椰子谷蛋白-1功能特性的分析

(1.晉中學(xué)院,山西榆次 030619;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所,海南文昌 571339)

椰子谷蛋白-1功能特性的分析

郭帥1,2

(1.晉中學(xué)院,山西榆次 030619;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所,海南文昌 571339)

本實驗采用分步提取和膜分離結(jié)合的方法從椰肉中提取椰子谷蛋白-1,測定其氨基酸組成,利用SDS-PAGE和柱層析技術(shù)分析其分子量分布和亞基組成,利用DSC技術(shù)分析其耐熱性,然后對谷蛋白-1的乳化性和起泡性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:椰子谷蛋白-1中含有16種氨基酸,天冬氨酸和精氨酸的含量很高,SDS-PAGE表明,椰子谷蛋白-1含有5個亞基,分子量分布在19.6～50.6 kDa 之間。DSC掃描結(jié)果表明,椰子谷蛋白-1具有較好的熱穩(wěn)定性。功能特性實驗表明,椰子谷蛋白-1有良好的乳化穩(wěn)定性(85.17%±1.41%)和泡沫穩(wěn)定性(89.15%±5.75%),均優(yōu)于大豆分離蛋白。該結(jié)果表明椰子谷蛋白-1具有開發(fā)為乳化穩(wěn)定劑和泡沫穩(wěn)定劑的潛力。

椰子谷蛋白-1,分離,理化性質(zhì),功能特性

依據(jù)溶解性,蛋白質(zhì)可分為清蛋白(albumin,溶于水)、球蛋白(globulin,溶于稀鹽溶液)、醇溶蛋白(prolamines,溶于70%～90%的醇水溶液)、谷蛋白-1(glutelin-1,溶于稀酸)和谷蛋白-2(glutelin-2,溶于稀堿溶液)[1]。植物貯藏蛋白往往都含有這幾種蛋白質(zhì),各溶解度蛋白的含量和比例既決定了天然蛋白的營養(yǎng)價值,又影響其功能特性。大多數(shù)植物蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)多在pH3.0～5.0,即在酸性環(huán)境下,大多數(shù)植物蛋白溶液的靜電荷為零,溶解度最低,乳化性和起泡性較差,影響了其在食品工業(yè)尤其是酸性食品中的應(yīng)用。而谷蛋白-1的等電點(diǎn)較高,能夠很好地溶解于稀酸溶液中,在食品工業(yè)尤其是酸性食品中有潛在的用途。近年來,植物谷蛋白-1的開發(fā)受到廣泛關(guān)注。研究表明,椰子蛋白中清蛋白占21%、球蛋白占40.1%、醇溶蛋白占3.3%,谷蛋白-2占4.8%,而谷蛋白-1占14.4%[2]。椰麩是椰肉榨汁后的副產(chǎn)物,含有8%～16%的蛋白質(zhì),是豐富的植物蛋白質(zhì)資源。然而,目前椰麩僅僅被用作動物飼料或蛋糕等食品的輔料,蛋白質(zhì)等活性成分沒有被開發(fā)利用,造成了資源的極大浪費(fèi)。而目前的研究多集中于椰子油[3]、椰子分離蛋白[4-8]、椰子貯藏蛋白[9-11]等方面,對椰子清蛋白、球蛋白、谷蛋白等組分蛋白的研究較少,這對于我國椰子加工業(yè)的發(fā)展十分不利。因此,本實驗以椰麩為原料制備椰子谷蛋白-1(coconut glutelin-1,CG-1),分析其氨基酸組成、分子量分布、亞基構(gòu)成等理化性質(zhì),同時研究其乳化性、起泡性、黏度等功能特性,試圖為椰子蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

椰麩 由南椰食品科技有限公司提供;大豆分離蛋白(SPI) 上海生物科技有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醚、無水乙醇、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、樣品緩沖液、脫色液等 均為分析純;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4～97.4 kDa)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、丙烯酰胺等 Sigma公司。

JB-3型磁力攪拌器 金壇市金城碩華儀器廠;7230G型分光光度計 上海申光科學(xué)儀器公司;D-78532型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司;Thermal-20型真空冷凍干燥器 美國Thermal公司;HITACHI L-8900型氨基酸自動分析儀 日本HITACHI公司;DSC1-差式掃描量熱儀 梅特勒-托利多公司;XHF-D型分散儀 寧波科技有限公司;DYCZ-24D型電泳槽、DYY-6C型電泳儀 北京六一廠;Synene BOXF3型凝膠分析儀 日本Gene公司;RVA-Tecmaster型黏度儀 上海精密儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 脫脂椰麩的制備 椰麩→鼓風(fēng)干燥箱中干燥(50 ℃、4 h)→粉碎→過60目篩→加入石油醚(料液比為1∶10)→室溫下振蕩脫脂2 h→過濾→棄濾液→重復(fù)脫脂3～4次→脫脂椰麩。

1.2.2 椰子谷蛋白-1(CG-1)的制備 參照Hu和Esen[12]的方法,100 g脫脂椰麩中加入500 mL、0.4 mol/L NaCl,4 ℃下攪拌提取8 h,過濾,收集濾渣,再次加入0.4 mol/L NaCl,如此重復(fù)提取3次,棄去濾液,以除去椰子球蛋白。收集濾渣,加入0.1 mol/L HCl,4 ℃、攪拌提取8 h,重復(fù)提取3次,合并提取液。然后在4 ℃、10000×g下離心30 min,收集上清液,裝入截留分子量為4000 Da的透析膜中,4 ℃下、在dH2O中透析24 h,每隔2 h換一次水,將透析液真空冷凍干燥(-40 ℃、-0.1 MPa)后即得到CG-1。

1.2.3 椰子分離蛋白(coconut protein isolate,CPI)的提取 將脫脂椰麩分別與pH7.8的磷酸鹽緩沖液、pH6.8的Tris-HCl緩沖液和pH8.0的硼酸按料液比1∶20混合,4 ℃水浴中磁力攪拌提取8 h后,6000 r/min下,離心15 min,收集上清液→膜透析(半透膜截留分子量為4 kDa)→調(diào)節(jié)上清液pH至3.5～4.5,靜置0.5 h→再次磁力攪拌15 min,在6000 r/min下,離心15 min→收集沉淀→洗滌3～4次→-40 ℃下真空冷凍干燥(-40 ℃、-0.1 MPa)→CPI[7]。

1.2.4 氨基酸組成分析 稱取0.1 g椰子谷蛋白-1,加入5 mL、6 mol/L的鹽酸中,110 ℃下水解24 h。用0.45 μm的膜過濾水解液,收集濾液,在HITACHI L-8900型氨基酸自動分析儀上測定。

1.2.5 差示掃描量熱法(DSC)分析 稱取10 mg CG-1或CPI于樣品盤中,加入15 μL蒸餾水,在DSC1型掃描儀中掃描。溫度范圍為30～130 ℃,升溫速度為10 ℃/min。取一空白樣品盤加蓋作為對照。

1.2.6 SDS-PAGE凝膠電泳分析 參照文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行。將蛋白質(zhì)溶液濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL,與樣品緩沖液按1∶1的比例混合,100 ℃煮沸5 min,上樣15 μL,恒壓電泳(濃縮膠100 V,分離膠150 V),當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距膠底部5 mm時,停止電泳,剝下膠片后,將膠片放入固定液中固定30 min,然后考馬斯亮藍(lán)R-250染色,過夜,放入脫色液中脫色,直至膠片背景藍(lán)色完全透明狀。

1.2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 采用濁度法[15]。取磷酸緩沖溶液(pH=7.0)30 mL,加入0.1 g CG-1(或CPI),混勻,在高速勻漿機(jī)中以10000 r/min勻漿30 s后立即于溶液底部吸取50 μL乳濁液加到15 mL、0.1% SDS中,于500 nm處測其吸光值A(chǔ)O,此值即為。靜置10 min后,重新測定吸光值A(chǔ)t。乳化活性(emulsifying activity index,EAI)表示為:

EAI=(2.303×2×Ao×dilution factor)/(C×Ф×10000)

式(2)

其中,dilution factor為稀釋倍數(shù),C-蛋白質(zhì)濃度,Ф-油相在乳化液中的體積比例(0.25)。

乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability,ES)則為:

ES=(AO×T)/(AO-At)

式(3)

其中,T=10 min。

以SPI做對照,實驗均重復(fù)3次,取平均值。

1.2.8 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定 參考文獻(xiàn)[16]中方法進(jìn)行,略有改動,將0.1 g CG-1(或CPI)溶解到100 mL dH2O中,在高速分散器中以10000 r/min攪拌1 min,記錄勻漿停止時泡沫的體積V0,以SPI做對照,起泡性(foaming capacity,FC)計算公式如下:

FC(%)=V0/100 mL×100

式(4)

放置30 min后,記錄剩余泡沫的體積(Ve),泡沫穩(wěn)定性(foam stability,FS)的計算公式如下:

FS(%)=Ve/V0×100

式(5)

1.2.9 黏度的測定 黏度(Visocosity)的測定參照Tsumura等人[17]的方法,在RVA-Tecmaster型黏度儀上測定,以SPI做對照。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次,取平均值。采用DPS v755軟件進(jìn)行,多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1氨基酸組成

CG-1和CPI的氨基酸組成與含量如表1所示。

從表1可以看出,CG-1和CPI的氨基酸組成類似,都含有16種氨基酸,其精氨酸和谷氨酸含量都較高。8種必需氨基酸中,甲硫氨基酸的含量較低;但CG-1和CPI中亮氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸的含量以及必需氨基酸總和(TEAA)均顯著高于FAO/WHO[18]的推薦值(12.7 g/100 g蛋白質(zhì)),表明CG-1和CPI的氨基酸組成相對合理。

表1 椰子谷蛋白-1和椰子分離蛋白的氨基酸組成和含量(g/100 g蛋白質(zhì))Table 1 Composition and content of amino acid in CG-1 and CPI(g/100 g protein)

注:同行的數(shù)值上標(biāo)注的不同小寫字母表示顯著性差異(p<0.05);cTEAA,必需氨基酸總和;ND,表示未檢出。2.2 DSC分析

CPI和CG-1的DSC分析結(jié)果如圖1所示。

如圖1所示,在30～130 ℃內(nèi),隨著溫度的升高,CPI和CG-1的焓值變化相對平穩(wěn),未出現(xiàn)明顯的放熱峰或吸熱峰,即沒有發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂,表明這兩種椰子蛋白的熱穩(wěn)定性較好。

圖1 椰子分離蛋白和椰子谷蛋白-1的DSC分析Fig.1 DSC analysis of CPI and CG-1

2.3 SDS-PAGE分析

用5%濃縮膠、12%分離膠的SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)分析CG-1和CPI的分子量分布和亞基構(gòu)成,結(jié)果如圖2所示。

圖2 椰子分離蛋白和椰子谷蛋白-1的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analyses of CPI and CG-1注:各圖最左側(cè)每一條藍(lán)色條帶都表示一個蛋白質(zhì)亞基。

圖2中結(jié)果表明,在分子量分布和亞基構(gòu)成方面,CG-1和CPI之間的差異較大。CG-1主要由6個亞基組成,分子量范圍為19.6～50.6 kDa,其中分子量小于33.4 kDa的亞基的含量較高;CPI主要由7條亞基構(gòu)成,分子量范圍為18.7～51.8 kDa,其中分子量為51.8和50.6 kDa的亞基的含量較高。CPI中亞基組成和分子量的結(jié)果與前人的報道一致[8,11]。亞基構(gòu)成和分子量大小對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能特性有較大的影響。

2.4乳化性分析

不同離子強(qiáng)度下,CG-1和CPI的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和黏度如表2所示。

如表2所示,三種蛋白質(zhì)中,CG-1的乳化性顯著低于CPI和SPI(p<0.05),而CPI的乳化性最高。然而,CG-1和CPI的乳化穩(wěn)定性顯著高于SPI(p<0.05)。同時,離子強(qiáng)度為0～0.4 mol/L時,隨著離子強(qiáng)度的升高,CG-1、SPI和CPI的乳化性都升高;但當(dāng)離子強(qiáng)度增大到0.6 mol/L時,SPI和CPI的乳化性反而下降。其原因可能是低離子強(qiáng)度可以提高蛋白質(zhì)的溶解度,增強(qiáng)乳化液中蛋白質(zhì)-水-油的相互作用從而提高乳化性;而高離子強(qiáng)度則使蛋白質(zhì)的溶解度下降,稱為“鹽析”,減弱了乳化液中蛋白質(zhì)-水-油的相互作用,使乳化性降低。乳化性和乳化穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),決定其在食品工業(yè)中的用途。本實驗結(jié)果表明,CG-1和CPI具有較好的乳化穩(wěn)定性。本實驗中,CG-1的乳化性雖然很差,但它的乳化穩(wěn)定性較好,顯著優(yōu)于大豆分離蛋白,因此說其具有開發(fā)為乳化穩(wěn)定劑的潛力。

表2 椰子分離蛋白和谷蛋白-1在不同離子強(qiáng)度下的功能特性Table 2 Functional properties of the coconut cake protein fractions at different ion strength

注:同列中不同字母表示顯著性差異(p<0.05)。

2.5起泡性分析

表2中結(jié)果顯示,CG-1和CPI的起泡性都顯著低于SPI,但泡沫穩(wěn)定性卻均顯著高于SPI(p<0.05)。蛋白質(zhì)起泡性是蛋白質(zhì)-空氣-水的作用的表現(xiàn),決定蛋白質(zhì)起泡性的因素有蛋白質(zhì)的溶解度、分子大小、表面疏水性等。CG-1為酸溶性谷蛋白,在中性的水溶液中溶解度較低,這可能是其較差起泡性的原因之一。同時,表1中結(jié)果顯示CG-1和CPI中,精氨酸和谷氨酸等極性氨基酸的含量很高,導(dǎo)致其表面疏水性較低,最終表現(xiàn)出較低的起泡性。Zheng等人[19]的研究表明,蛋白質(zhì)的起泡性是由溶解性和表面疏水性共同決定的。蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性除了與溶解性和表面疏水性有關(guān)外,還與其分子量大小有關(guān)。前人的研究結(jié)果也表明,較低的起泡性往往意味著較高的泡沫穩(wěn)定性[20]。

隨著離子強(qiáng)度的升高,CG-1、CPI和SPI的起泡性都降低。這可能是因為,大量鹽離子的加入,改變了蛋白質(zhì)表面的電荷數(shù)量和性質(zhì),同時破壞了蛋白質(zhì)表面的水膜,提高了蛋白質(zhì)在空氣-水界面的表面張力,使CG-1等蛋白質(zhì)的起泡性下降。起泡性和泡沫穩(wěn)定性也是決定蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中用途的重要性質(zhì),本實驗結(jié)果表明,CG-1和CPI的起泡性較差,但泡沫穩(wěn)定性很好,可以開發(fā)為泡沫穩(wěn)定劑。

2.6黏度

具有較高黏度的蛋白質(zhì)可作為質(zhì)構(gòu)改善劑、增稠劑等應(yīng)用于火腿腸、肉湯等食品中。決定黏度的因素主要是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-水之間的作用。表2中結(jié)果表明,相同離子強(qiáng)度下,CG-1和CPI的黏度低于SPI,但高于葵花籽蛋白和花生蛋白[21]。同時,離子強(qiáng)度的增大有助于CG-1和CPI黏度的升高。SPI是較好的增稠劑,已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。本實驗結(jié)果表明,CG-1和CPI的黏度略低于SPI,也可作為增稠劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,CG-1含有16種氨基酸,必需氨基酸組成較為合理;CG-1主要含6條亞基,分子量范圍為19.6～50.6 kDa,其中分子量小于33.4 kDa的亞基的含量較高。DSC結(jié)果表明CG-1在30～130 ℃下的熱穩(wěn)定性較好。與大豆分離蛋白相比,CG-1的乳化性、起泡性和黏度較差,但其乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于大豆分離蛋白。這些結(jié)果表明,CG-1可以作為乳化穩(wěn)定劑和泡沫穩(wěn)定劑等應(yīng)用于食品工業(yè)中。

[1]闞建全.食品化學(xué)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1997.

[2]Kwon K,Bae D,Park KH,et al. Aqueous extraction and membrane techniques improve coconut protein concentrate functionality[J]. Journal of Food Science,1996,61:753-756.

[3]鄭亞軍. 椰子蛋白質(zhì)的研究與利用[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2015.

[4]劉磊,鄭亞軍,李艷,等. 椰子分離蛋白起泡性、粘度及其影響因素的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報,2011,32(12):1035-1038.

[5]鄭亞軍,趙松林,李艷,等. pH、離子強(qiáng)度等因素對椰子分離蛋白溶解性和乳化性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報,2011,32(8):226-230.

[6]鄭亞軍,李艷,馬子龍,等. 酶法提取椰子蛋白質(zhì)及其對亞基的影響[J]. 果樹學(xué)報,2009,26(1):113-118.

[7]鄭亞軍,趙松林,李艷,等. 椰子分離蛋白提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(1):226-230.

[8]Angelia MRN,Garcia RN,Caldo KMP,et al. Physicochemical and functional characterization of cocosin,the coconut 11S globulin[J]. Food Science Technology International,2010,16(3):225-232.

[9]Thaiphanit S,Anprung P. Physicochemical and emulsion properties of edible protein concentrate from coconut(CocosnuciferaL.)processing by-products and the influence of heat treatment[J]. Food Hydrocolloids,2016,52:756-765.

[10]鄭亞軍,李艷,趙松林,等.椰肉中醇溶蛋白抗氧化活性[J]. 熱帶作物學(xué)報,2009,30(7):1035-1038.

[11]鄭亞軍,趙松林,陳華,等. 椰子果肉蛋白亞基的組成及品種間的差異分析[J]. 熱帶作物學(xué)報,2009,30(1):112-118.

[12]Hu B,Esen A. Heterogeneity of soybean seed proteins:one-dimensional electrophoretic profiles of six different solubility fractions[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,1981,29:497-501.

[13]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227:680-685.

[14]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J]. Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[15]Soares LHDB,Albuquerque PM,Assmann F,et al. Physicochemical properties of three food proteins treated withtransglutaminase[J]. Ciénc Rural,2004,34:1219-1223.

[16]Shahidi F,Han XQ,Synowiecki J. Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin(Mallotusvillosus)[J]. Food Chemistry,1995,53:285-293.

[17]Tsumura K,Satio T,Tsuge K,et al. Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis[J]. LWT-Food Science and Technology,2005,38:255-261.

[18]FAO/WHO Nutrition Meetings,Report Series 51. Protein quality evaluation[R]. Rome:Food and Agricultural Organization/World Health Organization,1990.

[19]Zheng YJ,Li Y,Zhang YL,et al. Fractionation,Physicochemical Properties,Nutritional Value,Antioxidant Activity and ACE Inhibition of Palm Kernel Expeller Protein[J]. RSC Advances,2015,5:12613-12623.

[20]Damodaran S. Protein stabilization of emulsions and foams[J]. Journal of Food Science,2005,70:54-66.

[21]Khalid EK,Babiker EE,Tinay AHEL. Solubility and functional properties of sesame seed proteins as influenced by pH and/or salt concentration[J]. Food Chemistry,2003,82:361-366.

Analysisonfunctionalpropertiesofcoconutglutelin-1

GUOShuai1,2

(1.College of Jinzhong,Yuci 030619,China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences,Wenchang 571339,China)

The glutelin-1 was extracted from coconut with step by step method assisted with membrane purification technology. Then the amino acid composition,distribution of molecular weight and subunits,thermal property,emulsifying and foaming properties of coconut glutelin1 were studied. Results showed that the glutlelin-1 contained 16 kind of amino acid,with the feature of a large amount of glutamic acid and arginine. There were five subunits with molecular weight 19.6 to 50.6 kDa in coconut glutelin-1. Moreover,coconut gultelin-1 exhibited good emulsion stability(85.17%±1.41%)and foaming capacity and stability(89.15%±5.75%),which was all higher than that of soybean protein isolate. This meant that coconut gultelin-1 had potential usage in food industry as emulsion stabilizer and foam stabilizer.

coconut glutelin-1;purification;characterization;functional properties

2017-02-07

郭帥(1981-),男,碩士,講師,研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail:jzxygs@yeah.net。

海南省重點(diǎn)研發(fā)計劃(ZDZX2017061)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)16-0075-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.015