牡蠣酶解產物的組成特點及其體外免疫活性

,，2,,2,*,,2,,2,,2

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),南海生物資源開發與利用協同創新中心,廣東湛江 524088)

牡蠣酶解產物的組成特點及其體外免疫活性

李婉1,曹文紅1，2,章超樺1,2,*,秦小明1,2,高加龍1,2,鄭慧娜1,2

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),南海生物資源開發與利用協同創新中心,廣東湛江 524088)

香港牡蠣是我國南方高產低值的一種海洋貝類。為了提高其附加值,本研究以香港牡蠣為原料,通過酶法水解結合細胞實驗對酶解產物及其超濾組分進行組成特點分析和免疫活性評價。結果表明:牡蠣酶解產物及各超濾組分分子量分布主要集中在<2.5 kDa范圍內,含量達53.00%～85.00%,且氨基酸組成齊全;牡蠣酶解產物可促進脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的免疫功能,各超濾組分(>10、10～5、5～2.5和<2.5 kDa)在濃度為0.25～4.0 mg/mL范圍內,其體外免疫活性強弱具有一定的濃度相關性,且<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分的免疫功能優于其他組分。牡蠣酶解產物各超濾組分中<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分可作為進一步研究的對象。

牡蠣解產物,脾淋巴細胞,腹腔巨噬細胞,免疫調節

香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)是我國南部沿海最主要的牡蠣養殖種類,主要分布在廣東、廣西地區,以其生長快速、個大肉肥而具有巨大的市場價值。

牡蠣是一種藥食同源的食物,其入藥在我國已有上千年的歷史。《本草綱目》中對牡蠣早有記載:“多食之,能細活皮膚,補腎壯陽,并能治虛,解丹毒”。至今國內外學者對牡蠣生物活性進行了大量研究,如抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、改善記憶、ACE抑制劑、抑菌、解酒護肝等[1-8],但對于牡蠣的免疫活性功能報導較少。李超柱、YU[9-10]等主要研究了牡蠣酶解產物和多肽的免疫活性,但研究還處于基礎階段,研究對象大多是粗樣品,成分復雜,有效成分含量少,氨基酸組成、肽序、相關的功能因子及其作用機制仍然未知。

本研究以香港牡蠣為原料,通過酶法水解結合體外免疫評價證明牡蠣具有免疫活性,且利用超濾、分離純化等手段富集有效成分,有望為將來開發牡蠣免疫保健產品指明方向,同時為牡蠣高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮香港牡蠣肉 廣東湛江東風市場;動物蛋白水解酶(酶活力23×104U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;RPMI 1640 培養基、青/鏈霉素雙抗 美國Gibco公司;胎牛血清 美國Gemini公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、淋巴細胞分離液、紅細胞裂解液 武漢市Biosharp公司;中性紅 天津市天新精細化工有限公司;CCK8試劑盒 日本同仁公司;脂多糖(LPS) 美國Sigma公司;伴刀豆蛋白A(ConA) 上海源葉生物有限公司;Griess Reagent System 美國Promega公司;Folin-酚試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

UV-2102PC型紫外分光光度計尤尼柯 (上海)儀器有限公司;熱電Sorvall LYNX 6000高速落地離心機 廣州市徳真科學儀器有限公司;VAPODEST 450全自動凱氏定氮儀 德國Gerhardt公司;高效液相色譜儀LC-20AD、UV-2550型紫外檢測器 日本島津儀器有限公司;FDU-1100型真空冷凍干燥儀 東京理化器械株式會社;WTM-CM-01陶瓷膜分離設備 杭州沃騰膜有限公司;FA2104A電子分析天平 上海天平儀器廠;SHZ-B型恒溫水浴振蕩器 江蘇金壇市佳美儀器有限公司;旋轉蒸發儀R-1005 鄭州長城科工貿有限公司;HHT4-LX-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器 北京中西遠大科技有限公司;CKX41型倒置顯微鏡 日本Olympus;SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化有限公司;Forma 370型CO2恒溫箱、Multiskan FC型酶標儀 美國Thermo公司;TDL-5-A低速離心機 上海安亭科學儀器廠;pHS-3C型精密pH計 上海康儀儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 基本營養成分測定粗蛋白的測定 微量凱氏定氮法(GB/T 5009.3-2003);灰分的測定:高溫灼燒法(GB/T 5009.4-2010);粗脂肪的測定:索氏提取法(GB/T 5009.6-2003);總糖含量的測定:硫酸-苯酚法;非蛋白氮的測定:三氯乙酸沉淀法。

1.2.2 水溶性多肽含量測定 Folin-酚試劑法參照文獻[11]。

1.2.3 牡蠣酶解產物的制備 根據參考文獻[3]稍作改進,取一定量牡蠣肉攪碎,加入三倍體積的蒸餾水勻漿,過80目篩網并調pH至7.0。牡蠣勻漿液在53 ℃恒溫搖床中預熱5 min,按1000 U/g加入動物蛋白酶酶解6 h,沸水浴中滅酶10 min,迅速冷卻,酶解液6500 r/min離心20 min,收集上清液冷凍干燥備用。

1.2.4 超濾分級 利用200 μm無機陶瓷膜微濾裝置過濾除去大分子物質、膠體顆粒及雜質。取上述獲得的微濾液,選2.5、5、10 kDa超濾膜對其進行分級處理,得到>10、10～5、5～2.5和<2.5 kDa四個超濾組分。進口壓力控制在0.25 MPa。

1.2.5 牡蠣酶解產物及其超濾組分分子量分布 根據參考文獻[12]稍作改進,采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)測定酶解產物及其超濾組分的分子量分布。色譜條件:色譜柱:Waters Protein-pak 60A(WAT085250);流動相為濃度0.05 mol/L,pH 8.3 的Tris-HCl緩沖液;洗脫速度為0.7 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣體積為20 μL;檢測波長為214 nm。標準品:溶菌酶(14300 Da)、維生素B12(1355.38 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da)。以保留時間(t)和分子量的對數lgM作圖,得到分子量回歸方法為:lgM=-0.4567t+8.9462(R2=0.9976)。

1.2.6 氨基酸組成分析 水解氨基酸的測定按照GB/T 5009.124-2003方法:取適量的牡蠣酶解產物、牡蠣酶解超濾產物組分干粉,加入6 mol/L的鹽酸,110 ℃條件下水解22 h后,采用氨基酸自動分析儀以外標法測定試樣中的氨基酸含量。游離氨基酸檢測:柱前衍生法[13]。

1.2.7 牡蠣酶解產物及其超濾組分的免疫活性評價

1.2.7.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 根據參考文獻[12]稍作改進制備脾淋巴細胞懸液,確保活細胞數大于95%,最后將細胞濃度調整為3.0×106～5.0×106個/mL。將脾淋巴細胞懸液按100 μL/孔加入到96孔板中,等體積分別加入不同質量濃度的樣品組分,刺激組加入適當質量濃度的ConA,以PBS替代樣品作空白組,每組實驗設6次重復。置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養48 h,培養完后加入10 μL CCK8溶液,混勻,放入孵育箱中繼續培養2～4 h,在酶標儀上讀出450 nm處吸光值。

1.2.7.2 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅和生成NO能力的影響 根據參考文獻[12]稍作改進,確保活細胞數大于95%,最后將細胞濃度調整為3.0×105～5.0×105個/mL。將腹腔巨噬細胞培養液按100 μL/孔加入到96孔板中,等體積分別加入不同質量濃度樣品組分,刺激組加入適當質量濃度的LPS,以PBS替代樣品作空白組,每組實驗設6次重復。置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養48 h。

表1 新鮮牡蠣、酶解產物及其超濾產物組分基本營養組成比較(%)Table 1 Nutrition composition compared with the oyster,enzymatic hydrolysates and its ultrafiltration fractions(%)

注:以干基計。各組腹腔巨噬細胞培養48 h后,然后每孔加入100 μL 0.1%的中性紅生理鹽水,置于培養箱中再培養2～4 h,之后吸去上清液,用PBS緩沖液重復洗兩次,洗完后再用移液槍取200 μL的細胞溶解液于96孔板中,使細胞溶解,溶解方法是室溫條件下搖晃10 min,將96孔板置于酶標儀中,于540 nm處測其吸光度值,吸光度值可反映腹腔巨噬細胞的吞噬能力。

各組腹腔巨噬細胞培養48 h后,吸取每孔的上清液,使用一氧化氮測定試劑盒對小鼠巨噬細胞生成NO的能力檢測,于540 nm處測其吸光度值,根據標準曲線得出NO的摩爾濃度。

1.3數據處理

表2 超濾膜處理前后不同組分各肽段占總肽含量比值(%)Table 2 Percentage change of different molecular weight ingredients in hydrolysates pre-and post-ultrafiltration(%)

2 結果與分析

2.1牡蠣、酶解產物及其超濾組分基本營養成分分析

牡蠣肉、酶解產物及各超濾組分基本營養成分組成見表1。由表1可看出,各超濾組分的粗蛋白含量高于新鮮牡蠣及其酶解產物,以干基計在60%左右,說明超濾分離后粗蛋白得到了濃縮。新鮮牡蠣與其酶解產物的總糖含量相差不大,總糖含量以干基計約為43.00%,但顯著高于各超濾產物組分的總糖含量(p<0.05);在各超濾組分之間,總糖含量關系:>10 kDa組分與10～5 kDa組分相當,但這兩個組分含糖量顯著高于5～2.5 kDa組分(p<0.05),含糖量最低的是<2.5 kDa組分,含糖量以干基計為22.79%。牡蠣經過酶解超濾后非蛋白氮含量顯著增加(p<0.05),各超濾組分>酶解產物>新鮮牡蠣,說明酶解效果較好,超濾分級具有富集小分子的作用。

2.2牡蠣酶解產物及其超濾組分分子量分布

采用HPSEC法測定牡蠣酶解產物及各超濾組分分子量分布,分子量分布圖譜如圖1所示,多肽含量分布及含量百分比見表2。由圖1和表2可知,牡蠣酶解產物及各超濾組分多肽的分子量分布主要集中于<2.5 kDa范圍內,含量百分比在53.00%～85.00%之間,且<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分的小分子多肽含量明顯高于其他組分,分別為84.66%和71.92%,分子量>10 kDa次之,2.5～5、5～10 kDa較少,顯示酶解效果好,短肽含量高。目前發現的免疫活性肽類物質的相對分子量一般在2000 Da以下[14],這預示著牡蠣酶解產物超濾組分可能具有較強的免疫活性。免疫分子生物學研究指出,能夠引起機體免疫排斥反應的物質的分子量通常在10000 Da以上[15],分子量小的小分子,不具備免疫原性,進入機體后不被機體識別,一般不能誘發免疫排斥反應。

圖1 蛋白酶解產物及其超濾組分的分子量分布色譜圖Fig.1 The molecular weight distribution of the protein hydrolysates from oyster and its ultrafiltration fractions

表3 酶解產物及各超濾組分氨基酸組成分析(g/100 g原料)Table 3 Composition and content of amino acid of the enzymatic hydrolysates from oyster and its ultrafiltration fractions(g/100 g raw material)

注:以干基計,*為必需氨基酸,Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Gly 7種氨基酸為疏水性氨基酸。

此外,牡蠣酶解產物及各超濾組分(>10、10～5、5～2.5、<2.5 kDa)水溶性多肽含量分別為22.32、23.68、22.31、26.09和32.80 mg/g,為體外免疫活性實驗配制不同質量濃度的樣品做準備。

2.3氨基酸組成分析

食物蛋白質中氨基酸組成對機體各種生理功能具有重要意義。牡蠣酶解產物及各超濾組分中氨基酸組成如表3所示。由表3可知,酶解產物及各超濾組分氨基酸種類齊全,分布均勻。5～2.5 kDa組分和<2.5 kDa組分水解氨基酸中必需氨基酸與氨基酸總和比值分別為39.24%、43.28%,必需氨基酸與非必需氨基酸比值分別為64.57%、76.30%,符合WHO和FAO推薦標準中理想蛋白質模式[16]。酶解產物與各超濾組分相比,其水解及游離氨基酸中疏水性氨基酸與氨基酸總和比值均低于各超濾組分,其中5～2.5 kDa組分和<2.5 kDa組分疏水性氨基酸與氨基酸總和比值明顯高于其他組分。纈氨酸是一種疏水性氨基酸,更是人體所需的一種必需氨基酸,其與機體免疫、繁殖性能等密切相關[17]。各超濾組分(>10、10～5、5～2.5、<2.5 kDa)水解氨基酸中纈氨酸分別為2.59%、2.71%、2.66%、2.86%,游離氨基酸中纈氨酸分別為1.48%、1.67%、1.92%、1.94%,均高于酶解產物。各超濾組分水解和游離氨基酸中的谷氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸含量均高于酶解產物,且5～2.5 kDa組分和<2.5 kDa組分中亮氨酸和苯丙氨酸含量最高。有研究顯示[18-20],多肽的免疫活性與肽段中的疏水性氨基酸有關,絕大多數免疫活性肽中疏水性氨基酸占有較大的比例,且免疫活性肽的肽鏈末端為疏水性氨基酸。以陸生動物為原料進行的研究表明，纈氨酸可以提高免疫細胞增殖能力,促進免疫因子的分泌[21]。Yang Ruiyue等[22]發現馬哈魚蛋白水解多肽中的谷氨酸和亮氨酸能通過調節ConA的活性來增強免疫反應。程媛等[23]研究發現在大米中的阿片肽中存在一種結構,即含有Tyr-X-Phe序列,其中X可為一個或一個以上的氨基酸,這種結構是肽段保持阿片肽活性重要因素。綜上可知5～2.5 kDa組分和<2.5 kDa組分達到較好蛋白質標準,且免疫活性優于其他組分。

2.4牡蠣動物蛋白酶酶解產物的免疫活性評價

2.4.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 如圖2所示,牡蠣酶解產物在質量濃度為0.3、0.6 mg/mL時可刺激小鼠脾淋巴細胞增殖,且0.6 mg/mL酶解產物組促進淋巴細胞增殖能力顯著優于0.3 mg/mL酶解產物組(p<0.05),增殖率達到32.96%;ConA是非特異性有絲分裂源,單獨作用于脾淋巴細胞時能夠促進其增殖轉化,與某些特異性抗原共同作用時,對促進脾淋巴細胞增殖轉化有協同作用。由圖2可知,在一定劑量范圍內酶解產物能與ConA協同作用,提高脾淋巴細胞增殖轉化能力,牡蠣酶解產物在0.6 mg/mL濃度下的細胞增值率39.90%。單純牡蠣酶解產物組與ConA組相比,其對小鼠脾淋巴細胞增殖能力比ConA組低,ConA組分別為36.80%、48.62%。

圖2 酶解產物對淋巴細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of the enzymatic hydrolysates from oyster on lymphocyte proliferation注:字母不同表示差異顯著,p<0.05;圖3～圖7同。

2.4.2 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅和生成NO能力的影響 巨噬細胞是具有吞噬、呈遞抗原、分泌多種細胞因子的非特異性免疫細胞,能有效防御因病原體侵害而引起的炎癥反應和組織損傷,是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線,因此在先天性免疫中起重要作用。如圖3、圖4所示,酶解產物質量濃度為0.3、0.6 mg/mL時與空白組相比,濃度為0.3 mg/mL酶解產物對促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅差異不顯著(p>0.05),濃度為0.6 mg/mL的酶解產物對促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅和誘導生成NO都具有顯著影響(p<0.05)。單獨有絲分裂原LPS對誘導小鼠腹腔巨噬細胞生成NO具有劑量相關性,質量濃度為0.3 mg/mL時差距不顯著(p>0.05),質量濃度為0.6 mg/mL時LPS組誘導作用顯著高于酶解產物組(p<0.05)。

圖3 蛋白酶酶解產物對腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Fig.3 Effect of the enzymatic hydrolysates from oyster on phagocytic function in peritoneal macrophages

2.5牡蠣酶解產物超濾組分的免疫活性評價

2.5.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 由圖5可知,在0.25～4.0 mg/mL濃度范圍內,隨著質量濃度的不斷升高,各組分對小鼠脾淋巴細胞增殖作用均呈現先上升趨勢,且對脾淋巴細胞的增殖作用都顯著高于單獨有絲分裂原ConA組(p<0.05),說明各超濾組分對脾淋巴細胞具有增殖轉化作用,效果明顯。比較各組分對脾淋巴細胞增殖活性的影響,<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分對脾淋巴細胞的增殖作用優于其他組分。不同物質對淋巴細胞增殖作用均存在最適作用劑量,即在此劑量下對淋巴細胞增殖作用最為顯著,而高于或低于此劑量則有可能無增殖作用或增殖作用不明顯。當質量濃度為0.5 mg/mL時,對促進脾淋巴細胞增殖活性效果優于馬氏珠母貝超濾產物[24];當質量濃度為1.0 mg/mL時,效果優于波紋巴非蛤超濾產物[12]。

圖4 蛋白酶酶解產物對腹腔巨噬細胞生成NO功能的影響Fig.4 Effect of the enzymatic hydrolysatesfrom oyster on NO secretion ability in peritoneal macrophages

圖5 不同超濾組分對淋巴細胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of different utrafiltration products on lymphocyte proliferation

2.5.2 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅功能的影響 如圖6所示,各超濾組分在0.25～4.0 mg/mL濃度范圍內,隨著質量濃度的逐漸升高,各超濾組分對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅作用均呈現先上升后下降的趨勢,且質量濃度均在1.0 mg/mL時對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅功能最好,當質量濃度大于1.0 mg/mL時,腹腔巨噬細胞吞噬中性紅功能下降。在質量濃度為0.5 mg/mL時,比較各組分對腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響,<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分優于其他組分,且具有顯著性(p<0.05)。不同物質對腹腔巨噬細胞吞噬作用均存在最適作用劑量,即在此劑量下對腹腔巨噬細胞吞噬作用最為顯著,而高于或低于此劑量則有可能無吞噬作用或吞噬作用不明顯。黃演君等[25]研究了毛蚶多肽提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅功能的影響,在質量濃度為1.0 mg/mL時,吞噬功能最強,但低于牡蠣酶解產物超濾組分中<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分。

圖6 不同超濾組分對腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響Fig.6 Effect of different utrafiltration products on phagocytic function in peritoneal macrophages

2.5.3 對小鼠腹腔巨噬胞生成NO能力的影響 如圖7所示,在0.25～4.0 mg/mL濃度范圍內,各超濾組分均可明顯促進小鼠腹腔巨噬細胞產生NO,并呈現一定的劑量依賴性,與空白組相比,各超濾組分誘導巨噬細胞生成NO的能力均高于空白組,且具有顯著性(p<0.05)。與LPS組相比,低濃度時誘導生成NO強度與LPS組相當,隨濃度的增加生成NO的能力降低,高濃度時低于LPS組。各超濾組分相比,<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分這兩個組分誘導腹腔巨噬細胞生成NO的能力優于其他組分,氨基酸組成差異可能是超濾所得肽段影響小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅、生成NO的主要因素之一。

圖7 不同超濾組分對腹腔巨噬細胞生成NO的影響Fig.7 Effect of different utrafiltration products on NO secretion ability in peritoneal macrophages

3 結論

牡蠣是一種高蛋白、低脂肪的海產品,資源極為豐富。將其酶解并超濾分離后,酶解產物及其超濾組分的小分子肽和疏水性氨基酸含量較高,且氨基酸組成完善。通過體外免疫活性評價,結果顯示牡蠣酶解產物質量濃度為0.3、0.6 mg/mL時,能有效促進小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的免疫功能。為了進一步確定牡蠣酶解產物免疫活性的分布,對酶解產物進行超濾富集,并結合細胞實驗對其免疫活性進行分析評價,發現各超濾組分均具有免疫增強作用,其中<2.5 kDa組分和5～2.5 kDa組分對促進小脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的免疫功能效果更佳。但具體的活性物質還有待于進一步深入研究。

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Compositioncharacteristicsofoysterenzymatichydrolysateanditsimmuneactivityinvitro

LIWan1,CAOWen-hong1,2,ZHANGChao-hua1,2,*,QINXiao-ming1,2,GAOJia-long1,2,ZHENGHui-na1,2

(1.College of Food Science and Teachnology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Developmemt Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Zhanjiang 524088,China)

Hongkong oyster is a king of marine shellfish in southern China with high yield and low value.In order to increase its added value,this study took Hongkong oyster as raw materials,through enzymatic hydrolysis combined with cell experiment of hydrolysates and its ultrafiltration fractions analyzed the composition characteristics and immune activity evaluation. The results indicated that the oyster hydrolysates and its ultrafiltration fractions molecular weight distribution were mainly concentrated in the<2.5 kDa,and the content was 53.00%～85.00%,and the complete amino acid composition. The oyster hydrolysatesinvitrocan promote the immune function of mice spleen lymphocytes and peritoneal macrophages. Further study on the immune activity of oyster hydrolysates,in the concentration range of 0.25～4.0 mg/mL,invitroassays of cellular immune captivity of different ultrafiltration products(>10,10～5,5～2.5 kDa and<2.5 kDa)hasa certain concentration correlation,and<2.5 kDa and 5～2.5 kDa components have significant immunomodulatory effects.<2.5 kDa and 5～2.5 kDa afractions of each oyster hydrolysates ultrafiltration components may be used as an object for further study.

hydrolysates of oysters;spleen lymphocyte;peritoneal macrophages;immunoregulation

2017-04-07

李婉(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：水產品加工與安全，E-mail:m18944942363@163.com。

*通訊作者:章超樺(1956-)，男，博士，教授，研究方向：水產品加工及高值化利用，E-mail:zhangch2@139.com。

國家現代農業產業技術體系(CARS-48-07B)。

TS254.2

:A

:1002-0306(2017)16-0035-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.008