雙菌株聯合固態發酵冷榨核桃粕提高產品納豆激酶活性的研究

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(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

雙菌株聯合固態發酵冷榨核桃粕提高產品納豆激酶活性的研究

王瑞珍,蔡天嬌,徐亞飛,任璐,雷宏杰*,徐懷德*

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

為提高納豆芽孢桿菌單菌發酵品的納豆激酶(nattokinase,NK)活性并減少產品的不良氨味,采用戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌聯合固態發酵核桃粕。結果表明:納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母在接種量3%、菌種配比2∶1、發酵溫度34 ℃、發酵時間60 h的條件下得到的核桃粕發酵品NK活性達2040.82 U/g,提高了70.42%,揮發性鹽基氮含量為64.18 mg/100 g,降低了84.37%;納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌在接種量9%、菌種配比1.5∶1、發酵溫度42 ℃、發酵時間60 h的條件下得到的發酵品NK活性為1966.02 U/g,提高了64.18%,揮發性鹽基氮含量為62.68 mg/100 g,降低了84.74%。混合菌種發酵品的氨味顯著減少,改善了傳統發酵品的風味。

核桃粕,納豆芽孢桿菌,戴爾凱氏有孢圓酵母,植物乳桿菌,固態發酵,納豆激酶

核桃(JuglansregiaL.)屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(JuglansL.)植物。我國是世界第一大核桃生產國[1],栽培面積8000多萬畝,產量達300多萬噸[2]。核桃仁營養豐富,脂肪含量高達60%以上[3],蛋白質含量約為14%～18%,氨基酸種類齊全[4];冷榨核桃油的核桃粕蛋白達30%～40%[5],殘油12%～14%[6],水分5%～7%,是優質的植物蛋白資源,適用于加工各種食品和保健品。

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilsnatto)是食品用益生菌[7-8],發酵過程中可產生納豆激酶(nattokinase,NK)、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶系[9]。納豆激酶具有纖溶活性強、可口服、副作用小、作用時間長[10]等特點,成為較為理想的保健及抗血栓藥物[11]。以大豆、豆粕、菜籽粕或馬鈴薯渣為原料的有關納豆芽孢桿菌固態發酵產NK的研究已有報道[12-15],牛麗亞等[16]采用嗜酸乳桿菌和納豆芽孢桿菌聯合發酵豆粕,提高了豆粕營養價值，使蛋白酶活力達2240.9 U/g。劉麗莉[17]用蠟樣芽胞桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵牛骨粉,蛋白酶的活力提高,膠原多肽的質量濃度達3.62 mg/mL。孫軍德等[18]采用沼澤紅假單胞菌和納豆芽孢桿菌混合固態發酵淀粉豆,NK活性提高53.74%的同時氨味明顯降低。王常蘇等[19]用納豆芽孢桿菌與毛霉混合固態發酵黃豆,NK活性提高88.11%,并改善了納豆的口感。核桃粕成本低、安全,也可以發酵生產富含納豆激酶產品,高瑞雄等[20]用納豆芽孢桿菌固態發酵冷榨核桃粕,NK活性達到1522 U/g,發酵品有氨味,可以采用混合菌種發酵核桃粕進一步提高NK活性和產品品質,減少氨味,但相關研究未見報道。

為此,本論文以冷榨核桃粕為原料,采用戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌聯合固態發酵提高NK活性,為核桃粕的綜合利用和新產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冷榨核桃粕 河北綠嶺莊園食品有限公司，粗蛋白31.70%,粗脂肪9.86%,水分7.63%;納豆芽孢桿菌(CICC 10023) 中國工業菌種保藏中心;白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY 安琪酵母股份有限公司;保加利亞乳桿菌(Yo-Mix 300LYo 50 Dcu) 由CHR HANSEN公司提供;戴爾凱氏有孢圓酵母(WKZ1-2)、植物乳桿菌(20261)、嗜熱鏈球菌(1.1855) 本實驗室保藏菌種;尿激酶(5000 U) 購于美國ADM公司;凝血酶(1000 U)、牛纖維蛋白原 購自Sigma公司;其他試劑 國產分析純。

YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司;SPH-2102C立式雙層恒溫培養振蕩器 上海世平實驗設備有限公司;SW-CJ-2D型(實用垂直新穎)雙人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2培養基

納豆芽孢桿菌的斜面、液體培養基 均為牛肉膏蛋白胨培養基[20]。

白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY、戴爾凱氏有孢圓酵母的斜面培養基YPD:酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,調pH 6.5,加20 g/L瓊脂得斜面培養基。

白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY、戴爾凱氏有孢圓酵母的液體種子培養基YPD:酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,調pH 6.5。

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌的斜面、液體培養基均為MRS培養基[16]。

1.3實驗方法

1.3.1 種子液制備 分別配制液體培養基和斜面培養基,將保藏的菌種轉接到斜面培養基,34 ℃培養24 h使菌種活化。取活化菌種兩環接入裝有25 mL液體培養基的100 mL三角瓶中,置于恒溫培養振蕩器中培養(34 ℃,150 r/min),本實驗選取納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌均培養12 h的種子液,戴爾凱氏有孢圓酵母、白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY均培養16 h的種子液。

1.3.2 原料預處理 將冷榨核桃粕過20目篩網。分別稱取核桃粕10 g、氯化鈉0.15 g和葡萄糖0.1 g于100 mL錐形瓶中,加15 mL蒸餾水,調pH為7.0±0.2,于室溫下浸泡2 h,121 ℃高壓滅菌鍋濕熱滅菌20 min,冷卻后接入種子液,并于恒溫振蕩器中37 ℃恒溫發酵,轉速150 r/min。接種發酵48 h后,于4 ℃冰箱后熟24 h。

1.3.3 NK活性測定方法 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[20]。

1.3.4 揮發性鹽基氮含量測定 采用半微量定氮法,參照GB T5009.44-2003。

1.3.5 菌種優化 在菌種比例1∶1,接種量9%,發酵溫度為37 ℃,發酵時間48 h的發酵條件下,對嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、戴爾凱氏有孢圓酵母、白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY分別與納豆芽孢桿菌混合發酵,以NK活性為指標,優選適合發酵的菌種。

1.3.6 單因素實驗 選擇戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌混合發酵的方法,以NK活性為指標,分析接種量、菌種配比、葡萄糖添加量、發酵溫度及發酵時間對發酵品中的NK活性影響。

接種量分別設定為3%、5%、7%、9%、11%的種子液,其中菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌∶植物乳桿菌)為1.5∶1,葡萄糖添加量為0.5%,發酵溫度37 ℃,發酵時間48 h;

菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌:植物乳桿菌)分別設定為1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1,其中接種量為9%,葡萄糖添加量為0.5%,發酵溫度為37 ℃,發酵時間為48 h;

葡萄糖添加量分別設定為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,發酵溫度為37 ℃,發酵時間為48 h;

發酵溫度分別設定為28、31、34、37、42 ℃,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,葡萄糖添加量為1%,發酵時間為48 h;

發酵時間分別設定為12、24、36、48、60 h,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,葡萄糖添加量為1%,發酵溫度為37 ℃。

1.3.7 正交實驗 根據單因素實驗結果,以NK活性為指標,采用納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌混合發酵,固定葡萄糖添加量為1.0%。以接種量、菌種配比、發酵溫度及發酵時間為影響因素按L16(45)正交表進行實驗,確定最優發酵條件。納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌混合發酵正交實驗的各因素水平分別見表1、表2。

表1 納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design of fermentation by the mixed strains ofBacillus subtils natto and Torlaspora delbrueckii

表2 納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of fermentation by the mixed strains ofBacillus subtils natto and Lactobacillus plantarum

1.4數據處理

利用Minitab 16.0數據處理軟件進行分析,并通過Tukey法檢驗數據間差異的顯著性(p<0.05),每個實驗3次重復,結果取平均值。

2 結果與分析

2.1不同乳酸菌與納豆芽孢桿菌混合發酵核桃粕對納豆激酶活性的影響

由圖1可以看出,不同菌種混合發酵對納豆激酶活性的影響存在顯著性差異。其中,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵納豆激酶活性最高,酶活達1524.47 U/g。因此,本實驗選擇植物乳桿菌與納豆芽孢桿菌混合進行發酵條件的優化。

圖1 不同乳酸菌與納豆芽孢桿菌混合發酵對納豆激酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation by the mixed strains of different Lactic acid bacteria and Bacillus subtils natto on nattokinase activity注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。N-納豆芽孢桿菌,S-嗜熱鏈球菌,B-保加利亞乳桿菌,Z-植物乳桿菌。

2.2不同酵母菌與納豆芽孢桿菌混合發酵核桃粕對納豆激酶活性的影響

由圖2可知,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵納豆激酶活性最高,活性為1386.54 U/g,故本實驗選擇戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合進行發酵條件的優化。

圖2 不同酵母菌與納豆芽孢桿菌混合發酵對納豆激酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation by the mixed strains of different Saccharomycetes and Bacillus subtils natto on nattokinase activity注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。N-納豆芽孢桿菌,SY-紅葡萄酒酵母,RW-白葡萄酒酵母,T-戴爾凱氏有孢圓酵母。

2.3固態發酵核桃粕產納豆激酶的單因素實驗結果

2.3.1 接種量對納豆激酶活性的影響 由圖3可知,不同接種量對發酵品的NK活性產生不同的影響,NK活性隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢。當納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵的接種量為5%的菌種種子液時,NK活性達到最大值,為1733.00 U/g。當納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵的接種量為7%的菌種種子液時,NK活性達到最大值,為1755.84 U/g。當接種量太小時,隨著接種量的增加,納豆芽孢桿菌密度逐漸增加[21],產生的納豆激酶量也隨之增加。當接種量太大時,菌體細胞的生長繁殖消耗了過多的底物營養物質,產生大量的代謝廢物[22],加快菌體細胞衰老,導致產酶量降低,NK活性下降。

圖3 接種量對納豆激酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on nattokinase activity

2.3.2 菌種配比對納豆激酶活性的影響 圖4顯示了菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌:植物乳桿菌)對NK活性的影響。

圖4 菌種配比對納豆激酶活性的影響Fig.4 Effect of proportion of inoculums on nattokinase activity

結果表明,NK活性隨菌種比例的增加呈先升高后降低的趨勢,適宜的納豆芽孢桿菌和植物乳桿菌比例范圍(1∶1.5～1.5∶1)對NK的合成具有促進作用。當納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母的比例為1∶1時,NK活性達到最大值,約為1725.76 U/g。當納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌的比例為1∶1時,是適合NK合成的最佳接種比例,NK活性達到最大值,約為1745.71 U/g。菌種比例太大太小都不利于NK活性的提高,過多接種納豆芽孢桿菌或植物乳桿菌及戴爾凱氏有孢圓酵母可能會使得菌種間協同作用不但不能發揮,反而由于兩菌種對營養物質的競爭[23],抑制了NK的生成。

2.3.3 葡萄糖添加量對納豆激酶活性的影響 結果表明,葡萄糖添加量為1.0%時,戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌混合發酵,NK活性均達到最大值,分別為1689.35、1678.22 U/g。葡萄糖過高過低都不利于NK活性的提高。葡萄糖是單糖,微生物易利用,無水解等過程,是一種速效碳源[22],可以在發酵過程中提供大量碳源,以維持其持續增長,NK活性提高。而葡萄糖添加量過多,發酵基質中碳氮比例增大,對菌種繁殖不利[23],從而導致NK活力下降。當葡萄糖添加量分別為0.5%、1.0%和1.5%時,NK活性之間均無顯著性差異(p>0.05)。因此,本實驗選擇1.0%的葡萄糖添加量。

圖5 葡萄糖添加量對納豆激酶活性的影響Fig.5 Effect of glucose content on nattokinase activity

2.3.4 發酵溫度對納豆激酶活性的影響 結果表明,NK活性隨發酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵在發酵溫度為34 ℃的條件下,NK活性達到最大值,約為1721.72 U/g,表明納豆芽孢桿菌在該溫度條件下能較好的生長繁殖,且其代謝產生的NK具有較高的活性。而納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵在發酵溫度為37 ℃的條件下,NK活性達到最大值,約1721.66 U/g。溫度過低時,微生物的生長速率慢,代謝產物生成的速度降低[24],導致NK活性低;但溫度過高時,會引起微生物菌體的過早衰老死亡及NK耐熱性差[25],從而使NK活性下降。

圖6 發酵溫度對納豆激酶活性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.3.5 發酵時間對納豆激酶活性的影響 由圖7可知,NK活力隨發酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢。當納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵在發酵時間為48 h的條件下,NK活性達到最大值,約為1716.15 U/g。當納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵在發酵時間為48 h的條件下,NK活性達到最大值,約為1702.72 U/g。在48 h之前,菌種隨著發酵時間的延長而迅速生長繁殖,產生并積累NK,使得酶活性增加。在48 h之后,隨著發酵時間的延長,菌種進入衰亡期,NK活性降低,這是由于菌種代謝或核桃粕內物質轉化產生酶抑制性物質,或是NK進一步轉化或降解為其他物質,還可能是由于發酵時間過長而導致有害產物的積累[26],從而使得NK活性降低。

圖7 發酵時間對納豆激酶活性的影響Fig.7 Effect of fermentation time on nattokinase activity

2.4正交實驗設計結果

2.4.1 納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵正交實驗結果 根據單因素實驗結果,以NK活性為指標做正交分析,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵核桃粕的實驗結果見表3。

由表3可以看出,對于納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵,NK活力最高是1927.48 U/g。四因素對NK活性的影響主次順序為:C發酵溫度>A接種量>D發酵時間>B菌種配比,即發酵溫度對NK活性影響最大,為決定性因素,其次為接種量、發酵時間,而菌種配比的影響最小。

表3 正交優化實驗設計和結果Table 3 Experimental design and results for orthogonal analysis

納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵的理論最優組合為A1B4C3D4,即接種量3%,菌種配比為2∶1,34 ℃下發酵60 h,進行三次驗證實驗,測得NK活性為2040.82 U/g,與正交實驗中NK活性(最高為1927.48 U/g)相比有所提高,提高了5.88%。

納豆芽孢桿菌單菌發酵核桃粕,NK活性為1197.51U/g,揮發性鹽基氮含量為410.72 mg/100 g。相比于納豆芽孢桿菌單菌發酵品,戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發酵產品NK活性顯著提高(p<0.01),提高了70.42%,揮發性鹽基氮含量為64.18 mg/100 g,降低了84.37%。戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發酵效果優良。孫軍德[18]采用納豆芽孢桿菌與沼澤假單胞菌混合發酵,揮發性鹽基氮含量降低了79.81%,王帆等[27]用乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌混合發酵魚肉香腸,揮發性鹽基氮含量降低了80.91%,氨味明顯減輕。其原因是戴爾凱氏有孢圓酵母在發酵過程中與納豆芽孢桿菌競爭營養物質,減弱了核桃粕中蛋白質的分解速度[14],因而減少揮發性鹽基氮的生成;戴爾凱氏有孢圓酵母在發酵過程中分解培養基中的糖類,產生醇香味[28],戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發酵品氨味減少,提高適口性。

2.4.2 納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵正交實驗結果 根據單因素實驗結果,以NK活性為指標做正交分析,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵核桃粕的實驗結果見表4。

表4 正交實驗結果與分析Table 4 Results and analysis for orthogonal experiment

由正交實驗結果可以看出,對于納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵,NK活性最高是1871.83 U/g。四因素對NK活性的影響主次順序為:C發酵溫度>D發酵時間>A接種量>B菌種比例。即發酵溫度對NK活性影響最大,為決定性因素,其次為發酵時間、接種量,而菌種配比的影響最小。

納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵的理論最優組合為A4B3C4D4,即接種量9%,菌種配比為1.5∶1,42 ℃下發酵60 h,進行三次驗證實驗,測得NK活性為1966.02 U/g,高于其他16組,所得到的正交實驗結果合理。

相比于NK活性和揮發性鹽基氮含量分別為1197.51U/g、410.72 mg/100 g的納豆芽孢桿菌單菌發酵品,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵產品的NK活性顯著提高(p<0.01),提高了64.18%,揮發性鹽基氮含量為62.68 mg/100 g,降低了84.74%,顯著減輕了產品的氨味。植物乳桿菌在發酵過程中產生的乳酸與氨及胺類等堿性物質發生中和反應,降低了揮發性鹽基氮的含量[29]。此外,植物乳桿菌可降解精氨酸、組氨酸、天門冬氨酸等產生雜醇和在發酵過程中產生有機酸,兩者又可進行酯化反應縮水生成酯類物質[29],對產品的整體香氣起到柔和作用。混合菌種發酵氨味減少,改善了傳統發酵品的風味。

3 結論

單因素和正交實驗結果表明,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合菌種發酵冷榨核桃粕的最佳條件為:接種量3%,菌種配比2∶1,發酵時間60 h,發酵溫度34 ℃。而納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合菌種發酵冷榨核桃粕的最優條件為:接種量9%、菌種比例為1.5∶1、發酵溫度42 ℃、發酵時間60 h。與納豆芽孢桿菌單菌發酵品相比,混合菌種發酵均可顯著提高NK活性(p<0.01),降低揮發性鹽基氮含量(p<0.01),從而有效減輕發酵品的不良氨味。因此,本研究為混合菌種發酵提高核桃粕發酵品的品質提供了理論依據和方法指導。

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Studyofimprovingnattokinaseactivitythroughsolid-statefermentationofcold-pressingwalnutdregsbycompoundstrains

WANGRui-zhen,CAITian-jiao,XUYa-fei,RENLu,LEIHong-jie*,XUHuai-de*

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

To improve nattokinase(NK)activity of fermentation products byBacillussubtilsnattoand reduce the ammonia smell,solid-state fermentation of walnut dregs by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandTorlasporadelbrueckii(BacillussubtilsnattoandLactobacillusplantarum)was investigated. Results showed that the optimum technological parameters of fermentation by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandTorlasporadelbrueckiiwere as follows:inoculation amount of 3%,proportion of inoculums of 2∶1,fermentation temperature of 34 ℃,fermentation time of 60 h. In this fermentation conditions,the NK activity was 2040.82 U/g,increasing by 70.42%. The content of volatile base nitrogen was 64.18 mg/100 g,decreasing by 84.37%. In addition,the optimum technological parameters of fermentation by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandLactobacillusplantarumwere as follows:inoculation amount of 9%,proportion of inoculums of 1.5∶1,fermentation temperature of 42 ℃,fermentation time of 60 h. In these fermentation conditions,the NK activity was 1966.02 U/g,increasing by 64.18%. The content of volatile base nitrogen was 62.68 mg/100 g,decreasing by 84.74%. The mixed strains fermentation could decrease the ammonia smells significantly,improve the flavor of traditional fermentation products.

walnut dregs;Bacillussubtilsnatto;Torlasporadelbrueckii;Lactobacillusplantarum;solid-state fermentation;nattokinase

2017-01-05

王瑞珍(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬貯藏與加工,E-mail:wrz1003420723@sina.com。

*通訊作者:雷宏杰(1984-)，男，博士，講師，研究方向：果蔬加工與食品生物技術，E-mail：leihongjie000@163.com。 徐懷德(1964-)，男，大學本科，教授，研究方向：果品蔬菜貯藏與加工和天然產物提取，E-mail:xuhuaide@aliyun.com。

陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2016KTCQ02-22)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0112-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.022