N-乙酰神經氨酸合成途徑在枯草芽孢桿菌的構建

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(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;2.中國科學院大學,北京 100049;3.上海科技大學,上海 201210;4.上海大學,上海 200444)

N-乙酰神經氨酸合成途徑在枯草芽孢桿菌的構建

李思杰1,2,3,紀明華1,趙利超1,4,史吉平1,3,孫俊松1,3,*

(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;2.中國科學院大學,北京 100049;3.上海科技大學,上海 201210;4.上海大學,上海 200444)

對食品安全認可的枯草芽孢桿菌進行菌株改造,利用生物發酵法制備N-乙酰神經氨酸。首先通過基因合成獲取來自枯草芽孢桿菌溶源體的Pholin啟動子并構建了pMK4-Pholin-GFP質粒,轉入枯草芽孢桿菌,以GFP為報告基因,對Pholin及其它常見的強啟動子進行了轉錄效率的比較,然后將優化后的Pholin用于構建N-乙酰神經氨酸表達質粒pMK4-Pholin-neuBC。研究結果顯示:Pholin啟動子是一種優異的枯草芽孢桿菌組成型強啟動子,在利用LB進行發酵培養的實驗中,Pholin的轉錄效率為同樣方式構建下的P43啟動子的2.62倍。通過N-乙酰神經氨酸表達質粒,可以成功地在枯草芽孢桿菌168菌株中實現N-乙酰神經氨酸的重組生產,搖瓶培養中N-乙酰神經氨酸的產量為0.226 g/L。本文為枯草芽孢桿菌進行N-乙酰神經氨酸的工業化發酵生產奠定了研究基礎。

啟動子,N-乙酰神經氨酸,枯草芽孢桿菌

N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)能促進大腦發育,具有改善人體記憶力、抗病毒等功效,在食品保健品和醫藥領域均有重要的用途[1]。但是,N-乙酰神經氨酸單體的制備成本較高,因此近年來多種微生物被用于N-乙酰神經氨酸的外源生產,如大腸桿菌通過外源表達UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶基因(neuC)和N-乙酰神經氨酸合成酶基因(neuB),并通過敲除相關的基因已經可以高產Neu5Ac[2],但大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌,在發酵過程中會積累大量的內毒素[3]。因此,利用食品安全領域認可的枯草芽孢桿菌進行Neu5Ac的發酵生產具有重要的研究和應用前景。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

枯草芽孢桿菌對營養的要求不高,生長迅速,發酵密度高,其微生物菌體或發酵產品在食品和制藥領域均有廣泛的應用價值[4];枯草芽孢桿菌在外源蛋白生產時,不僅表達量高,還可借助強大的分泌系統進行分泌表達,可以大大降低外源蛋白的分離成本,因此是許多食品工業用酶的首選宿主細胞。但枯草芽孢桿菌的遺傳操作不如大腸桿菌便捷高效,然而近年來枯草芽孢桿菌表達系統得到了全面的提升,無論遺傳工具還是宿主細胞生產性能的優化,均取得了大量成果,可使用的遺傳工具逐步增多,為枯草芽孢桿菌的改造創造了條件。枯草芽孢桿菌168菌株為實驗室常用的菌株,其轉化效率較高,遺傳及代謝圖譜比較清晰;與其相近的枯草芽孢桿菌164菌株(ATCC 6051a)基因組序列也已公開,對于外源蛋白具有更好的分泌效果,但轉化操作不及168菌株[5]。本實驗室通過將comk基因[6]整合到枯草芽孢桿菌164菌株中,利用comk的誘導表達將164菌株的轉化效率提高了千倍以上,得到了具有更高轉化效率的枯草芽孢桿菌164S菌株。

此外,在枯草芽孢桿菌表達系統的優化過程中,高效啟動子的搜尋、驗證和應用一直是一項十分重要的研究內容,盡管有不少已被工業應用,如P43、PxylA、PamyQ、P1398等[7-8],但是由于蛋白種類及基因大小、蛋白折疊等各方面的差異性,仍然需要更多不同的高效啟動子以滿足不同重組生產菌株構建的需要。研究發現含Φ105前噬菌體的枯草芽孢桿菌168溶源菌,因為噬菌體強大的表達元件,在工業酶生產菌株的構建中得到應用[9],而Φ105是一類溫和的噬菌體,可以作為載體,高效而特異地將外源基因整合到枯草芽孢桿菌168菌株[10]。Yun-Chung Leung等將Φ105噬菌體Holin蛋白編碼區進行了改造,使其具有插入外源基因表達外源蛋白的性能[11]。為了避免完整噬菌體基因組DNA引入細胞后帶來的菌株裂解的風險,在本研究中,分離了Pholin啟動子,并對其核心序列進行了優化,將基因合成后的啟動子克隆到質粒pMK4-GFP載體中,以GFP的激發熒光量為標記,進行Pholin與P43、P1398及PxylA的轉錄效率的對比;并將N-乙酰神經氨酸合成酶(neuB)和UDP-G1cNac 2-差向異構酶(neuC)的基因克隆到Pholin之后,構建了Neu5Ac的合成途徑,利用枯草芽孢桿菌進行了Neu5Ac的重組表達。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

實驗中用到的質粒及菌種 均見表1;枯草芽孢桿菌培養的LB培養基 酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L;Neu5Ac合成發酵所用的甘油培養基 甘油40 g/L,氯化銨4.0 g/L,氯化鉀2.5 g/L,硫化鎂0.9 g/L,胰蛋白胨2.5 g/L,碳源中所用的甘油可由10～20 g/L的葡萄糖所代替;限制性內切酶PstI、EcoRI、XmaI 購自賽默飛世爾公司;Taq DNA聚合酶及Primer star 購自寶生物工程(大連)有限公司;木糖及N-乙酰神經氨酸標準品 購自國藥集團化學試劑有限公司;PCR清潔試劑盒、質粒小劑量提取試劑盒等 來自杭州愛思進生物技術有限公司;One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA測序及合成 由上海生工生物工程公司完成。

Synergy H1型酶標儀 美國Bio Tek公司;S1000型PCR儀器 美國BIO-RAD公司;HE90型DNA凝膠電泳系統 上海天能公司;RID-10A/SPD-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2實驗方法

圖1 Pholin啟動子序列Fig.1 Alignment of DNA sequences of Pholinpromoters注:序列中上一行為優化后的,下面的一行為原始啟動子序列,加粗的序列為Xma I位點,方框中所列的為修改前后的保守區啟動子序列,其中“.”為堿基缺失位點。

1.2.1 Pholin啟動子序列的優化和構建 Pholin啟動子存在兩個明顯的由-35和-10組成的雙啟動區,第一個啟動區的-35區域的TAAACA在設計中替換為更經典的TTGACA,而-10區域TTTTAT堿基序列替換為TATAAT;再將第二個啟動區域的-35區域TAGACA堿基序列替換為TTAGCA,而-10區域TTGAG被更改為TATAAT,如圖1所示。優化后的Pholin啟動子序列送交公司進行DNA合成,并TA克隆到pUC57載體上,該啟動子Pholin還設計了XmaI位點(圖1中黑色粗體字)用于啟動子的克隆,以完成GFP表達質粒pMK4-Pholin-GFP及N-乙酰神經氨酸合成途徑表達質粒pMK4-Pholin-neuBC的構建。

1.2.2 Pholin啟動子表達效率驗證 不同啟動子以相同的方式克隆到pMK4質粒上,將構建的五種表達質粒pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP分別轉入枯草芽孢桿菌164S菌株[13]。其中,質粒pMK4-GFP攜帶表達GFP的基因,但是不含啟動子元件。分別挑取3～5個不同的轉化子,進行搖瓶發酵并測定GFP蛋白熒光表達量。在搖瓶發酵時,將種子液按照1%的比例接種于裝有50 mL發酵培養基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振蕩連續培養48 h,每間隔4 h進行取樣,測定細胞的生物量和GFP熒光強度。

細胞的生物量的測定方法:將發酵培養液經過連續倍比稀釋后,測量OD600值,并將獲得的0.3～0.5區間的值乘以稀釋倍數得到樣品的準確OD600,以此作為生物量進行對比。

GPF熒光測定方法:對搖瓶發酵菌液進行取樣,菌液經梯度稀釋100倍后用于GFP的熒光檢測。取200 μL稀釋后的菌液置于96孔板中,放入酶標儀進樣器中開始熒光測定,測量時選擇熒光檢測模式,讀數類型選擇“endpoint”,設定激發光波長為485 nm,檢測光波長為520 nm,設定測量溫度30 ℃。

1.2.3 Neu5Ac合成菌株的構建 含有neuB及neuC的DNA片斷通過基因合成獲得,以質粒pUC57-neuBC為DNA模板,所需引物分別為neuF1:GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCCTATCATTTTATAT CCTTAAAAACTTTTTGTGTGC,以及neuR1:GGGGG CAGTTTAGAACCCGGGTAACAAGGAGGAATAAAAA ATGAAAGAAATAAAAATAC;質粒pMK4-Pholin-GFP進行XmaI/EcoRI 雙酶切并經清潔后,按1∶3的比例和純化后的PCR產物進行一步法克隆(InFusion Cloning),所用試劑盒為One Step Cloning Kit,電轉感受態大腸桿菌DH5α后[14],經酶切和測序驗證獲得neuBC的表達質粒pMK4-Pholin-neuBC,再以電轉化的方法將該質粒轉入枯草芽孢桿菌168中[15],構建N-乙酰神經氨酸的重組生產菌株。

1.2.4 Neu5Ac合成的發酵 Neu5Ac搖瓶發酵時,先挑取3個不同的重組子單克隆,接入LB種子培養基,再將種子液以1%體積比接種至裝有50 mL發酵培養基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振蕩培養48 h。在第一批發酵數據收集時,加入甘油的含量為20 g/L,但由于細胞生長緩慢,對培養基的碳源進行了替代優化;第二批發酵數據收集時,一組發酵培養基,將甘油的含量補加至40 g/L;另一組,將甘油替換為1%含量的葡萄糖。

1.2.5 液相色譜測定Neu5Ac含量 利用液相色譜測定Neu5Ac產量,所用色譜柱為Aminex HPX-87H柱,檢測器為島津RID-l0A型示差檢測器,檢測參數設定為流動相為5 mmol/L H2SO4,流速為0.8 mL/min,柱溫為65 ℃,進樣量為20 μL。先進行N-乙酰神經氨酸標準曲線的繪制。具體為,稱量Neu5Ac標品,用去離子水稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L五個濃度,根據上述條件進行分析。收集數據后,以Neu5Ac濃度為縱坐標Y軸,對應的液相色譜峰面積為橫坐標X值,繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程為Y=0.00000544X+0.0171,相關系數R2=0.9999107。收集的發酵液樣品,12000 r/min離心5 min,取20 μL上清液以同樣的方法進行測定,并根據公式將峰面積換算得出Neu5Ac的濃度。

2 結果與分析

2.1含Pholin啟動子的表達質粒構建

Pholin在枯草芽孢桿菌中并沒有被單獨使用過,根據其序列的特點,針對引發高效轉錄的兩個保守區,均進行了序列優化(圖1),然后將設計的啟動子序列送交生物公司進行了DNA合成,并TA克隆到載體pUC57上,將pUC57-Pholin和攜帶啟動子P43的質粒pMK4-P43-GFP同時進行限制性內切酶PstI和XmaI消化,酶切片斷以試劑盒清潔后進行連接,構建了pMK4-Pholin-GFP質粒(圖2左半部分所示);neuBC同樣經基因合成并TA克隆到載體pUC57上,并以pUC57-neuBC為模板獲得含neuBC的PCR產物,該DNA與經XmaI/EcoRI酶切的質粒pMK4-Pholin-GFP進行一步法克隆(圖2右半部分所示),得到表達N-乙酰神經氨酸合成途徑的質粒pMK4-Pholin-neuBC。

圖2 表達質粒pMK4-Pholin-GFP和pMK4-Pholin-neuBC的構建Fig.2 Construction of pMK4-Pholin-GFP and pMK4-Pholin-neuBC

2.2 Pholin啟動子表達效率的比較研究

圖3 綠色熒光蛋白在LB培養基中的表達以及生物量的變化曲線Fig.3 The profile of cellular biomass and emitted GFP fluorescence of recombinant cells cultivated in LB broth

將分別轉化了pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP質粒的枯草芽孢桿菌164S重組菌株,進行連續培養,測定細胞的OD600值和GFP熒光強度。圖3(a)結果清晰地顯示,含pMK4-GFP的重組菌,因質粒不含啟動子,發酵過程中,熒光值一直很低;而其它重組菌均表達了大量的GFP,但是菌液在稀釋后測得的熒光值顯示,48 h時Pholin啟動子帶來的熒光表達強度值為55799.0 a.u.,與其他啟動子橫向比較,為PxylA啟動子的4.28倍,P43啟動子的2.62倍,P1398啟動子的1.88倍。由此可以證明Pholin啟動子是一個非常優異的組成型強啟動子,其啟動效應強于傳統的組成型P43啟動子及誘導型PxylA和P1398啟動子。此外,由生物量測定曲線可看出,搖瓶發酵培養24 h后,枯草芽孢桿菌164S重組菌開始進入延滯期,GFP的表達也趨近于飽和,熒光增加開始放緩,說明Pholin啟動子的轉錄模式為典型的組成型方式。圖3(b)所示,攜帶不同質粒的重組枯草芽孢桿菌的生長和細胞數幾乎完全一致,在0～28 h細胞持續增殖,而在32 h之后OD600逐漸下降。但搖瓶發酵過程中GFP的熒光值卻呈現不一樣的變化,但基本趨勢是隨著發酵時間的延長,實時熒光量不斷增加,這是由于GFP蛋白與細胞的衰竭速率不一致造成的。

2.3 N-乙酰神經氨酸的表達研究

利用Neu5Ac合成途經的重組菌株進行搖瓶發酵,所用的培養基以甘油為碳源,這是由于前期實驗數據表明,在類似的培養基中,以甘油為碳源可以產生較高的N-乙酰神經氨酸。如圖4(a)所示,N-乙酰神經氨酸的表達量,隨著發酵時間的延長而增大,在36 h左右達到最大值,濃度為0.226 g/L。利用微生物發酵法,重組大腸桿菌Neu5Ac的產量在高密度發酵時可以達到7.85 g/L[16],而在枯草芽孢桿菌重組菌的高密度發酵中,Neu5Ac的產量的提高也不多(數據未顯示),因此推測枯草芽孢桿菌存在可能的Neu5Ac分解代謝途徑,未來將從分析枯草芽孢桿菌的代謝網絡調控方面著手,通過Neu5Ac分解旁路途徑的敲除來提高Neu5Ac的發酵產量。此外,如圖4(b)所示,在1.0%甘油為碳源的培養基中,重組168菌株的細胞量出現增長緩慢的現象,發酵液的最高OD600低于1.2,推測可能是由于Pholin啟動子的高轉錄水平給宿主細胞帶來尚不知原因的代謝負擔,而當培養基中的碳源更換成1.0%葡萄糖時,菌株的最高OD600可以提高到3～4之間,但是還是沒法達到如圖3(b)所示的164重組菌株的細胞量。而且,將主要碳源更換成葡萄糖,或者以164為宿主細胞進行發酵,這兩種措施均可以提高細胞的生物發酵量,但是Neu5Ac的合成量卻更低(數據未顯示),提示neuBC轉錄水平的高低可能不是影響Neu5Ac合成量的關鍵因素。因此,有必要在未來把Pholin啟動子構建到其它外源蛋白的表達系統中,通過與已知高效生產菌株的比較及分析,以進一步提升該啟動子在芽孢桿菌菌株設計及優化中的應用前景。

圖4 枯草芽孢桿菌168菌株發酵生產N-乙酰神經氨酸的產量和生物量積累Fig.4 The yield of Neu5Ac by recombinant Bacillus subtilis 168 and its growth curve in shaking flasks

3 結論

以開發更高效食品工業酶的枯草芽孢桿菌表達系統為目的,以來自噬菌體的Pholin為目標,運用序列優化、基因合成的方式進行分子改造,并以GFP為報告蛋白,證明從前噬菌體分離出的Pholin啟動子具有很強的啟動效應;還構建了N-乙酰神經氨酸的合成途徑,通過neuBC的表達,使枯草芽孢桿菌得以合成Neu5Ac,其在搖瓶發酵中產量達到了0.226 g/L。同時研究中還發現,neuBC的強表達會導致宿主細胞的高密度生長受限,提示組成型強表達的neuBC可能不是提高Neu5Ac產量的關鍵因素,因此后續研究中將對Pholin進行進一步改造,加入具有IPTG誘導效應的調控序列使其成為誘導型啟動子[17],同時開展Neu5Ac重組生產菌株的高密度發酵研究,以大幅提高Neu5Ac的表達水平。

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ConstructionofN-acetylneuraminicacidsynthesispathwayinBacillussubtilis

LISi-jie1,2,3,JIMing-hua1,ZHAOLi-chao1,4,SHIJi-ping1,3,SUNJun-song1,3,*

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.ShanghaiTech University,Shanghai 201210,China; 4.Shanghai University,Shanghai 200444,China)

Synthesis of N-acetylneuraminic acid usingBacillussubtilisis favorable due to high expression level and the fact thatB.subtilismeets the strict safety criteria for application in food industry. In this study,a recombinantBacillussubtiliswas constructed and used for fermentation studie in N-acetylneuraminic acid production. First,a unique promoter Pholinoriginated fromB.subtilislysogen was optimized for heterologous transcription,which level was evaluated by comparison study together with other promoters routinely used inBacillus. The results showed that GFP fluorescence level from recombinant strain containing plasmid pMK4-Pholin-GFP was 2.62 times of that obtained by promoter P43. The acetylneuraminic acid expression cassetteneuBCwas then inserted behind Pholinin pMK4 to construct pMK4-Pholin-neuBC,which was transformed intoB.subtilis168. The recombinantB.subtiliswas able to produce up to 0.226 g/L N-acetylneuraminic acid in fermentation study using shaking flasks,which laid a solid basis for further strain optimization and industrial production of N-acetylneuraminic acid.

promoter;N-acetylneuraminic acid;Bacillussubtilis

2017-02-13

李思杰(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：lixuan7707@sina.com。

*通訊作者:孫俊松(1974-)男，博士，研究員，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：sunjs@sari.ac.cn。

上海市科委長三角技術聯合攻關領域項目(15295810600)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0131-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.025