光分光光度計 日本島津公司;JASCO-810型圓二色譜儀 日本Jaco公司;LS-609型激光粒度儀 珠海歐美克儀器公司;471FT-IR紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1 肽-亞鐵螯合物的制備工藝 鴨蛋清蛋白→加入適量的蒸餾水→沸水浴45 min→冷卻后放入水浴鍋中→pH調(diào)到7、溫度調(diào)至50 ℃→加中性蛋白酶進(jìn)行水解→NaOH保持pH在最適的條件→沸水滅酶10 min→離心(3800 r/min,15 min)→取上清→旋蒸→冷凍干燥→脫鹽咸鴨蛋清肽[5]

脫鹽咸鴨蛋清肽→加入抗氧化劑VC→調(diào)pH→加入亞鐵鹽→恒溫螯合→離心(4000 r/min,10 min)取上清液→加入適量的乙醇醇沉→離心(10000 r/min,15 min)取沉淀→乙醇洗滌沉淀多次→烘干得到肽-亞鐵螯合物[11]

1.2.2 肽-亞鐵螯合物的指標(biāo)測定 采用硫酸亞鐵銨配制10 μg/mL鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,10%的鹽酸羥胺2.5 mL、0.12%鄰菲羅啉5 mL、然后加入pH=5醋酸-醋酸鈉的緩沖液5 mL,用水稀釋至刻度,以不加鐵的試劑作為空白溶液,在510 nm波長處測定吸光度[12]。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2013x+0.0007(R2=0.9992)。

樣品測定:準(zhǔn)確稱取0.02 g的樣品置于100 mL燒杯中,加入2 mL濃鹽酸,待樣品完全溶解后,用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取5 mL樣品液于50 mL容量瓶中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟測定吸光度。

亞鐵離子含量(mg/kg)=CV0/mV1

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品試液相應(yīng)的亞鐵含量(μg);m為樣品的質(zhì)量(g);V1為測定時所取樣品試液的體積(mL);V0為樣品處理后的定容體積(mL)。

亞鐵螯合率(%)=m′/M×100

式中:m′為螯合物中亞鐵的含量(mg);M為加入反應(yīng)體系中亞鐵的總量(mg)。

肽-亞鐵螯合物得率(%)=W0/W1×100

式中:W0為小分子肽-亞鐵螯合物總量(mg);W1為小分子肽與亞鐵鹽的總質(zhì)量(mg)。

1.2.3 肽-亞鐵螯合物的制備工藝

1.2.3.1 VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比對螯合反應(yīng)中亞鐵離子的影響 固定肽的濃度為4%,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比2∶1,pH為5,溫度為40 ℃,反應(yīng)時間40 min,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比(0.1∶1、0.15∶1、0.2∶1、0.25∶1、0.3∶1);將螯合反應(yīng)液離心后的沉淀干燥,比較沉淀的質(zhì)量。

1.2.3.2 單因素實(shí)驗設(shè)計 固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,pH為5,溫度為40 ℃,反應(yīng)時間40 min,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為2∶1,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用肽的濃度為2%、3%、4%、5%、6%;

固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,肽的濃度為4%,pH為5,溫度為40 ℃,反應(yīng)時間40 min,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1;

固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1,pH為5,溫度為40 ℃,反應(yīng)時間40 min,肽的濃度為4%,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用pH為3、4、5、6、7;

固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1,pH為6,反應(yīng)時間40 min,肽的濃度為4%,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用溫度為20、30、40、50、60 ℃;

固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1,pH為6,溫度為40 ℃,肽的濃度為4%,乙醇的體積倍數(shù)為5,選用反應(yīng)的時間為20、30、40、50、60 min;

固定VC與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1,pH為6,溫度為40 ℃,肽的濃度為4%,反應(yīng)的時間40 min,選用乙醇的體積倍數(shù)(乙醇是離心后上清液體積的倍數(shù))為4、5、6、7、8。按上述順序進(jìn)行單因素實(shí)驗,選擇優(yōu)化后的結(jié)果逐一進(jìn)行單因素實(shí)驗,以螯合反應(yīng)中亞鐵的螯合率和螯合物得率為衡量指標(biāo)。

1.2.3.3 正交實(shí)驗 在上述單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上,反應(yīng)時間、溫度、乙醇的體積倍數(shù)按照單因素的結(jié)果確定,以pH、肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比、肽的濃度為實(shí)驗因素,以亞鐵螯合率和螯合物得率為測試指標(biāo),通過正交實(shí)驗篩選出肽-亞鐵螯合物制備的最佳工藝參數(shù)。正交實(shí)驗因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal test

1.2.4 肽與肽-亞鐵螯合物的紅外光譜分析 將肽-亞鐵螯合物與肽樣品各5 mg,放入瑪瑙研缽中,加入干燥的500 mg純KBr,混合研磨均勻,光譜范圍為4000～400 cm-1,掃描信號累加次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1,利用紅外光譜儀進(jìn)行定性分析,得到光譜圖。

1.2.5 肽與肽-亞鐵螯合物的粒徑分析 將肽-亞鐵螯合物與肽分別用蒸餾水(RI=1.330)溶解,得到1 mg/mL的溶液。測試條件為比色杯尺寸為1 cm的聚苯乙烯池,測量溫度為25 ℃,溫度平衡時間為2 min。

1.2.6 肽與肽-亞鐵螯合物的熒光光譜分析 將肽用醋酸-醋酸鈉(pH=5)的緩沖液溶解得到1 mg/mL的溶液,加入不同質(zhì)量的FeCl2,使FeCl2的濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L,常溫靜置20 min后進(jìn)行實(shí)驗。測試條件為激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長290～500 nm,激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬度均為5 nm,溫度為25 ℃。

1.2.7 肽與肽-亞鐵螯合物的圓二色譜分析 將肽-亞鐵螯合物與肽分別溶解得到1 mg/mL的溶液。測試條件設(shè)置波長范圍為190～260 nm,池厚為0.1 cm,溫度25 ℃,譜帶寬度為1.0 cm,掃描速率20 nm/min,掃描3次,累加得到CD譜圖。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗中每個處理重復(fù)三次,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1肽-亞鐵螯合物的制備條件

2.1.1 維生素C對螯合反應(yīng)的影響 由圖1可知,添加維生素C(VC)是為了防止Fe2+氧化成Fe3+。當(dāng)VC與亞鐵鹽質(zhì)量比從0.1∶1增大到0.2∶1時,Fe(OH)3沉淀呈下降趨勢,VC與亞鐵鹽質(zhì)量比為0.2∶1時,沉淀的質(zhì)量下降到最低點(diǎn),繼續(xù)增加VC的質(zhì)量,沉淀的質(zhì)量上升。加入VC過少,Fe2+容易氧化成Fe3+,并生成Fe(OH)3沉淀,造成螯合物不純(含有肽與Fe3+生成的螯合物),并且肽與Fe3+形成的螯合物中的Fe3+不是補(bǔ)鐵的活性形式;加入VC過多,雖能有效防止Fe2+的氧化,但反應(yīng)體系中還有多余的VC,VC具有一定的螯合能力,同樣造成螯合物不純(含有VC與Fe2+生成的螯合物),并且還會影響對肽與亞鐵螯合能力的準(zhǔn)確評估。所以選擇VC為亞鐵鹽質(zhì)量的0.2倍。

圖1 VC加入量對螯合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of the amount of ascorbic acid on chelating reaction

2.1.2 肽的濃度對螯合反應(yīng)的影響 由圖2可知,當(dāng)肽的濃度由2%升到4%時,亞鐵螯合率與螯合物的得率呈上升趨勢,4%時達(dá)到最大,繼續(xù)增加肽的濃度時,亞鐵螯合率與螯合物的得率均下降。當(dāng)肽與亞鐵鹽質(zhì)量比一定時,肽濃度較低時,溶液中肽及亞鐵的濃度都很低,兩者之間由于熱運(yùn)動引起的相互碰撞也少,所以螯合程度低[13],隨著肽濃度的逐漸增大,螯合物的產(chǎn)量提高;但是當(dāng)肽及亞鐵濃度過大時,會產(chǎn)生大量的螯合物,而大量產(chǎn)物存在時,在一定程度上會使反應(yīng)逆向進(jìn)行,使螯合率降低。故選擇合適的肽濃度為4%。

圖2 肽的濃度對螯合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of concentration of the peptide on chelating reaction

2.1.3 肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對螯合反應(yīng)的影響 由圖3可知,當(dāng)質(zhì)量比從1∶1升到時3∶1,亞鐵螯合率和螯合物的得率呈上升趨勢；從3∶1到5∶1時，亞鐵螯合率和螯合物的得率下降。可能因為當(dāng)向肽溶液中加入亞鐵鹽時溶液過少時,螯合反應(yīng)后還剩下部分多肽,造成肽的利用率不高,螯合物的得率不高;當(dāng)向肽液中加入亞鐵鹽過多時,螯合反應(yīng)雖能充分利用多肽,但由于Fe2+過多時,肽的螯合能力已達(dá)到飽和,因而其螯合物的得率和螯合率均降低。因此,選擇肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1。

圖3 肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比對螯合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the mass ratio of peptide to ferrous salt on chelating reaction

2.1.4 pH對螯合反應(yīng)的影響 由圖4可知,pH在3～7范圍內(nèi),先隨著pH的增大,螯合率呈上升趨勢,當(dāng)pH達(dá)到6時,螯合率和螯合物得率均達(dá)到最高;繼續(xù)增大pH,螯合率和螯合物得率則均呈下降趨勢。在pH較低的酸性條件下,反應(yīng)體系中存在較多H+,不利于配位原子的釋出;當(dāng)pH逐漸增大時,反應(yīng)體系中OH-增多,體系會有Fe(OH)2生成,Fe(OH)2也極易氧化成Fe(OH)3,因此選擇反應(yīng)體系的pH為6。

圖4 pH對螯合反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH on chelating reaction

2.1.5 溫度對螯合反應(yīng)的影響 如圖5所示,當(dāng)溫度從20 ℃逐步升溫時,螯合率和螯合物得率先提高;當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時,螯合率和螯合物得率均達(dá)最高;若溫度再升高時,螯合率和螯合物得率均呈現(xiàn)降低的趨勢。因為反應(yīng)體系中如果溫度過低,則會減緩肽與Fe2+的反應(yīng)活力,降低螯合率和螯合物得率;當(dāng)反應(yīng)溫度過高時,Fe2+則容易被氧化成Fe3+,同樣降低螯合率和螯合物的得率[13]。故選40 ℃作為螯合反應(yīng)最適溫度。

圖5 溫度對螯合反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of temperature on chelating reaction

2.1.6 時間對螯合反應(yīng)的影響 由圖6可知,螯合時間從20 min延長到40 min,螯合率和螯合物得率均呈上升趨勢,在40 min時螯合率和螯合物得率均最高,繼續(xù)延長螯合時間,螯合率和螯合物得率反而降低,說明在40 min時螯合反應(yīng)程度達(dá)到最高。由于金屬離子螯合是一個能快速完成的反應(yīng),故不需用過長的時間[14]。故選40 min作為螯合反應(yīng)的最適時間。

圖6 時間對螯合反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of time on chelating reaction

2.1.7 乙醇對螯合反應(yīng)的影響 由圖7可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由4倍增加到7倍時,螯合率與得率均先增大,乙醇體積分?jǐn)?shù)為7倍時達(dá)到最大,繼續(xù)增大,螯合率和螯合物得率反而降低。這主要是因為當(dāng)乙醇添加量過少時,沉淀不夠充分;而當(dāng)乙醇加入量過多時,相當(dāng)于溶劑增多,有可能使難溶物達(dá)不到其溶度積而部分溶解,導(dǎo)致螯合率與螯合物的得率均下降[15]。因此適宜的乙醇體積倍數(shù)為反應(yīng)液體積的7倍。

圖7 乙醇的體積倍數(shù)對螯合反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of volume fraction of ethanol on chelating reaction

2.2肽-亞鐵螯合物工藝條件的優(yōu)化

采用L9(34)正交實(shí)驗方法,通過極差分析結(jié)果表2可以看出,影響螯合反應(yīng)中亞鐵螯合率的3個因素主次順序為C、A、B,最優(yōu)組合為A2B2C2。影響螯合反應(yīng)中螯合物得率的最優(yōu)組合為A2B2C2,正好與亞鐵的螯合率的指標(biāo)條件吻合。得到的最佳工藝條件為肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比是3∶1,pH為5.5,反應(yīng)時間為40 min,反應(yīng)溫度為40 ℃,肽的濃度為4%,在此工藝條件下進(jìn)行驗證實(shí)驗,所得亞鐵的螯合率65.15%,螯合物得率為44.46%。

表2 正交實(shí)驗結(jié)果Table 2 The result of the orthogonal experiment

2.3肽與肽-亞鐵螯合物紅光光譜分析

紅外光譜特征吸收峰的改變可以反映金屬離子與肽中有機(jī)配位體相互作用[16]。如圖8所示,高頻區(qū)的寬峰為羥基(-OH)和氨基(-NH)的伸縮振動峰在此處的疊加,與肽的圖譜相比,當(dāng)肽與Fe2+發(fā)生螯合反應(yīng)后,吸收峰的位置由3397.98 cm-1移動至3377.20 cm-1,移動了約20個波數(shù),表明當(dāng)羥基氧和氨基氮參與配位后,相當(dāng)于O-H鍵、N-H鍵有一定程度的弱化,即鍵力常數(shù)減小,而紅外峰的吸收頻率與鍵力常數(shù)的根號成正比,故該峰向低波數(shù)大幅移動;酰胺I帶即C=O的伸縮振動峰也從1662.28 cm-1移動至1651.42 cm-1,移動了約11個波數(shù);-COO-的反對稱伸縮振動峰從1548.76 cm-1移動到1546.85 cm-1,其對稱伸縮振動峰從1414.23 cm-1移動到1405.98 cm-1移動了約9個波數(shù);同理,當(dāng)羧基氧參與配位時,相當(dāng)于羧基上的碳氧鍵有一定程度的弱化,故吸收峰移向低頻,以上結(jié)果表明螯合之后,肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。

圖8 肽與肽-亞鐵螯合物的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of peptide and peptide-ferrous chelate

2.4肽與肽-亞鐵螯合物粒徑分析

肽與肽-亞鐵螯合物粒徑的分布如圖9所示,肽與肽-亞鐵螯合物的半徑分別為(144.23±5.86) nm和(453.66±8.74) nm,肽-亞鐵螯合物粒徑顯著增加(p<0.01),肽與亞鐵相互作用使粒徑的分布更加集中,并且信號得到加強(qiáng),說明螯合反應(yīng)不僅存在于分子內(nèi)相互作用,還存在于分子間。圖9說明亞鐵離子能使肽聚集、折疊形成肽-亞鐵螯合物[17]。

圖9 肽與肽-亞鐵螯合物的粒徑分布圖Fig.9 Particle size distributions of peptide and peptide-ferrous chelate

2.5肽與肽-亞鐵螯合物熒光光譜分析

肽含有的芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸,可以產(chǎn)生內(nèi)源性熒光,肽與亞鐵發(fā)生螯合反應(yīng)后,故熒光強(qiáng)度的降低可以反映肽-亞鐵螯合物在形成過程中發(fā)生了肽的折疊[18],如圖10所示,隨著FeCl2含量的不斷增加,熒光吸收帶從3822 nm顯著下降為3124.44 nm(p<0.05),當(dāng)FeCl2的濃度達(dá)到8 mmol/L時,隨濃度增加熒光強(qiáng)度的下降幅度變小,已無顯著變化,可能由肽與Fe2+結(jié)合導(dǎo)致了配位鍵的生成,隨著Fe2+含量的增加,肽沒有多余的位點(diǎn)與之結(jié)合,故肽參與的螯合反應(yīng)不再增強(qiáng),其熒光減弱程度也不再增強(qiáng)。圖10也表明在螯合反應(yīng)過程中,肽結(jié)構(gòu)發(fā)生了折疊和聚集,其特征結(jié)構(gòu)的變化與肽-鈣螯合物類似[19]。

圖10 肽與不同濃度的FeCl2的熒光光譜圖Fig.10 Fluorescence spectrum of peptide with different Fe2+ concentrations

2.6肽與肽-亞鐵螯合物圓二色譜分析

圓二色譜可以檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)的變化,198 nm附近的正峰和218 nm附近的負(fù)峰是典型的β折疊結(jié)構(gòu)形成的吸收峰,208 nm附近的負(fù)峰則是α螺旋形成的[20]。如圖11所示,肽在209 nm處有一個極強(qiáng)的負(fù)峰,而形成螯合物后,負(fù)峰紅移至217 nm,而且伴隨著摩爾橢圓率的增大;這是形成二級結(jié)構(gòu)的特征,說明α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B。如圖12所示,α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲均發(fā)生變化,其中肽中α螺旋、β折疊的含量為28.66%±1.54%、10.02%±1.04%,而肽-亞鐵螯合物中α螺旋、β折疊的含量為16.10%±1.96%、27.33%±1.08%。表明α螺旋、β折疊的含量發(fā)生顯著(p<0.05)變化,肽與亞鐵螯合后使得其二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了顯著改變,由于α螺旋是一種緊密的結(jié)構(gòu),而β折疊是一種較伸展的結(jié)構(gòu),由肽-亞鐵螯合物粒徑相較于肽有了大幅提高佐證了這一點(diǎn),生成螯合物后β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲沒有顯著變化。

圖11 肽與肽-亞鐵螯合物的圓二色譜圖Fig.11 Circular dichroism spectrum of peptide and peptide-ferrous chelate

圖12 肽與肽-亞鐵螯合物的二級結(jié)構(gòu)Fig.12 The percentage of secondary structure of peptide and peptide-ferrous chelate注:*表示螯合物與肽相比具有顯著差異(p<0.05)。

3 結(jié)論

本研究對脫鹽咸鴨蛋清肽-亞鐵螯合物的制備條件進(jìn)行了研究,通過正交實(shí)驗優(yōu)化了制備條件,即抗壞血酸與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.2∶1,鴨蛋清肽溶液的濃度為4%，肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為3∶1,pH為5.5,反應(yīng)時間為40 min,反應(yīng)溫度為40 ℃,乙醇的添加量為反應(yīng)液體積的7倍,在此條件下亞鐵的螯合率為65.15%,螯合物得率為44.46%。紅外光譜顯示Fe2+與肽的氨基端與羧基端相結(jié)合;熒光光譜表明螯合以后熒光猝滅導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低;激光粒度儀表明螯合以后半徑增大、圓二色譜說明螯合以后二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,故從結(jié)構(gòu)的層面證實(shí)了肽-亞鐵螯合物的形成。

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Preparationandcharacterizationofdesaltedduckeggwhitepeptide-ferrouschelate

LIBo,HOUTao,CHENGEn-min,HEHui*

(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Key Laboratory of Environmental Food Science of Ministry of Education,Wuhan 430070,China)

In this paper,desalted duck egg white peptides and FeCl2·4H2O was used as the raw material.Using chelating rate of ferrous and the yield of chelate as trace indexs,the preparation conditions of duck egg peptides-ferrous chelate were optimized,and the structure of peptides-ferrous chelate was characterized by IR,dynamic light scattering,fluorescence spectroscopy and circular dichroism. The results of single factor and orthogonal test showed that the optimal chelating reaction condition of duck egg white peptides-ferrous chelate was as follows:the mass ratio of VCto ferrous salt was 0.2∶1,the concentration of duck egg peptides was 4%,the ratio of peptides to ferrous salt was 3∶1,the pH value was 5.5,the temperature was 40 ℃,the reaction time was 40 min,and the amount of ethanol was 7 times of the volume of the reaction solution. Under these conditions,the chelating rate of ferrous was 65.15%,and the yield of the chelate was 44.46%.The Infrared spectrum showed that Fe2+binds to the amino terminus and the carboxyl terminal of peptide.The fluorescence spectrum showed that the fluorescence absorption band decreased from 3822 nm to 3124.44 nm with the increase of Fe2+(p<0.05).The laser particle size analyzer showed that the radius of peptide and peptide-ferrous chelate was(144.23±5.86) nm and(453.66±8.74) nm respectively.The circular dichroism showed that the content ofα-helix in the peptide was 28.66%±1.54% and 10.02%±1.04%,while the content ofα-helix andβ-sheet in peptide-ferrous chelate was 16.10%±1.96% and 27.33%±1.08%,both of which had changed significantly(p<0.05).The formation of peptides-ferrous chelate was confirmed from the structural.

duck egg white peptides;ferrous salt;chelate;chelating rate;characterization

2017-02-23

李博(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)，E-mail：1520615283@qq.com。

*通訊作者:何慧(1960-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)，E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn。

TS253.1

:B

:1002-0306(2017)16-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.032