ARTP誘變選育高產海藻糖菌株及酶促反應條件優化

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(江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

ARTP誘變選育高產海藻糖菌株及酶促反應條件優化

田成福,張偉國,徐建中,劉冬冬,史仲平*

(江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

以實驗室保藏的節桿菌屬菌株Arthrobactersp. SH為出發菌株,經常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變選育后,篩選到一株以淀粉為原料TreY-TreZ途徑生產海藻糖的高產突變菌株Arthrobactersp. SH-52。該突變菌株酶催化能力達到129.6 U/mL,比出發菌株提高了46.1%。對菌株Arthrobactersp. SH-52的酶促反應條件進行優化,結果表明,酶促反應最適溫度45 ℃,最適反應時間30 h,最適初始pH 6.5,最適底物為濃度20%的淀粉液化液(DE值為11.9)。經酶促反應優化后,采用未經純化的粗酶液進行催化,轉化率達到37.6%。實驗結果表明ARTP誘變是選育高酶活海藻糖生產菌的有效方法,研究結果對工業化生產海藻糖具有一定的借鑒價值。

海藻糖,常壓室溫等離子體誘變,TreY-TreZ途徑,淀粉液化液

自然界中的海藻糖多是由兩個葡萄糖殘基經α-1,1糖苷鍵構成的非還原性二糖,廣泛存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、昆蟲等生物體內[1]。海藻糖不但能夠作為一些生物體的能源物質,還是一種重要的應激代謝產物。研究表明海藻糖無論在生物體內還是體外均可以保護生物細胞及活性大分子,使其免受高溫、干旱、冷凍、高滲等環境下的破壞[2-3]。因此,海藻糖在分子生物學、醫藥、食品、化妝品等領域有著廣泛的應用前景。

現已研究發現,海藻糖在生物體內有多種合成途徑[4],其中麥芽寡糖基海藻糖途徑(TreY-TreZ途徑)以廉價的淀粉為原料,利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,TreY基因編碼)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyl trehalose hydrolase,MTHase,TreZ基因編碼)的協同作用,將一定鏈長的直鏈淀粉轉化為海藻糖。該途徑具有特異性較高,快速溫和等優點,是工業化生產海藻糖的重要方法之一[5-6]。目前國內酶法生產海藻糖的轉化率較低,成本較高,限制了海藻糖的廣泛應用,因此獲得高MTSase和MTHase酶活力的菌株是酶法生產海藻糖的關鍵。ARTP誘變是近幾年發展起來的新型誘變技術,它具有對操作者安全、環境友好、操作簡便、突變快速、突變率高、獲得的突變體性狀穩定等特點,目前已經應用到各類微生物育種過程中[7]。

本研究對實驗室保藏的Arthrobactersp. SH進行常壓室溫等離子體誘變,篩選得到一株菌體生長良好的高MTSase和MTHase酶活力的菌株,并對誘變菌株的酶促反應條件進行探究。研究結果可望為通過選育高產海藻糖菌株,實現利用酶法工業化生產海藻糖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

出發菌株(Arthrobactersp. SH) 本實驗室保藏的節桿菌;耐高溫α-淀粉酶(40000 U/mL)、普魯蘭酶(1000 ASPU/mL)、糖化酶(10000 U/mL) 均購自江蘇銳陽生物科技有限公司;可溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨 均購自國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉、MgSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4均為國產分析純;葡萄糖(食品級,純度92%) 購自山東西王集團;平板完全培養基(g/L) 牛肉膏10,蛋白胨10,葡萄糖(食品級)5,氯化鈉5,MgSO4·7H2O 0.5,瓊脂20,pH 6.8,0.1 MPa 滅菌20 min;種子培養基(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,葡萄糖(食品級)5,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,0.1 MPa 滅菌20 min;產酶培養基(g/L) 葡萄糖(食品級)30,蛋白胨10,酵母浸膏2,Na2HPO4·12H2O 0. 6,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,pH 6.8,90 kPa 滅菌15 min。

HYL-B全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗有限責任公司;SHA-B恒溫水浴振蕩器 常州國華企業;ARTP-III型常壓室溫等離子體生物誘變系統 北京思清源生物科技有限公司;ST16型臺式離心機 美國賽默飛世爾科技公司;超聲波破碎儀 美國SONICS公司;721N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種的活化與培養 將菌株接種于平板完全培養基上進行活化,置于30 ℃恒溫培養箱中培養40 h左右;將活化后的菌株接種于種子培養基,250 mL三角瓶裝液量30 mL,在搖瓶柜中30 ℃ 100 r/min培養14～18 h;培養好的種子培養基以2%的接種量接種于產酶培養基,50 mL產酶培養基裝在500 mL三角瓶中,在搖瓶柜中30 ℃ 100 r/min 培養40 h。

1.2.2 ARTP誘變時間的確定 取處于對數生長期的菌體,用無菌生理鹽水洗滌并重懸,制成菌懸液,控制菌體OD600在0.5～0.6。吸取10 μL菌懸液,均勻涂于ARTP系統的載片上,啟動ARTP誘變系統,進行酒精消毒,紫外滅菌。設置儀器的功率為100 W,氣流量為10 SLM,處理時間分別設置為0、10、20、30、40、50 s。處理完畢后用無菌生理鹽水對載片上的菌體進行洗脫,適當稀釋后分別涂布于平板培養基中,用黑布包裹放于28 ℃恒溫培養箱中培養30～40 h,以未誘變的培養皿為對照,統計菌落數,計算致死率,并確定最佳誘變時間。

1.2.3 誘變菌株的篩選方法 菌株經誘變后從中挑選菌落出現較早,形態大小各異,長勢旺盛的單菌落進行產酶培養,毎個單菌落設置3個平行,分別測定各誘變菌株的菌體濃度以及菌株的酶催化能力。從中篩選酶催化能力高的菌株,并以此為出發菌株進行下一輪誘變篩選。

1.2.4 分析檢測方法

1.2.4.1 菌體濃度(OD600)測定 產酶培養結束后,將培養液稀釋20倍,在600 nm處測定吸光度。

1.2.4.2 致死率計算 致死率(%)=100×(對照組活菌數-誘變組活菌數)/對照組活菌數。

1.2.4.3 轉化率計算 海藻糖轉化率(%)=反應體系中海藻糖質量濃度/反應體系中淀粉質量濃度×100。

1.2.4.4 海藻糖定性分析 采用薄層層析法,參照文獻[8]。

1.2.4.5 海藻糖定量分析 采用DNS法,參照文獻[9]。

1.2.5 酶催化能力測定 菌株產酶培養結束后,用pH6.5 25 mmol/L的磷酸緩沖液離心收集菌體并洗滌一次,重懸菌體后保持各實驗組菌體濃度一致,加入1 mg/mL溶菌酶37 ℃水浴處理1 h。經超聲波法300 W下工作1 s間歇2 s,破碎8 min后離心得粗酶液上清。取4 mL粗酶液,等體積加入150 U/g(淀粉)普魯蘭酶處理過的20%淀粉液化液,45 ℃水浴振蕩反應30 h,沸水浴10 min終止反應后加入1000 U/g(淀粉)糖化酶水解殘余的麥芽糊精,水解24 h后沸水浴終止反應,離心取上清,采用DNS法測定海藻糖的量。一個酶活單位定義為每小時合成1 mg海藻糖所需酶的量[10],計算產酶培養結束后單位體積培養液的酶活。

1.2.6 粗酶液制備海藻糖的工藝優化 采用控制變量法,進行單因素實驗,分別考察反應溫度、反應時間、初始pH、淀粉液化液的濃度、DE值對粗酶液催化反應的影響。

1.2.6.1 海藻糖合成途徑的初步驗證 分別配制濃度為20%的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖、淀粉液化液作為反應底物。分別取4 mL底物等體積加入250 U/mL的粗酶液,在初始pH6.5,45 ℃下水浴振蕩反應30 h。反應結束經糖化后采用薄層層析法定性檢測產物生成。

1.2.6.2 溫度對粗酶液催化反應的影響 設置5個實驗組,取4 mL濃度20%,DE值11.9的淀粉液化液,等體積加入250 U/mL的粗酶液。分別在35、40、45、50、55 ℃下水浴振蕩反應,反應時間為30 h，反應初始pH6.5。反應結束經糖化后測定各組海藻糖產量,計算轉化率。

1.2.6.3 初始pH對粗酶液催化反應的影響 產酶培養結束后,配制相同濃度(25 mmol/L)不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的磷酸緩沖溶液,在相同條件下分別對菌體洗滌、重懸(重懸后保持各組菌濃度一致)、破碎,得到不同pH的粗酶液。取4 mL粗酶液,等體積加入相應pH,濃度20%,DE值11.9的淀粉液化液,在45 ℃下水浴振蕩反應30 h。反應結束經糖化后測定各組海藻糖產量,計算轉化率。

1.2.6.4 淀粉液化液DE值對粗酶液催化反應的影響 在淀粉液化液制備過程中設置五組,淀粉濃度均為20%,通過添加不同濃度的耐高溫α-淀粉酶,改變各組淀粉的液化程度,滅活耐高溫α-淀粉酶后測定各組的DE值,分別得到DE值為7.3、11.9、18.4、27.8、42.7的淀粉液化液。取4 mL淀粉液化液,等體積加入250 U/mL的粗酶液,在初始pH 6.5,45 ℃下水浴振蕩反應30 h。反應結束經糖化后測定各組海藻糖產量,計算轉化率。

1.2.6.5 反應時間與底物濃度對粗酶液催化反應的影響 在4 mL 250 U/mL粗酶液中分別等體積加入濃度為10%、20%、30%的淀粉液化液(DE值均為11.9),在初始pH6.5,45 ℃下水浴振蕩反應60 h,反應前20 h每隔5 h取樣,后面毎隔10 h取樣。反應結束經糖化后測定各組海藻糖的量并計算轉化率。

1.2.7 數據處理 所有實驗每組對照均至少重復三次,實驗結果以“平均值±標準偏差”的形式表示。利用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析,并用Origin 8.5軟件對數據作圖分析。

2 結果與討論

2.1 ARTP誘變致死曲線

按照1.2.2的處理方法對菌株SH進行ARTP誘變,以時間為變量,得到菌株的誘變致死曲線(圖1)。根據之前的報道[11],采用ARTP誘變系統的致死率在90%左右時菌體的正突變率較高。從圖1中可以看出,處理時間為40 s和50 s時,致死率分別為92.3%和97.3%,且經單因素方差分析二者致死率差異不顯著(p>0.05),其他處理時間致死率差異顯著(p<0.05)。因此,綜合正突變率和致死率,本實驗的誘變處理時間在40 s和50 s時均可,誘變后的菌株均能進行培養篩選。

圖1 等離子體處理Arthrobacter sp. SH的致死率曲線Fig.1 The lethal rate of Arthrobacter sp.SH treated by ARTP注:圖中相同字母表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2誘變菌株的篩選

從誘變后的菌株中選擇大小形態各異的單菌落,進行產酶培養并進行酶轉化實驗,采用薄層層析法初篩。實驗結果顯示,與出發菌株相比,有22株菌株的酶催化能力得到提高。對其中的9株表現較好的誘變菌株做進一步定量分析,結果發現,在相同產酶條件及酶轉化條件下,菌株5-2的產酶能力最強,且生物量也有明顯提高,誘變菌株酶催化能力達到129.6 U/mL,相較于原始菌株的88.7 U/mL,菌株催化能力提高了46.1%(表1)。同時對各誘變菌株的菌體濃度與酶催化能力分別進行單因素方差分析,分析結果表明,各誘變菌株的菌體濃度及酶催化能力差異顯著(p<0.05)),誘變篩選結果具有統計學意義。由此可見ARTP誘變對提高菌體酶活效果顯著,并將誘變菌株5-2命名為Arthrobactersp. SH-52。

表1 菌株的誘變篩選Table 1 The screening result of Arthrobacter sp. SH

注:同列相同字母表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3誘變菌株SH-52粗酶液酶法制備海藻糖的工藝優化

2.3.1 海藻糖合成途徑的初步驗證 分別以不同底物進行粗酶液反應,反應結束后采用薄層層析法定性檢測,結果如表2所示。從表2中可以看出,當以葡萄糖、麥芽糖為底物時沒有檢測到海藻糖生成,以麥芽五糖、淀粉液化液為底物時檢測到有大量海藻糖生成,此外,以麥芽三糖為底物時也沒有檢測到生成海藻糖,由此可初步驗證該酶促反應是以麥芽寡糖基海藻糖途徑(TreY-TreZ途徑)催化麥芽寡糖合成海藻糖,且麥芽寡糖的聚合度至少應該在三以上。

表2 海藻糖合成途徑的初步驗證Table 2 Preliminary validation of trehalose synthesis pathway

注:“-”表示無海藻糖生成;“+”表示有海藻糖生成。

2.3.2 溫度對粗酶液催化反應的影響 結果如圖2所示,當反應溫度為45 ℃時,海藻糖轉化率達到最高,為34.5%。前人報道的節桿菌屬菌株雙酶反應的最適反應溫度多在40 ℃,嗜酸熱古菌的反應溫度雖然很高(反應溫度可達75 ℃)但存在菌體培養困難,酶活較低的缺點[12]。誘變菌株SH-52的最適反應溫度較高,一方面可以加快酶促反應速率,縮短反應時間,另一方面較高的溫度可以降低微生物污染的發生幾率,保持一個較好的酶促反應環境。這在海藻糖的實際生產制備中具有重要意義。

圖2 反應溫度對轉化率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on conversion rate

2.3.3 初始pH對粗酶液催化反應的影響 pH能夠改變酶的構象,引起酶蛋白的活性中心結構改變,進而改變酶活力,由圖3結果可知,粗酶液反應的最適pH范圍在6.0～7.0之間,當初始pH為6.5時,轉化率最高,達到33.4%,因此選擇粗酶液反應的初始pH為6.5。日本學者報道了節桿菌Arthrobactersp.Q36中雙酶反應中的酶學性質[13-14],其中MTSase的最適pH7.0,最適溫度40 ℃;MTHase的最適pH6.5,最適溫度45 ℃。本文以含有MTSase和MTHase的粗酶液為研究對象,其最適pH與文獻報道的結果相似。

圖3 反應初始pH對轉化率的影響Fig.3 Effect of initial pH on conversion rate

2.3.4 淀粉液化液DE值對粗酶液催化反應的影響 淀粉液化液的DE值決定了反應底物的組成成分,是影響海藻糖轉化率的關鍵因素,在酶量充足的情況下,淀粉液化液中適合酶反應的麥芽寡糖的含量將直接決定粗酶液反應的轉化率[15-16]。制備不同DE值的淀粉液化液為底物進行催化,結果如圖4所示,當DE值為11.9時,底物轉化率達到最高,為37.6%,當DE增加到18.4時,轉化率為36.1%,仍能保持較高的轉化率,由此表明,聚合度在一定范圍內的麥芽寡糖均可作為酶的最適底物。DE值過低,淀粉液化液中麥芽寡糖聚合度偏大,支鏈麥芽寡糖偏多,不適宜粗酶液反應;當DE值過高,聚合度偏小,反應副產物增多,同樣導致轉化率降低。因此選擇DE值為11.9的淀粉液化液做為粗酶液反應的最適底物。

圖4 DE值對粗酶液催化反應的影響Fig.4 Effect of DE value on conversion rate

2.3.5 反應時間與底物濃度對粗酶液催化反應的影響 從圖5中可以看出,隨著反應的進行海藻糖轉化率不斷增加,三種濃度的底物均能夠在30 h左右達到最高轉化率。而且以濃度10%、20%的淀粉液化液為底物進行轉化時轉化率較為接近,當淀粉液化液濃度達到30%時轉化率降低很多,這可能是由于淀粉液化液中適宜酶反應的底物所占比例是一定的,濃度為10%、20%的淀粉液化液中適宜酶反應的底物均能夠利用完畢,二者轉化率接近,當淀粉液化液濃度達到30%時,反應體系中的酶量不足成為酶促反應的限制因素,此外由于淀粉液化液濃度過高,粘度過大,不利于酶分子的自由擴散,反應中產物、副產物濃度增加,反應體系環境惡化,阻礙了反應的進行,降低了底物利用率[17]。綜合考慮底物利用率及生產周期,選擇濃度為20%的淀粉液化液作為反應的最適底物,粗酶液反應時間為30 h。

圖5 反應時間與底物濃度對轉化率的影響Fig.5 Effect of reaction time and substrate concentration on conversion rate

3 結論

工業化酶法生產海藻糖主要是通過TreY-TreZ途徑作用于淀粉來實現,是最有優勢的海藻糖生產方法,我國是淀粉生產大國,以淀粉為原料生產海藻糖具有重要意義。本研究采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變系統篩選得到一株以TreY-TreZ途徑生產海藻糖的突變菌株Arthrobactersp. HS-52,其生物量與粗酶液轉化能力均優于原始菌株,搖瓶培養酶活達到129.6 U/mL,比出發菌株提高了46.1%。對海藻糖生物合成途徑進行了驗證,初步確定該酶促反應是通過麥芽寡糖基海藻糖途徑(TreY-TreZ途徑)催化麥芽寡糖合成海藻糖,且麥芽寡糖的聚合度至少在三以上。確定了誘變菌株粗酶液催化制備海藻糖的最佳工藝條件:反應溫度45 ℃,初始pH6.5,反應底物是濃度20%的淀粉液化液(DE值11.9),反應時間30 h。以濃度20%的淀粉液化液為底物,等體積加入未經濃縮、純化的粗酶液進行催化,轉化率達到37.6%。本文對工業化酶法生產海藻糖具有一定的借鑒意義。

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Breedingofthetrehalosehigh-yieldingstrainbyARTPandtheoptimizationofenzymaticreactionconditions

TIANCheng-fu,ZHANGWei-guo,XUJian-zhong,LIUDong-dong,SHIZhong-ping*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A genetic stability trehalose high-yielding strainArthrobactersp. SH-52 was obtained from the original strain ofArthrobactersp. SH,which was mutated by atmospheric and room temperature plasmas(ARTP). The catalysis ability ofArthrobactersp. SH-52 reached 129.6 U/mL,which was 46.1% higher than that of the original strain. The enzymatic reaction conditions of SH-52 were optimized,and the results were as follows:reaction temperature 45 ℃,reaction time 30 h,pH6.5,and DE value 11.9 of 20% starch hydrolysate. Under the optimum reaction conditions,the conversion rate reached 37.6% by crude enzyme. The results showed that ARTP mutagenesis technology was an effective method for breeding high-activity trehalose-producing bacteria,and the results could be used for industrial production of trehalose.

trehalose;atmospheric and room temperature plasma(ARTP);TreY-TreZ pathway;starch hydrolysate

2017-02-13

田成福(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：工業微生物菌種選育及優化,E-mail：tianchengfu@126.com。

*通訊作者:史仲平(1962-)，男，博士，教授，研究方向：發酵工學，E-mail:zpshi@jiangnan.edu.cn。

江蘇省自然科學基金-青年基金(BK20150149)。

TS245.9

:A

:1002-0306(2017)16-0126-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.024