響應面法優化酶解制備核桃多肽工藝

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(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

響應面法優化酶解制備核桃多肽工藝

陳樹俊,李樂,石玥,胡潔,徐曉霞,李佳益,張君梅,王翠連

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

核桃,多肽,響應面法,工藝優化,抗氧化活性

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃、萬歲子等,屬于胡桃科核桃屬植物[1],不僅富含優質脂肪、蛋白質、碳水化合物、維生素[2],還有豐富的卵磷脂、氨基酸及不飽和脂肪酸,不含膽固醇,而且味美可生食,可作為多種食品輔料,是一種優良的滋補品[3]。核桃蛋白是一種優質的植物蛋白資源,其中含有18種氨基酸,精氨酸和谷氨酸含量很高[4],其酶解產物核桃生物活性多肽是目前的研究重點[5],具有濃度高、溶解性好、抗氧化性強等特性[6],是很好的生產高蛋白流體的食品原料,此外,核桃肽還可做發酵火腿、酸奶以及風味酒等發酵食品的原料或添加劑[7]。已有相關研究報導:高瑞雄[8]等選用納豆芽孢桿菌對冷榨核桃粕進行液態發酵制得了核桃多肽；宗玉霞[9]以核桃粕為原料,經木瓜蛋白酶水解后,得到了核桃多肽水解液飲料；王端[10]等以脫脂核桃粉為原料,對其進行酶解從而成功制備出核桃多肽。目前我國核桃制品仍以干果及其粗加工品為主[11],營養物質利用程度不高[12]。核桃的深加工產品較少,如何有效的利用核桃的營養物質及其藥用成分不僅可以拓展核桃的利用途徑,還可以促進當地經濟發展,提高農民收入。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

核桃粉 蛋白含量84.79%,山西大學生物工程基礎實驗室自制;中性蛋白酶(60000 U/g)、酸性蛋白酶(50000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、風味蛋白酶(20000 U/g) 食品級,Solarbio北京索萊寶科技有限公司;酪蛋白磷酸肽CPP(Gly-Gly-Tyr-Arg) Sigma公司;甲醛溶液 36%～40%,成都市科龍化工試劑廠;總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒 南京建成生物工程有限公司;2,2-二苯代苦味?；诫伦杂苫?DPPH·) Sigma公司;氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、無水乙醇、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、鹽酸、三氯化鐵等 均為分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司。

JYL-c010料理機 九陽股份有限公司;B25 Series實驗室分散乳化均質機 上海貝而特機電設備科技有限公司;WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Labscale TFF System小型切向流超濾系統 美國Millipore公司;全不銹鋼HH-M8八孔恒溫水浴鍋 上海赫田科學儀器有限公司;電子分析天平 上海卓精公司;SC-3610低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠;其它為常規儀器。

1.2實驗方法

1.2.1 磨漿及評價指標 磨漿過程能夠使蛋白質溶出,這在很大程度上增加了蛋白水解酶的作用位點,為后續酶解提供基礎條件。以蛋白溶出率為指標,將高蛋白核桃粉與水以一定比例(料液比分別為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22 g/mL)通過料理機進行攪拌(16000 r/min,30 s),再轉移至實驗室高剪切分散乳化均質機中進行剪切(18000 r/min,3 min),得到核桃漿。

蛋白質質量根據GB/T 5009.5-2010進行測定,按照下式計算蛋白質溶出率。

蛋白質溶出率(%)=核桃漿蛋白質總質量/核桃粉蛋白質總質量×100

1.2.2 核桃蛋白酶解工藝

1.2.2.1 蛋白酶的選擇 以多肽質量濃度和水解度為指標,在加酶量7000 U/g,溫度45 ℃,pH 7.00,時間3 h條件下分別用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對核桃漿進行酶解,比較4種酶的酶解效果,選出適宜的蛋白酶。

在酶總量7000 U/g及其它條件不變的前提下,分別將兩種最適蛋白酶按照1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1復配,對核桃漿進行酶解。蛋白酶在酶解過程中會產生一些苦味肽,因此在確定最適復配比后與風味蛋白酶(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)協同水解去除苦味,改善口感。

1.2.2.2 酶解單因素實驗設計 以多肽質量濃度和水解度為指標,選取pH(6.60、6.80、7.00、7.20、7.40、7.60)、溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(4000、5000、6000、7000、8000、9000 U/g)、時間(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)4因素進行單因素實驗。酶解初始條件pH 7.00,溫度45 ℃,加酶量7000 U/g,時間3.0 h,控制變量法進行單因素條件篩選。

1.2.2.3 酶解響應面實驗設計 根據單因素實驗結果,結合Box-Behnken中心組合實驗設計原理,以多肽質量濃度和水解度兩個指標為響應值,選取pH、溫度、加酶量、時間4因素,采用Design-Expert V 8.0.6.1軟件進行4因素3水平響應面優化實驗,因素及水平設計見表1。

表1 中心組合實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of central composite experiment

1.2.2.4 蛋白酶解效果指標測定 水解度測定:氨基酸態氮含量根據GB/T 5009.39-2003中甲醛滴定法測定,按照下式計算水解度(DH)。

多肽質量濃度測定:用三氯乙酸水溶液(TCA,50 mg/mL)先后配制成0.000、0.172、0.344、0.516、0.688、0.860、1.032、1.204、1.376和1.548 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg(酪蛋白磷酸肽)四肽標準溶液,分別定容于10 mL容量瓶中,分別移取上述標準溶液6.0 mL與4.0 mL雙縮脲試劑混合均勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液在540 nm下測定OD值(第一管做空白對照)。以肽質量濃度為橫坐標x(mg/mL),OD值為縱坐標y制作標準曲線,得到公式:y=0.1351x+0.0092,R2=0.9947。

移取2.5 mL樣品溶液,加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸(TCA)水溶液,漩渦混合儀上混合均勻,靜置10 min。4000 r/min離心15 min,上清液用50 mg/mL TCA水溶液定容至25 mL容量瓶,搖勻[18-19]。再按照標準品實驗方法進行測定,對照所求標準曲線,即可得出樣品溶液中多肽質量濃度(mg/mL)。計算公式為:

式中:C為標準曲線中得到的多肽質量濃度(mg/mL)。

1.2.3 不同分子量核桃多肽制備 將最佳酶解條件下得到的核桃蛋白酶解液12000 r/min離心20 min,取上清液,經小型切向流超濾系統依次通過5、10和30 kDa分子量的超過濾膜進行分離,具體操作步驟按照說明書進行,依次制備分子量為≤5、5～10、10～30和≥30 kDa核桃多肽溶液。

1.3數據處理

本實驗中應用Excel和Origin 6.0軟件進行分析作圖,各組實驗重復三次,以平均值±標準偏差來表示,響應面設計與分析采用Design-Expert V 8.0.6.1軟件。

2 結果與分析

2.1核桃磨漿料液比的確定

如圖1所示，隨料液比增大，蛋白質溶出率呈現逐漸上升的趨勢，當料液比達到1∶20 g/mL時，蛋白質溶出率變化開始趨于平緩，說明此時通過磨漿大部分核桃蛋白質已基本溶出，達到最佳磨漿效果，再繼續加大料液比溶液過稀導致蛋白質量濃度過低不利于后續酶解操作，綜合考慮選取料液比1∶20 g/mL,此時蛋白質量濃度為3.62 g/100 mL。

圖1 不同料液比對蛋白質溶出率的影響Fig.1 Effect of walnut-to-water on dissolution rate of protein

2.2核桃蛋白酶解工藝實驗結果

2.2.1 蛋白酶的選擇 由圖2可知,從多肽質量濃度和水解度兩個指標來看,堿性和木瓜蛋白酶的水解效果均高于中性和酸性蛋白酶,經中性蛋白酶酶解的核桃漿顏色變暗,且有異味,酸性蛋白酶水解效果較差,故選擇堿性和木瓜蛋白酶進行復配。如圖3所示,堿性和木瓜蛋白酶的復配起到了“協同增效”的作用[21],且在堿性與木瓜蛋白酶復配比例為1∶1時多肽質量濃度和水解度均達到最高,因此最佳配比確定為1∶1。由于核桃漿在蛋白酶解過程中會產生一些苦味肽,風味蛋白酶的添加可以切斷苦味肽鍵,從而改善蛋白液的口感[21]。圖4為不同風味蛋白酶添加量的水解效果,可以明顯看出風味蛋白酶添加量從2000 U/g起,再添加酶量并不能提高水解效果,故最終確定風味蛋白酶添加量為2000 U/g。

圖2 不同蛋白酶的水解效果Fig.2 Effect of different protease on hydrolysis

圖3 堿性和木瓜蛋白酶不同復配比例的水解效果Fig.3 Effect of mixing ratios of the alkaline protease and papain on hydrolysis

圖4 風味蛋白酶不同添加量的水解效果 Fig.4 Effect of dosage of flavourzyme on hydrolysis

2.2.2 酶解單因素實驗結果

2.2.2.1 pH對多肽質量濃度和水解度的影響 如圖5所示,隨pH增大,多肽質量濃度和水解度均呈現先增后減趨勢,這是由于每一種酶都有其適應的pH范圍,偏酸或偏堿都會破壞酶結構,影響酶與底物相互作用[22]。在pH為7.0時多肽質量濃度達到最大值7.50 mg/mL,水解度也達到最大值10.06%,因此選擇最適pH 7.0。

圖5 pH對多肽質量濃度和水解度的影響Fig.5 Effect of pH on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.2 溫度對多肽質量濃度和水解度的影響 如圖6所示,在一定溫度范圍內,提高溫度會使多肽質量濃度和水解度增加,升溫會提高分子運動程度,增大酶與底物的碰撞幾率從而加速酶促反應;但酶也是蛋白質,溫度過高會破壞酶分子結構從而失活使多肽質量濃度和水解度降低,在50 ℃時多肽質量濃度達到最大值8.07 mg/mL,水解度達到最大值11.15%,因此選擇最適溫度50 ℃。

圖6 溫度對多肽質量濃度和水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.3 加酶量對多肽質量濃度和水解度的影響 如圖7所示,酶解液多肽質量濃度和水解度隨加酶量加大而增大,達到8000 U/g時,變化平緩。原因可能是,酶量的增加能夠促進酶解反應的進行,但底物是有限的,當酶量達到飽和時,過多的酶未能參加反應,反而給酶解液帶來雜質[6],考慮到節約成本,提高多肽質量的因素,最適酶量定為8000 U/g,此時多肽質量濃度8.69 mg/mL,水解度11.45%。

圖7 加酶量對多肽質量濃度和水解度的影響Fig.7 Effect of different enzyme volume on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.4 時間對多肽質量濃度和水解度的影響 如圖8所示,從2.5 h到3.0 h,多肽質量濃度和水解度增加比較明顯,繼續延長時間多肽質量濃度和水解度變化趨于平緩,這是由于產物濃度的增加抑制了反應的進行[6]。為了節省能源、降低成本,在生產過程中選擇最適時間3.0 h,此時多肽質量濃度7.77 mg/mL,水解度9.71%。

圖8 時間對多肽質量濃度和水解度的影響Fig.8 Effect of different time on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.3 響應面實驗結果 對表2多肽質量濃度(Y1)和水解度(Y2)的實驗數據進行多元回歸擬合后,得到核桃蛋白酶解的多肽質量濃度和水解度對pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)、時間(D)各因素變量的二次多元回歸方程分別為:

表2 響應面實驗方案與結果Table 2 Response surface experimental design and test results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

注:***差異極顯著,p<0.001;**差異高度顯著,p<0.01;*差異顯著,p<0.05。

2.2.4 各因素交互作用的響應面分析 根據各二次回歸方程可以做出響應面分析圖,可以直觀反映出各自變量和所擬合的響應面形狀對各響應值的影響。

圖9 四因素對多肽質量濃度的響應曲面圖Fig.9 Response surface of four factors on peptide mass concentration

2.2.4.1 各因素交互作用對多肽質量濃度的響應曲面分析 各因素交互作用對多肽質量濃度影響的響應曲面以及等高線如圖9所示,由圖9(a)可知,以加酶量和時間為中心水平值時,樣品多肽質量濃度隨著溫度和pH的增加呈現先上升后下降趨勢,等高線較密集,且呈現為橢圓形,表明溫度和pH交互作用顯著。由圖9(c)可知,以溫度和加酶量為中心水平值時,樣品多肽質量濃度隨pH增加先上升后下降,隨時間上升而后趨于平緩,等高線呈橢圓形,表明時間和pH交互作用顯著。

2.2.4.2 各因素交互作用對水解度的響應曲面分析 各因素交互作用對水解度影響的響應曲面以及等高線如圖10所示,由圖10(a)可知,樣品水解度隨著溫度和pH增大呈現先上升后下降趨勢,且等高線較為密集,接近橢圓形,說明溫度和pH交互作用對水解度影響顯著。由圖10(e)可知,樣品水解度隨時間增大而先上升后趨于平緩,等高線接近橢圓形,表明溫度和時間交互作用對水解度影響顯著。

圖10 四因素對水解度的響應曲面圖Fig.10 Response surface of four factors on degree of hydrolysis

2.2.5 驗證實驗 實驗結果經Design-Expert優化后得到了兩個模型的最優條件:pH7.11,溫度51.36 ℃,加酶量7998.11 U/g,時間3.05 h,此時多肽質量濃度理論值最高為10.11 mg/mL,水解度理論值為11.72%。為驗證最佳實驗結果的準確性,考慮到實際操作條件的可行性,設定最優條件為:pH 7.10,溫度50 ℃,加酶量8000 U/g,時間3.0 h,在此條件下進行三次重復實驗后測得多肽質量濃度平均值為10.01 mg/mL,水解度平均值為11.45%,與理論值接近,說明經過響應曲面法得到的優化工藝參數可靠性較高,與實際情況相符合,具有一定的應用價值。

2.3 不同分子量多肽抗氧化活性比較

2.3.1 不同分子量多肽質量分數 由表4可知,酶解液經超濾分離得到4種分子量多肽液,其中≤5 kDa分子量多肽液占多肽液的64.94%,質量分數最高,其次是5～10 kDa、≥30和10～30 kDa分子量多肽。

表4 不同分子量多肽的質量分數Table 4 The mass fraction of different molecular peptides

2.3.2 還原力分析 不同分子量多肽還原力均隨多肽質量濃度增加而增大,且增加幅度相近,對多肽質量濃度和吸光度值進行線性擬合,以多肽質量濃度為x,吸光度值為y,得到各分子量多肽還原力的線性回歸方程如表5所示,通過IC50的對比,可以得出還原力強弱順序依次是:≤5、10～30、≥30和5～10 kDa分子量多肽。

表5 不同分子量多肽還原力分析Table 5 Determination of reducing power of different molecular peptides

2.3.3 DPPH·清除能力分析 4種分子量多肽的DPPH·清除率均隨多肽質量濃度增加而增大,以多肽質量濃度為x,DPPH·清除率為y,得到各分子量多肽對DPPH·清除率線性回歸方程如表6所示,≤5 kDa的多肽增加趨勢高于其它三種多肽。由表6中IC50的對比可以得出DPPH·清除能力強弱順序依次是:≤5、≥30、5～10和10～30 kDa分子量多肽。

表6 不同分子量多肽DPPH·的清除能力分析Table 6 Determination of DPPH· scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.4 ·OH清除能力分析 以多肽質量濃度為x,·OH清除率為y,4種分子量多肽對·OH清除率線性回歸方程如表7,可以看出≥30 kDa的多肽增加趨勢不如其它三種多肽,通過IC50的計算得出·OH清除能力強弱順序依次是:≤5、5～10、10～30和≥30 kDa分子量多肽。

表7 不同分子量多肽·OH的清除能力分析Table 7 Determination of ·OH scavenging capacity of different molecular peptides

表8 不同分子量多肽的清除能力分析Table 8 Determination of · scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.6 總抗氧化能力分析 按照試劑盒方法對四種分子量多肽進行總抗氧化能力的測定,保證各分子量多肽質量濃度均為10 mg/mL,測定結果見表9,四種分子量的多肽都有一定的總抗氧化能力,且≤5 kDa的多肽總抗氧化能力最強,為14.18 U/mL。

表9 不同分子量多肽總抗氧化能力測定結果Table 9 Total antioxidant capacity measurement results of different molecular peptides

3 結論與討論

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Optimizationofenzymatichydrolysisofwalnutpeptidebyresponsesurfacemethodology

CHENShu-jun,LILe,SHIYue,HUJie,XUXiao-xia,LIJia-yi,ZHANGJun-mei,WANGCui-lian

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

walnut;peptide;response surface methodology;process optimization;antioxidant activity

2017-02-28

陳樹俊(1964-)，男，本科，副教授，研究方向：食品新工藝與功能食品，E-mail：chenshujun515@163.com。

山西省重點研發計劃項目(201603D221033-1)。

TS255.6

:A

:1002-0306(2017)16-0142-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.027