沙蒿籽總黃酮和總多酚及其抗氧化活性

,, ,, ,*,,*

(1.陜西省食品綠色加工與安全控制工程實驗室,陜西西安 710119;2.陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710119;3.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193)

沙蒿籽總黃酮和總多酚及其抗氧化活性

郜安寧1,2,周志昊1,2,黃峰3,邵紅軍1,2,張泓3,*,楊興斌1,2,*

(1.陜西省食品綠色加工與安全控制工程實驗室,陜西西安 710119;2.陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710119;3.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193)

本文測定了沙蒿籽的四種不同極性溶劑提取物中總黃酮和總多酚的含量、化學成分及其體外抗氧化活性。結果顯示:沙蒿籽總黃酮和總多酚的提取含量與溶劑的極性相關,甲醇提取物的總黃酮(33.30±0.11) mg/g和總多酚(80.1±0.16) mg/g含量最高,其次是丙酮和乙酸乙酯提取物,氯仿提取物含量較低。相對應的是,甲醇提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力最強,其IC50分別是19.09、26.30 μg/mL,其鐵離子還原能力也明顯高于其它三種提取物。通過HPLC法檢出槲皮素和兒茶素兩種黃酮,均在甲醇提取物中含量最高,分別為5.15、28.24 mg/g。這表明,甲醇更適宜于沙蒿籽中總多酚和總黃酮的提取,這為沙蒿籽作為抗氧劑的開發利用提供了理論依據。

沙蒿籽,總黃酮,總多酚,抗氧化活性

白沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)是菊科蒿屬多年生、超旱生沙生植物,又名黃蒿、籽蒿或黃毛菜籽、圓頭沙蒿,廣泛分布在我國騰格里沙漠、烏蘭布和沙漠等西北部地區[1-3]。白沙蒿植株產籽量大,枝葉常作為飼料,籽粒藥食兼用,我國西北地區就有使用沙蒿籽粉增加面條延展性的習慣[4-5]。現對沙蒿籽的研究多集中于沙蒿油、沙蒿多糖和沙蒿膠,研究發現沙蒿油中不飽和脂肪酸含量高于90%,且富含維生素E[6]。沙蒿多糖具有顯著的抗氧化、降血糖和抗腫瘤活性[7-8],而沙蒿膠可起到改善食品口感,增加食品持水性、穩定性的作用[9-10]。

更為重要的是,沙蒿富含黃酮等生物活性成分。張杰對白沙蒿全草的化學成分進行了研究,從中分離鑒定出了包括橙皮素、金合歡素、金圣草黃素在內的11個黃酮類化合物;趙東保等也在沙蒿的乙醇提取物中分離并鑒定出了8種黃酮類化合物[11-14]。但目前對沙蒿籽總黃酮、總多酚的提取及活性研究鮮有報道。因此,本研究以沙蒿籽為研究對象,研究不同溶劑提取對沙蒿籽中總黃酮和總多酚的影響,并測定其抗氧化活性,以期為沙蒿籽植物資源在食品、醫藥等領域的廣泛應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)籽 購于甘肅武威,根據《中華人民共和國藥典》的鑒定標準,經鑒定為白沙蒿籽;DPPH、TPTZ、ABTS、乙酸乙酯、沒食子酸 Sigma公司;標準品(原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素) 中國藥品生物制品所;乙腈、甲醇 色譜級,美國Honeywell公司;Folin-Ciocalteu 上海瑞谷生物科技公司;其它試劑 均為分析純。

LC-2010A高效液相色譜 日本shimadzu公司;Multiskan Go全波長酶標儀 美國熱電公司;MILLI-Q超純水儀 美國MILLIPORE公司;Q/BKYY31-2000電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療機械廠;R-3型旋轉蒸發儀 BUCHI公司。

1.2實驗方法

1.2.1 提取物的制備 將干燥的沙蒿籽粉碎過60目篩得沙蒿籽粉末,分別精密稱取20 g沙蒿籽粉末,按照1∶20 (g/mL)比例分別加入甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿于室溫下浸提24 h,重復浸提三次,合并不同溶劑提取濾液并用無水硫酸鈉干燥,后于40 ℃減壓濃縮,得到沙蒿籽不同溶劑粗提取物浸膏。精密稱取各提取物浸膏10 mg,分別用甲醇溶解置于-4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 總多酚含量的測定 總多酚標準曲線建立:利用Folin-Ciocalteu法測定樣品總多酚(total polyphenols content,TPC)含量[15]。精確稱取0.2 g沒食子酸(Gallic acid)標準品,用50%乙醇定容至1000 mL,分別取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標準品,各加入福林酚試劑2.4 mL,充分振蕩后靜置3～4 min,再分別加入12%的Na2CO3溶液4.8 mL,用50%的乙醇定容至10 mL容量瓶中。室溫條件下避光反應2 h,以試劑空白為對照,在760 nm波長下測定吸光度值,記錄實驗數據,以濃度為橫坐標吸光度值為縱坐標作標準曲線,得回歸方程為Y=0.616X+0.11,R2=0.9941。配制濃度為1 mg/mL的不同溶劑提取物樣品溶液,取1 mL按照標準曲線的操作步驟進行反應,之后測定吸光度值,重復三次并記錄。根據沒食子酸測定的標準曲線,計算出樣品中的TPC含量,表示為沒食子酸當量(GAE,mg GAE/g提取物)。

1.2.3 總黃酮含量的測定 總黃酮標準曲線的建立:黃酮含量用NaNO2-Al(NO3)3比色法[16]測定。精確稱取0.25 g蘆丁,用50%乙醇溶解,稀釋到1000 mL,分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4 mL蘆丁溶解液,加入0.4 mL 5% NaNO2,室溫靜置6 min;然后加入0.4 mL的10% Al(NO3)3,放置6 min后再加入4%的NaOH 4.0 mL,搖勻使其充分反應,加50%乙醇定容至10 mL,放置15 min使其反應充分,在510 nm波長處測定吸光度大小,記錄實驗數據,以濃度為橫坐標吸光度值為縱坐標作標準曲線,得回歸方程為Y=0.6732X-0.1111,R2=0.9961。取1 mL不同溶劑提取物樣品溶液,按上述操作步驟進行反應,測定其吸光值,重復三次并記錄。以蘆丁作為標準曲線,樣品中總黃酮的含量表示為蘆丁當量(RE,mg RE/g提取物)。

1.2.4 樣品化學成分的HPLC分析 采用色譜條件[17]:色譜柱:Venusil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:含0.5%的甲酸水溶液,流動相B:乙腈/甲醇,80∶20,v/v,梯度洗脫程序設置為:0～5 min,8%溶劑B;5～15 min,8%～16% B;15～40 min,16%～30% B;40～55 min,30%～60% B;55～60 min,60% B;60～70 min,60%～30% B。柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣量:20 μL,檢測器:UV檢測器,檢測波長:280 nm。樣品經0.45 μm濾膜過濾后進樣。根據標準品的保留時間和濃度對樣品中的黃酮和酚類化學成分進行定性和定量分析。

1.2.5 抗氧化性的測定

1.2.5.1 樣品對DPPH自由基的清除作用 參照文獻[18-19]的方法并稍作修改,評價樣品溶液對DPPH自由基的清除能力。將3.0 mL DPPH(0.1 mmol/L)溶液與1.0 mL不同濃度的樣品溶液分別加入試管中,充分混合,黑暗處理30 min,在517 nm處測定吸光值A1,相同條件下的DPPH自由基吸光度值A0為對照。樣品對DPPH的清除率按以下方法計算:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.5.2 樣品對ABTS自由基的清除作用 參照之前的測定方法[20]。配制ABTS自由基母液,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合后,室溫條件下避光12 h以便生成ABTS自由基。將ABTS自由基母液用甲醇適當稀釋作為工作液使用。取0.5 mL的樣品溶液和2.7 mL的ABTS自由基工作液在30 ℃下混合均勻并孵育6 min,在745 nm條件下測定其吸光值As,以在相同條件下0.5 mL甲醇和2.7 mL的ABTS自由基工作液的混合溶液的吸光值AC為對照,每個樣品對ABTS自由基的清除能力用以下公式進行算:

ABTS自由基的清除率(%)=(Ac-As)/Ac

1.2.5.3 鐵離子還原能力 分別取濃度為50、100、200、400、800、1000 μmol/mL的FeSO4·7H2O溶液0.5 mL,加入4.5 mL FRAP試劑(由0.3 mol/L醋酸緩沖液、25 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液及2.5 mL組成),室溫下靜置30 min,于593 nm處測定吸光值,記錄實驗數據,以FeSO4濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標制作標準曲線。按照標準曲線的制作方法,取濃度為1 mg/mL的樣品溶液0.5 mL,加入FRAP試劑,靜置后于593 nm處測定吸光值,空白組由甲醇溶液代替樣品溶液,樣品的還原能力以達到相同吸光度值所用μmol Fe2+/g表示,FRAP值越大表示其抗氧化活性越高[21]。

1.2.6 數據處理分析 所有實驗均重復測定3次,所有數據均用Origin 7.0軟件處理作圖,并采用DPS 9.5數據處理系統進行顯著性分析。數據表示為平均值±標準偏差,p<0.05認為具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1總多酚和總黃酮含量

用不同溶劑提取的沙蒿籽中總多酚和總黃酮含量測定結果如表1所示。從表1中可以看出,沙蒿籽中總多酚和總黃酮含量隨著提取溶劑的不同有明顯差異,溶劑極性越大,總多酚和總黃酮含量越高。其中,甲醇溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量最高,其次分別是丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和氯仿提取物。

表1 沙蒿籽不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量Table 1 The total polyphenolic content and total flavonoids indifferent solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds content

2.2 HPLC分析

進一步利用HPLC對標準品與樣品進行了分析,7種標準品色譜圖如圖1(A)所示,在測定條件下7種標準品實現了良好的分離。從圖1(B～E)可知,不同極性溶劑的提取物組分和含量差異明顯,甲醇和丙酮大極性提取物中黃酮類化合物種類較氯仿提取物的多,這與Alothman對三種熱帶水果不同極性提取物中黃酮類化合物含量的研究結果一致,大極性溶劑提取物的黃酮含量也比較高[22-23]。將樣品色譜圖與標準品色譜圖對照,發現沙蒿籽提取物中存在槲皮素和兒茶素2種化合物,槲皮素在4種提取物中均有檢出,含量在0.49～5.15 mg/g之間;而兒茶素僅在甲醇和丙酮提取物中檢測出,含量分別為28.24、24.26 mg/g。

圖1 沙蒿籽不同溶劑提取物的液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of the different solvent extracts of A.sphaerocephala Krasch seeds注:A～E分別表示黃酮類標準品、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿提取物的液相色譜圖;1-原兒茶酸;2-兒茶素;3-表兒茶素;4-咖啡酸;5-阿魏酸;6-蘆丁;7-槲皮素。

圖2 沙蒿籽不同溶劑提取物對DPPH的清除作用Fig.2 The DPPH radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3抗氧化性的測定

2.3.1 DPPH的清除作用 DPPH是一種穩定自由基,其電子在517 nm附近有較強的吸收峰,在實驗中常被用來檢測物質的自由基清除活性。由圖2可以看出,DPPH自由基的清除率隨著不同溶劑提取物的濃度的增加而增加,并在該濃度范圍內(10～50 μg/mL)呈現出一定的量效關系,其中甲醇提物對DPPH自由基的清除能力最強,其IC50值為19.09 μg/mL,其次是丙酮提取物,IC50值為23.27 μg/mL。不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力由大到小分別是:甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物,不同溶劑提取物之間清除能力差異顯著(p<0.05),這一結果與劉曦等人對不同溶劑提取藍莓葉的活性成分研究所得到的甲醇提取物總黃酮含量最高,抗氧化能力最強的結果一致[24-26]。

2.3.2 ABTS自由基的清除作用 不同溶劑提取物在不同濃度條件下對ABTS自由基的清除效果如圖3所示。結果表明,各樣品有一定的清除ABTS自由基的能力,且仍是甲醇提取物活性最好,在濃度為100 μg/mL時,清除率高達90.02%，其IC50是26.30 μg/mL,丙酮提取物次之,為89.24%,在濃度為80 μg/mL時,極性由大到小,各提取物的ABTS自由基清除率分別是89.41%、88.56%、75.69%、62.84%。不同溶劑提取物的ABTS自由基清除率,分別是甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物。甲醇、丙酮、乙酸乙酯及氯仿提取物組間差異顯著(p<0.05)。

圖3 沙蒿籽不同溶劑提取物對ABTS的清除作用Fig.3 The ABTS radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3.3 鐵離子還原能力 由圖4可知,不同溶劑提取物均有一定的抗氧化活性,其對鐵離子的還原能力存在明顯差異,其中甲醇提取物的活性最強(920.45 μmol Fe2+/g),而氯仿提取物的活性最弱(621.76 μmol Fe2+/g)。

圖4 沙蒿籽不同溶劑提取物鐵離子還原能力Fig.4 The ferric-reducing power assay of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.4不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性

4種溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關系數如表2所示。總多酚與DPPH、ABTS、FRAP的R2分別是0.96、0.88、0.89,相關性顯著,表明沙蒿籽提取物中總多酚含量的高低反映了其抗氧化能力的強弱,提取物中總多酚含量增加,抗氧化活性也隨之增加。這與Alothman M等人的研究結果一致[23]。總黃酮與抗氧化活性的相關系數分別是0.80、0.92、0.63,有顯著的正相關性(p<0.05)。

表2 提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性Table 2 The correlation between content of the total polyphenolic content and total flavonoids and the antioxidant activity of different extracts

注:*:相關性顯著,p<0.05。

3 結論

研究了4種溶劑提取對沙蒿籽中總黃酮和總多酚含量及抗氧化活性的影響,發現提取物總黃酮和總多酚的含量與提取溶劑極性正相關,甲醇提取物總黃酮和總多酚的含量最高,體外抗氧化活性最強。同時,不同溶劑提取物中黃酮類化合物種類也有所差別,甲醇和丙酮提取物中含有兒茶素和槲皮素兩種常見黃酮類物質,而氯仿和乙酸乙酯提取物中僅有槲皮素。

沙蒿籽是營養和食品加工價值兼具的野生食用資源,本研究對沙蒿籽粒抗氧化活性的研究結果表明沙蒿籽具有開發為天然抗氧化劑的潛力,同時其體內抗氧化活性和抗氧化機理有待深入研究。

[1]張繼,馬君義,姚健等. 野生植物白沙篙資源的綜合開發利用研究[J]. 草業科學,2002,19(7):10-13.

[2]中國科學院西北高原研究所. 青海植物志[M]. 西寧:青海人民出版社,1996:405-407.

[3]中國植物志編委會. 中國植物志[M]. 北京:科學出版社,1991:189-280.

[4]Ren D Y,Zhao Y,Nie Y,et al. Hypoglycemic and hepatoprotective effects of polysaccharides from Artemisia sphaerocephalaKraschseeds[J]. International Jouronal of Biological Macromolecules,2014,69:296-306.

[5]Xing X H,Zhang Z M,Hu X Z,et al. Antidiabetic effects of Artemisia sphaerocephalaKrasch gum,a novel food additive in China,on streptozotocin-induced type 2 diabetic rats[J]. Journal of Ethnopharmacology,2009,125:410-416.

[6]白壽寧,雍彤五,云季芳. 沙蒿籽提取沙蒿油及沙蒿膠研究概況與前景[J]. 包裝與食品機械,2000,18(3):17.

[7]Jiang Y Y,Wang L,Zhang L,et al. Characterization,antioxidant and antitumor activities ofpolysaccharides from Salvia miltiorrhiza Bunge[J]. International Jouronal of Biological Macromolecules,2014,70:92-99.

[8]Zheng Q,Ren D Y,Yang N N,et al. Optimization for ultrasound-assisted extraction of polysaccharideswith chemical composition and antioxidant activity from the Artemisia sphaerocephala Krasch seeds[J]. International Jouronal of Biological Macromolecules,2016,91:856-866.

[9]J Guo Q B,Cui S W,Wang Q,et al.Extraction,fractionation and physicochemical characterization of water solublepolysaccharides from Artemisia sphaerocephala Kraschseed[J]. Carbohydrate Polymers,2011,86,831-836.

[10]牛小霞,李潤喜,劉文濤，等. 野生植物白沙蒿的種子特性及開發應用研究進展[J]. 農業科技通訊,2012,(5):234-237.

[11]趙東保,楊玉霞,張衛,等. 黑沙蒿黃酮類化學成分研究[J]. 中國中藥雜志,2005,30(18):1430-1432.

[12]張杰,李林璽,劉繡華,等. 白沙蒿化學成分研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2012,37(2):238-242.

[13]王林燕,馬群,白潔,等. 沙蒿嘎不同部位總黃酮和艾納香素含量比較[J]. 中華中醫藥學刊,2015,33(1):196-198.

[14]肖斌,白娟娟,戚磊,等. 黑沙蒿的資源分布、化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中國藥房,2016,27(13):1862-1864.

[15]李濤. 蘋果渣中多酚的提取分離技術研究[D]. 楊凌:西北農林科技大學,2007.

[16]劉鵬莉,莊桂東,王珊珊. 玫瑰果多酚的提取[J]. 食品與發酵工業,2013,39(7):236-240.

[17]Li T,Zhu J,Guo L,et al. Differential effects of polyphenols-enriched extracts from hawthorn fruit peels and fleshes on cell cycle and apoptosis in human MCF-7 breast carcinoma cells[J]. Food Chemistry,2013,141(2):1008.

[18]Song Y S,Kim S H,Sa J H,et al. Anti-angiogenic,antioxidant and xanthine oxidase inhibition activities of the mushroom Phellinuslinteus[J]. Journal of Ethnopharmacology,2003,88(1):113-116.

[19]Zou C,Du Y M,Li Y,et al. Preparation of lacquer polysaccharide sulfates and their antioxidant activityinvitro[J]. Carbohydrate Polymers,2008,73(2):322-331.

[20]Re R,Pellegrini N,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cationdecolorizationassay[J]. Free Radical Biology and Medicine,1999,26(9-10):1231-1237.

[21]Benzie I F,Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP)as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239:70-76.

[22]Qasim M,Aziz I,Rasheed D M,et al. Effect of extraction solvents on polyphenols and antioxidant activity of medicinal halophytes[J]. Pakistan Journal of Botany,2016,48(2):621-627.

[23]Alothman M,Bhat R,Karim A A. Antioxidant capacity and phenolic content of selected tropical fruits from Malaysia,extracted with different solvents[J]. Food Chemistry,2009,115(3):785-788.

[24]劉曦,祝連彩,王伯初. 藍莓葉不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J]. 食品工業科技,2013,34(12):101-105.

[25]Wang D Y Zhao Y,Sun Y F,et al. Protective effects of Ziyang tea polysaccharides on CCl4-induced oxidative liver damage in mice[J]. Food Chemistry,2014,143:371-378.

[26]賈東升,李榮喬,謝曉亮. 連翹葉不同溶劑提取物體外抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發,2016,37(2):14-18.

Totalflavonoidsandtotalpolyphenoliccontent,anditsantioxidantabilityofArtemisiasphaerocephalaKraschseeds

GAOAn-ning1,2,ZHOUZhi-hao1,2,HUANGFeng3,SHAOHong-jun1,2,ZHANGHong3,*,YANGXing-bin1,2,*

(1.Shaanxi Engineering Laboratroy for Food Green Processing and Security Control,Xi’an 710119,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China;3.Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 100193,China)

The total flavonoids content(TFC),total polyphenoliccontent(TPC),chemical composition and antioxidant activity of the different solvent extracts ofArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds were investigated. The results showed that the TFC and TPC were correlated with the polarity of solvents used here,the methanol extracts was showed to contain the highest level of TFC(33.30±0.11) mg/gand TPC(80.1±0.16) mg/g which followed by acetone,ethyl acetate and chloroform extracts. Furthermore,the methanol extracts was the most potent DPPH and ABTS radical-scavenger,the inhibitory concentration 50%(IC50)were 19.09,26.30 μg/mL,respectively. The ferric reducing activity of the methanol extracts was also higher than the other three extracts. Meanwhile,both quercetin and catechin were validated by HPLC in the methanol extracts with higher content of 5.15,28.24 mg/g,respectively. In short,methanol is suitable for the total polyphenolic and flavonoids extraction from seeds ofA.sphaerocephalaKrasch,and the extracts might be a valuable antioxidant resource.

ArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds;total flavonoids;total polyphenols;antioxidant activity

2017-02-07

郜安寧(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品營養與衛生，E-mail：anningg123@163.com。

*通訊作者:張泓(1958-)，男，博士，研究員，研究方向：食品工程，E-mail:zhanghong03@cas.cn。 楊興斌(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學與工程，E-mail：xbyang@snnu.edu.cn。

農業部農產品加工重點實驗室開放課題項目(2015007)；中央高校基本科研業務費專項基金項目(GK20102001)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)16-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.002