熱處理對豬肉中蛋白質體外消化率及5-羥甲基糠醛形成的影響

,忠合,

(韓山師范學院食品工程與生物科技學院,廣東潮州 521041)

熱處理對豬肉中蛋白質體外消化率及5-羥甲基糠醛形成的影響

王軍,王忠合*,駱寶

(韓山師范學院食品工程與生物科技學院,廣東潮州 521041)

應用模擬體外消化模型研究不同熱處理的豬肉中蛋白質的體外消化率,并以5-羥甲基糠醛為指標評定蛋白質的修飾程度,探討加熱處理對豬肉中蛋白質特性的影響。結果表明,熱處理10～240 min后豬肉中蛋白質的消化率增加。同時,隨著熱處理時間的增大,消化液中游離氨基的含量也呈現出先增加后下降的趨勢。色澤分析表明:熱處理后豬肉的色澤加深,L*、a*、b*值增大,熱處理時間大于120 min的豬肉樣品色差值ΔE均在4.0以上,影響豬肉外觀。豬肉樣品中5-羥甲基糠醛的形成量隨著加熱時間的增加而顯著增多(p<0.05),蛋白質的修飾程度增大,這與蛋白質體外消化率的變化趨勢一致。熱處理在一定程度上可顯著提高豬肉中蛋白質的體外消化率,但長時間的過熱處理則影響豬肉的色澤和蛋白質的消化性,5-羥甲基糠醛形成量和色值等指標可用于評定肉類熱處理中蛋白質的修飾程度。

肉蛋白,熱改性,體外消化性,美拉德反應產物

熱處理不僅影響肉制品的質量和風味,加熱時間和溫度是影響肉制品的柔軟程度、含汁量、顏色和風味等指標的主要因素,而且加熱過程會引發一系列的化學物理反應,如肉制品的質構、風味、色澤等變化,同時還能夠殺死有害微生物以保證食品安全[1]。肌肉收縮、組織變硬、汁液流失以及變色等在加熱過程中發生的劇烈變化都源于肌肉蛋白的變性,適當的熱處理可以改善食物的適口性和蛋白質品質,加熱的作用就是加速蛋白質變性,但是加熱時間過長或溫度過熱可能會影響蛋白質的消化率[2-3],豬肉經長時間燉煮后,脂肪含量減少,不飽和脂肪酸增加,而膽固醇含量會大大降低[4]。評定肉類食用品質的指標一般包括顏色、嫩度、風味、保水性、多汁性等,加熱溫度和時間對肉的食用品質具有重要影響,不同溫度下處理的豬肉蒸煮損失、剪切力和pH均隨著熱處理溫度的升高而增加,肉塊形狀發生縮短,色澤從紅色變為白色或灰白色[5],影響豬肉的食用品質,但研究并未深入探討熱處理后肉中蛋白質的消化性及其修飾程度。

肉類富含蛋白質、脂肪和少量的糖,在熱處理或貯存的過程中容易發生美拉德反應,氨基酸(特別是賴氨酸)被破壞或束縛,從而影響豬肉的營養價值,甚至會形成一些潛在有害物(如雜環胺、呋喃素、晚期糖基化終產物等),特別是烤制或油炸等熱處理過程中這些潛在有害物的形成量是煮制處理過程中的十多倍[6]。美拉德反應是由一系列復雜的反應構成,包含不同的反應階段,常用呋喃素[7]、5-羥甲基糠醛(HMF)[8]、吸光度、熒光值、Nε-羧甲基賴氨酸(CML)[3]、丙烯酰胺等指標來評定其反應程度,以揭示食品加工程度與蛋白質修飾程度及其營養特性之間的關系。羊肉烤制或烹煮后蛋白質的聚集性增加,氨基酸側鏈上的氨基酸被氧化和修飾形成CML等[9-11],而影響肉蛋白的營養或功能特性,這為研究豬肉烹煮后蛋白質的消化性及修飾程度提供借鑒。

本文研究蒸煮加熱時間對豬肉中蛋白質消化率、游離氨基含量、HMF形成量和色度等指標的影響,探索加工程度對豬肉中蛋白質的破壞程度,為豬肉的加工處理提供一定的技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉(背最長肌部分) 購于廣東省潮州市大潤發超市;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、5-羥甲基糠醛(HMF) 美國Sigma公司;亞硝基鐵氰化鈉、2-硫代巴比妥酸(TBA)、胃蛋白酶(3000～3500 NFU/mg)、胰酶(5×USP)、十二烷基硫酸鈉(SDS) 生工生物工程(上海)有限公司;鹽酸、草酸、三氯乙酸、葡萄糖、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、水楊酸鈉、次氯酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸鈉等 均為分析純。

TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;H1650型高速臺式離心機 湘儀天平儀器設備有限公司;SFA22048型精密電子天平 上海精密科學儀器有限公司;FD-1D-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;JZ-350型彩色差計 深圳市金準儀器設備有限公司;JYZ-D526型九陽榨汁機(帶絞肉杯) 九陽股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品的處理 參照文獻[12]中的方法并略有修改,取500 g豬肉(背最長肌部分)斬碎后粉碎2 min,各取15 g樣品加入到圓底燒瓶中,按照1∶3的比例加入蒸餾水,攪勻,加熱回流并不斷攪拌,分別于加熱0、15、30、60、120、240 min處取出樣品于冰水浴中冷卻至室溫,于10000×g下離心10 min得到沉淀物,冷凍干燥后貯存于-20 ℃備用,分別以樣品-0、樣品-15、樣品-30、樣品-60、樣品-120、樣品-240表示不同熱處理時間制備的樣品。

1.2.2 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮消化-水楊酸比色法測定[13]樣品或消化液中蛋白質的含量,以濃度為2.5～12.5 μg/mL的氮繪制標準曲線(A=0.0369C+0.0071,R2=0.9973),根據標準曲線方程查出其含氮量,計算蛋白質的含量,氮轉化系數為6.25。

1.2.3 蛋白質體外消化率的測定 參照文獻[14]報道的體外消化模型法測定蛋白質的消化性,稱取0.5 g樣品,加入100 mL蒸餾水,并用1 mol/L的鹽酸將樣品液pH調至2.0,加入胃蛋白酶液1 mL(控制酶與底物中蛋白質的質量比接近1∶12.5),在37 ℃恒溫振蕩器中模擬體外胃液消化,轉速為140 r/min,分別于0、30、60、90、120 min各取樣2.0 mL,于10000×g(4 ℃)離心5 min,取上清液采用凱氏定氮法[14]測定蛋白質的含量S。其余部分用0.1 mol/L的NaHCO3調節pH至7.0終止模擬胃液消化反應,加入胰酶1 mL(控制酶與底物中蛋白質的質量比接近1∶62.5),置于37 ℃恒溫振蕩器上模擬體外腸液消化,轉速為140 r/min,同樣于消化150、180、210、240 min各取樣2.0 mL,于85 ℃水浴中處理3 min滅酶,于10000×g(4 ℃)離心5 min,取上清液采用凱氏定氮法測定蛋白質的含量S,根據樣品中的總蛋白質含量T按照下式計算蛋白質的體外消化率DR:

式中:S為上清液中蛋白質的含量,μg;T為樣品中蛋白質的總量,μg。

1.2.4 游離氨基的測定 采用TNBS比色法[15]測定樣品中游離氨基的含量,取1.0 mL待測豬肉樣品溶液(含氨基酸0.5～4.0 μmol/L),加入40 g/L碳酸氫鈉溶液1 mL和1 g/L TNBS溶液1 mL,混合后于40 ℃反應2 h,加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL,混合后在340 nm處測定吸光度,空白組以蒸餾水代替待測液,以0.5～3.5 mmol/L系列濃度的L-亮氨酸為標準品繪制標準曲線方程(A=0.2596C-0.0034,R2=0.9998),查得游離氨基的濃度,求得樣液中游離氨基的含量。

1.2.5 色度的測定 采用色差計測量樣品的色澤差異,每個樣品重復3次。按照下式計算ΔE值,ΔE值表示待測樣品與對照樣品之間的色差值,ΔE越大表示顏色變化越嚴重[16]。

1.2.6 HMF的檢測 取0.3 g樣品加入3 mL 0.15 mol/L的草酸溶液,混合均勻后加入離心管中,振蕩提取30 min,再加入2 mL 40%的三氯乙酸(TCA)充分振蕩,然后靜置一段時間,于4000 r/min離心15 min,取4 mL上清液于試管中,加入1 mL濃度為0.05 mol/L的TBA溶液,并在40 ℃水浴中加熱30 min,冷卻至常溫,在443 nm下測定吸光度[17],實驗重復三次。以濃度為3～15 μg/mL的HMF為標準品繪制標準曲線方程(A=0.107C+0.018,R2=0.987),根據標準曲線方程查得HMF的濃度,計算樣品中HMF的含量。

表1 不同熱處理的豬肉中蛋白質消化率的變化(%)Table 1 Change of protein digestibility in pork meat boiled under different time(%)

注:同列中標注不同小寫字母表示差異顯著,同行中標注不同大寫字母表示差異顯著,p<0.05,表2同。

1.3數據處理

實驗重復測定三次以上,結果以平均值±標準偏差表示,數據統計分析采用SPSS 17.0軟件(美國IBM公司)進行一維方差分析(one-way ANOVA),差異顯著性采用鄧肯(Duncan)檢驗,檢驗水平p<0.05。

2 結果與討論

2.1不同熱處理的豬肉中蛋白質消化率的變化

熱處理在一定程度上可增加肉中蛋白質的消化率,但過長時間或溫度過高的熱處理則對蛋白質的修飾程度過大,而降低了肉中蛋白質的消化率,蒸煮不同時間的豬肉中蛋白質的消化率變化趨勢如表1所示。

由表1可知,體外模擬胃腸液消化實驗表明,熱處理的豬肉樣品中蛋白質的消化率遠高于未經熱處理的豬肉樣品中蛋白質的消化率(p<0.05)，分別增加10.4%、22.9%。而模擬胃液和模擬腸液各消化2 h后,熱處理的豬肉中蛋白質最大消化率比未經熱處理的豬肉中蛋白質消化率分別增加23.4%和22.9%,這主要是因為豬肉經加熱處理后蛋白質變性,蛋白質內部致密的空間結構遭到破壞而變得松軟,而胃蛋白酶作用的位點往往位于蛋白質分子的內部,加熱處理后原先位于分子結構內部的酶作用位點暴露,酶易到達作用部位。此外,其粘度增強,結晶能力消失,均可有效地加速酶對它的降解,因而熱處理后的豬肉中蛋白質的消化率較高[18]。

隨著熱處理時間的增加,豬肉中蛋白質的消化率呈現先增大后降低的趨勢,這可能與蛋白質的變性程度密切相關,熱處理的后期蛋白質的修飾程度過大,而不易被胃蛋白酶和胰酶等降解,所以蛋白質的消化率下降。另外,在模擬胃液和模擬腸液消化過程中豬肉蛋白的消化率均隨著消化時間的增加而顯著增大(p<0.05),且在模擬腸液階段蛋白質的消化率遠大于模擬胃液階段蛋白質的消化率,這可能是由于胃蛋白酶屬于肽鏈內切酶、專一性程度較大,主要作用于芳香族氨基酸的羧基基團形成的肽鏈;而胰酶為多種內切酶和外切酶的混合物,胰蛋白酶可切斷賴氨酸和精氨酸殘基中羧基側的肽鍵、胰凝乳蛋白酶可切斷側鏈具有疏水性氨基酸的肽鍵、羧肽酶可專一性地從肽鏈的C端逐個降解釋放出游離氨基酸的外切酶[19],因此模擬腸液階段胰酶消化蛋白質的速率會顯著高于模擬胃液階段的蛋白質的消化率(p<0.05)。

2.2不同熱處理的豬肉在消化過程中游離氨基的變化

由圖1可知,豬肉中的蛋白質經模擬體外胃腸液消化后生成了大量的游離氨基,未經熱處理的豬肉樣品消化后形成的游離氨基含量遠低于熱處理樣品消化后形成的游離氨基的含量(p<0.05),消化240 min后,熱處理比未熱處理的豬肉消化后的游離氨基含量增加12.7%～37.6%,這表明未經熱處理的豬肉比較難消化,與前面的蛋白質消化率的結論一致。隨著熱處理時間的延長,消化產物中游離氨基的含量先增多,直至熱處理時間在120 min處生成的游離氨基含量達到最大值,與蛋白質消化率的實驗結果呈現出基本相同的規律,這也驗證了存在較適宜的熱處理時間[12]。

圖1 不同熱處理的豬肉在消化過程中游離氨基的變化Fig.1 Change of free amino content of pork meat boiled under different conditions during digestion

同時,從圖1還可以看出,模擬腸液消化階段生成游離氨基的速率較快,這與酶的組成及接觸面積有關,反應后期成塊的豬肉慢慢分散開,接觸面積增大,因而消化反應速率加快。

表2 加熱時間對豬肉色澤的影響Table 2 Influence of boiling time on color of pork meat

2.3不同熱處理的豬肉色度的變化

通過豬肉樣品顏色的變化可判斷美拉德反應的程度,加熱時間對豬肉樣品色澤的影響如表2所示。

由表2可知,隨著加熱時間的增加,豬肉樣品的L*值增加,即豬肉樣品光澤變亮;a*值和b*值增大,表明熱處理后豬肉的紅色指數和黃色指數均增大,即豬肉的褐色加深;ΔE值表示待測樣品與對照樣品之間的色差值,ΔE值越大,表示顏色變化越大,熱處理過程中豬肉樣品的ΔE值隨著加熱時間的延長而顯著增大(p<0.05),熱處理15 min的豬肉樣品色差值ΔE僅為1.69,熱處理30和60 min的樣品色差值ΔE為3.30和3.74,ΔE值在2.0～4.0范圍內表明色差有一定差距,而處理120 min和240 min的豬肉樣品色差值ΔE均在4.0以上,表明色差非常大,且色澤逐漸變深、變紅、變黃,影響外觀。豬肉中含有蛋白質、脂質和少量的糖,在熱處理或貯存過程中容易發生美拉德反應而影響豬肉的色澤及營養價值,美拉德反應過程中形成的類黑精等物質又具有較強的抗氧化性,可以延長豬肉的保質期,因此,豬肉樣品熱處理過程中需要控制美拉德反應的程度,以避免形成的有色物質影響豬肉樣品的色澤。

2.4不同熱處理的豬肉中HMF形成量的變化

HMF是美拉德反應過程中通過重排產物異構化以及糖的降解而產生的中間產物,是美拉德反應中期階段的標志性產物,可通過測定豬肉在加熱和貯存過程中HMF的含量變化評定美拉德反應修飾程度。加熱處理對豬肉樣品中HMF形成量的影響如圖2所示。

圖2 加熱時間對豬肉中HMF含量的影響Fig.2 Effect of boiling time on HMF formation in pork meat注：不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)。

由圖2可知,豬肉樣品中HMF的形成量隨著加熱時間的增加而顯著增加(p<0.05),HMF的含量由未處理的豬肉樣品中為5.61 μg/g增加到18.32 μg/g,增加了約2.3倍,其變化趨勢與色度的變化一致。食品加工過程中常用美拉德反應的產物的含量,如呋喃素、HMF、熒光化合物、丙烯酰胺等[2,4,6-7],作為評定美拉德反應修飾程度的指標,其中呋喃素常作為美拉德反應初級階段的重要產物和指示物,可用于評定食品中蛋白質的營養特性和賴氨酸的損失程度,而美拉德反應的高級階段及更深度的食品加工需要用其他指標進行評定,如HMF的形成量和色度等。

3 結論

體外消化性分析表明,豬肉中蛋白質的體外消化率隨著熱處理時間的增加呈現先增大后下降的趨勢,且熱處理的豬肉樣品消化后形成的游離氨基含量遠高于未經熱處理的,即熱處理的豬肉中蛋白質更易消化。

色度和中間產物HMF形成量分析表明,豬肉樣品的色澤隨著熱處理時間的增加而加深,紅色指數和黃色指數均增大,且美拉德產物中間產物HMF的形成量也增多,這表明豬肉樣品加熱過程中美拉德反應程度隨著加熱時間的延長而增大,蛋白質的修飾程度也增加。

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Effectofheatingtreatmentoninvitrodigestibilityofproteinand5-hydroxymethylfurfuralformationinporkmeat

WANGJun,WANGZhong-he*,LUOBao

(School of Food Engineering and Biotechnology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China)

In this paper,effects of different boiling times on protein digestibility in pork meat were investigated byinvitrodigest model. Moreover,degree of modification of pork protein by boiling treatment was examined through 5-hydromethylfurfural(HMF)content as indicators. Results showed thatinvitrodigestibility of pork protein increased after boiling treatment for 10 to 240 min. Moreover,the content of free amino group increased firstly and then decreased with the increase of boiling time. Color analysis indicated that color of pork samples became dark,andL*a*b*values increased after boiling treatment. Boiling in water(greater than 120 min)caused great change of color value,which was above 4.0 and influenced appearance of pork samples. The content of intermediates HMF increased with the increase of boiling time,which indicated degree of modification of protein increased. The variation trend was consistent with that ofinvitrodigestibility of protein in pork meat. Thus,heat treatment significantly improved theinvitrodigestibility of proteins in pork,while overheating treatment affected the color and protein digestibility of pork. So,5-HMF formation and color indexes are proposed as useful indicators for monitoring damage of protein during the heating treatment of pork.

meat protein;heating-induced modifications;invitrodigestion;Maillard reaction products

2017-02-07

王軍(1981-), 女, 博士, 副教授,研究方向：食品加工與安全控制技術，E-mail：wangjun19811210@163.com。

*通訊作者:王忠合(1980-), 男, 博士, 副教授,研究方向：食品安全檢測，E-mail：wangzh20@163.com。

廣東省教育廳特色創新項目(2015KTSCX088)；潮州市科技計劃項目(2013X06)；廣東省高校優秀青年創新人才培養計劃項目(2013LYM0056)；韓山師范學院博士啟動項目(QD20140324)。

TS251.1

:A

:1002-0306(2017)16-0079-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.016