干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯浸種對棉花種子萌發(fā)期NAC轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

嚴曉紅，包秋娟，張富春

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯浸種對棉花種子萌發(fā)期NAC轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

嚴曉紅，包秋娟，張富春

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

【目的】研究干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯浸種棉花種子萌發(fā)期NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達變化，分析NAC轉(zhuǎn)錄因子在油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)調(diào)控棉花抗旱中的作用。【方法】根據(jù)陸地棉轉(zhuǎn)錄因子NAC家族的基因序列，擴增獲得棉花新陸早17號NAC家族中的6個NAC基因(GhNAC1-6)。實時熒光定量PCR檢測干旱脅迫下不同油菜素內(nèi)酯浸種后，棉花種子萌發(fā)期子葉和胚根NAC基因的表達變化。【結(jié)果】棉花子葉中的GhNAC1在干旱脅迫下受不同濃度油菜素內(nèi)酯的抑制，GhNAC2和GhNAC3受0.25 mg/L油菜素內(nèi)酯誘導表達，GhNAC5只受0.5 mg/L油菜素內(nèi)酯誘導表達,而GhNAC4和GhNAC6表達無顯著變化。在棉花胚根中，GhNAC1同樣受不同濃度油菜素內(nèi)酯的抑制，GhNAC2和GhNAC3受0.25 mg/L油菜素內(nèi)酯誘導，同時GhNAC3在2 mg/L油菜素內(nèi)酯浸種也呈現(xiàn)高表達，GhNAC5無顯著變化，GhNAC4和GhNAC6則受高濃度油菜素內(nèi)酯誘導表達。【結(jié)論】棉花種子萌發(fā)期在干旱脅迫下，棉花種子萌發(fā)期子葉和胚根的GhNAC1的表達受油菜素內(nèi)酯抑制，GhNAC2和GhNAC3受低濃度油菜素內(nèi)酯的表達誘導，油菜素內(nèi)酯能夠影響GhNAC的表達響應干旱脅迫。

棉花；種子萌發(fā)；干旱脅迫；油菜素內(nèi)酯；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因表達

0 引 言

【研究意義】干旱導致農(nóng)作物大量減產(chǎn)、甚至絕收。油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)又名蕓苔素內(nèi)酯，具有提高作物抗旱的能力[1]。轉(zhuǎn)錄因子能與基因的順式作用元件結(jié)合，進而調(diào)控基因的表達，在植物信號傳導和基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用[2]。探討響應干旱的轉(zhuǎn)錄因子在油菜素內(nèi)酯浸種下的表達變化，有助于為農(nóng)作物生產(chǎn)中噴施BR增強農(nóng)作物的抗旱能力提供理論基礎。【前人研究進展】NAC轉(zhuǎn)錄因子典型的結(jié)構(gòu)特征是N端存在一個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C端是變化多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族。目前報道的水稻(Oryzasativa)基因組中有151個NAC基因，擬南芥有117個[3]、煙草 (Nicotianatabacum)和大豆 (Glycinemax) 中各有152 個成員[4-5]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物響應干旱的轉(zhuǎn)錄因子，例如，水稻SNAC1 受高鹽、干旱、低溫和 ABA 處理誘導表達，同時也在保衛(wèi)細胞中受干旱特異誘導表達[6]。Meng等[7]克隆了6個陸地棉中新型基因GhNAC1-6，檢測這6個基因是否受干旱誘導，結(jié)果表明，只有GhNAC4、GhNAC5和GhNAC6受干旱誘導表達，GhNAC1和GhNAC3不受干旱誘導，GhNAC2受干旱誘導表達量較低。芒草MlNAC5在轉(zhuǎn)基因的擬南芥中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)應激反應的相關基因，明顯增強植物的抗旱及抗低溫能力[8]。【本研究切入點】 由于針對新疆陸地棉新陸早17號在干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯對棉花抗旱能力影響的研究較少。研究選取新疆陸地棉品種新陸早17號，探討干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯浸種是否能夠影響棉花的NAC表達，進而改變棉花萌發(fā)期的抗旱能力。【擬解決的關鍵問題】 克隆獲得新疆陸地棉品種新陸早17號的6個NAC基因，利用PEG6000模擬干旱脅迫并利用不同濃度的BR(24-EBR)對棉花種子進行浸種后，通過實時熒光定量PCR檢測干旱脅迫下不同油菜素內(nèi)酯浸種后，棉花子葉和胚根NAC基因的表達變化，為闡明干旱脅迫和BR處理影響轉(zhuǎn)錄因子表達調(diào)節(jié)植物耐旱的機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

新疆陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種新陸早17號種子由新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所瑪納斯實驗站提供。24-表油菜素內(nèi)酯(24-EBR)購自sigma公司，純度>90%，先用一定量無水乙醇使24-EBR完全溶解，以備稀釋至不同的濃度使用。SYBR Green購自QIAGEN公司，PEG6000為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

挑選棉花籽粒飽滿大小一致的種子，先用75%酒精浸泡1 min，蒸餾水沖洗3～4次，用15%H202浸泡5 h，蒸餾水沖洗3～4次，分別浸泡于蒸餾水和0.01、0.25、0.5、1和2 mg/L 24-EBR中24 h。在直徑10 cm方形培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2層濾紙，用19.7%PEG6000潤濕，以傾斜時皿底無溶液為標準。將種子從不同浸種液中取出，剝掉種皮，播種于上述濾紙上，每隔2 d添加一次PEG6000，以保持種子始終在模擬干旱脅迫狀態(tài)下生長。一周后，分別采棉花的胚根和子葉，迅速凍于液氮中備用。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取0.1 g棉花胚根/子葉在用液氮降溫后的研缽中充分研磨，采用Omega公司Plant RNA Kit提取棉花總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和定量來檢測所提取RNA質(zhì)量。采用Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit(大連-TaKaRa公司)試劑盒合成cDNA。

1.2.3 干旱脅迫下BR浸種后棉花NAC的表達

根據(jù)每個轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列設計上下游引物，以棉花延伸因子EF1α為內(nèi)參，檢測各轉(zhuǎn)錄因子的表達。qRT-PCR反應體系為：cDNA 1 μL,上下游引物各0.3 μL,ROX 0.1 μL,SYBR Green 10 μL,用Rnase-free water補至20 μL。反應過程為94℃ 30 s, 94℃ 5 min, 62℃ 30 s, 72℃ 30 s, 重復40個循環(huán)。采用ABI 7500實時定量PCR儀，數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)在Microsoft Excel 2003中整理，用Graph Pad Prism 5.0做圖及不同濃度間的單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子的克隆與qRT-PCR引物設計

根據(jù)陸地棉NAC轉(zhuǎn)錄因子基因序列克隆獲得新疆陸地棉品種新陸早17號中NAC相應的同源序列，分別命名為GhNAC1，GhNAC2，GhNAC3，GhNAC4，GhNAC5和GhNAC6，根據(jù)BLAST到的序列分別設計全長序列引物，以新疆陸地棉品種新陸早17號子葉的cDNA為模板，PCR擴增后，送測PCR產(chǎn)物，與已知序列進行比對，比對一致后，設計qRT-PCR引物。表1，圖1

2.2GhNAC1-6氨基酸序列比對及構(gòu)建GhNAC1-6系統(tǒng)發(fā)育進化樹

用DNAMAN分析GhNAC1-6氨基酸序列的一致性，分析得GhNAC1-6氨基酸序列一致性為50.41%。根據(jù)多序列比對可以看出，在GhNAC1-6 N端保守性較強，高度保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域大約由150個氨基酸殘基組成，可進一步劃分為A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域。由多序列比對結(jié)果可知GhNAC1-6是典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，即N端高度保守，C端高度多樣性。

利用MEGA5.0對GhNAC1-6和其他已知功能的NAC構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，以預測GhNAC1-6的功能。由系統(tǒng)發(fā)生樹可知，GhNAC2和GhNAC3與ATAF1親緣關系較近，GhNAC1與CsNAC親緣關系最近，GhNAC4與RD26親緣關系最近，GhNAC5與NAP親緣關系最近，GhNAC6與CUC1親緣關系最近。圖2

表1 各基因全長引物及熒光定量引物

Table 1 Primer pairs used in gene cloning, semi-quantitative and real-time quantitative RT-PCR

基因Genes全長基因引物(5＇-3＇)Primersofwholelengthgenesequences熒光定量引物(5＇-3＇)PrimersofqRTPCRGhNAC1ForwardAGAATGAAGGCAGAGTTAGAGCCAATGTTGATAGGTCCReverseGCTTAAAATGTCTTGGGTAGTTCACTTCTTTCTCCCACGhNAC2ForwardATGACAGCATCGGAGTTACGAGAAACAGCCACCGCAAGGReverseTTCCCCGTCTAAAATGGCCTGGAAATGGGCAGGAAACGhNAC3ForwardATGACTGCAACGGAGTTACGTAAATGTGCGTCTCAGTCTATReverseCGGTACACTCATGGACTTTGGTCCACGTCGGCTAATCGhNAC4ForwardTAGAATCATGGGAGTGCCCTGGTCCTTCTACCTATACTTTReverseGTTCAACACATTCGAGTTTTGAGTCTTTGGTGGGCTTAGhNAC5ForwardTATATGAACATGAAGCATCCCCAGGGTTTAGGTTCCACReverseTTTTATCCCTGGAACTGAGTTGCTGCTCCTATTGCTGhNAC6ForwardGATCGAGTTTTCCCATGCCTGACAAAGCCAAGATGReverseTCAAGTTTCAGTAGTTCCACCTACAAACAACCCATTCAGhEF1αForwardAGACCACCAAGTACTACTGCACReverseCCACCAATCTTGTACACATCC

圖1 GhNAC1-6的氨基酸序列比對

Fig.1 The result of GhNAC1-6 amino acid sequence alignment

圖2 GhNAC1-6與其他植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.2 GhNAC1-6 phylogenetic tree with other NAC transcription factors

2.3干旱脅迫下BR浸種后棉花子葉NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達

通過檢測不同濃度BR浸種后干旱脅迫下NAC轉(zhuǎn)錄因子在棉花子葉中的表達，研究表明，在棉花子葉中，GhNAC1-3在19.7%PEG脅迫下表達量較低，GhNAC4-6在19.7%PEG脅迫下表達量較高，其中，GhNAC1在子葉中的表達隨著BR浸種濃度的增大，表達量逐漸減少，在1和2 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，BR浸種會抑制GhNAC1在子葉中的表達，且BR濃度越大，抑制越明顯。GhNAC2和GhNAC3在子葉中的表達隨著BR浸種濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，GhNAC2在0.25和0.5 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，GhNAC3在0.25和2 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，GhNAC2和GhNAC3在干旱脅迫下子葉中的表達受BR誘導，低濃度BR(0.01～0.25 mg/L)可促進GhNAC2和GhNAC3的表達，濃度增大至1 mg/L時則有抑制作用。GhNAC5的表達在BR浸種濃度為0.5 mg/L時在子葉中與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，GhNAC5在BR浸種濃度為0.5 mg/L時受到誘導，在其他濃度浸種誘導較小。GhNAC4和GhNAC6在子葉中的表達隨著BR濃度增大無顯著變化，說明GhNAC4和GhNAC6在干旱脅迫下的棉花子葉中不受BR誘導。

2.3干旱脅迫下BR浸種后棉花胚根NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達

通過檢測不同濃度BR浸種后干旱脅迫下NAC轉(zhuǎn)錄因子在棉花胚根中的表達，研究表明，在胚根中，19.7%PEG脅迫下NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達與子葉中基本一致，其中，GhNAC1在胚根中的表達與在子葉中的表達趨勢相似，隨著BR浸種濃度增大，表達逐漸減少，在1和2 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，BR浸種會抑制GhNAC1的表達，且BR濃度越大，抑制越明顯。GhNAC2在胚根中的表達與子葉中的相比，表達趨勢更明顯，在0.25、0.5和1 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著的上調(diào)(P<0.01)，在2 mg/L BR浸種時與對照組相比有極顯著的下調(diào)(P<0.01)，說明GhNAC2在胚根中受到BR的強烈誘導。GhNAC3在胚根中的表達與在子葉中的趨勢相同，在1 mg/L BR浸種時達到最大值，與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)。GhNAC4在胚根中BR浸種濃度較大時(2 mg/L)與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，GhNAC6在胚根中BR浸種濃度較大時(1 mg/L)與對照組相比有差異(P<0.1)，GhNAC5在胚根中的表達則隨著BR浸種濃度的增大無顯著差異變化。圖4

注：***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05,下同

Note：***indicateP<0.001,**indicateP<0.01,*indicateP<0.05,the same as below

圖3 干旱脅迫下不同濃度BR處理NAC轉(zhuǎn)錄因子在棉花萌發(fā)期子葉中的表達變化

Fig.3 The expression of NAC transcription factors in cotton cotyledon during germination treated with different concentrations of BR under drought stress

注：***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05

Note： ***indicateP<0.001,**indicateP<0.01,*indicateP<0.05

圖4 干旱脅迫下不同濃度BR處理NAC轉(zhuǎn)錄因子在棉花萌發(fā)期胚根中的表達變化

Fig.4 The expression of NAC transcription factors in cotton radicles during germination treated with different concentrations of BR under drought stress

3 討 論

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的且較大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物的多個生長發(fā)育和逆境脅迫應答[9]。NAC家族已經(jīng)成為目前基因功能及表達調(diào)控的熱點[10-11]。研究克隆了新疆陸地棉品種新陸早17號中NAC1-6，通過對6個基因氨基酸序列的生物信息學分析及檢測用BR浸種后干旱脅迫下6個基因在棉花子葉和胚根中的表達量，為鑒定其功能提供理論基礎。

通過對GhNAC1-6進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)GhNAC1-6都具有典型的NAC結(jié)構(gòu)域，即N端高度保守和C端高度多樣性，且C端富含酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸時一般具有轉(zhuǎn)錄激活功能[12-14]。通過將GhNAC1-6與已報道的非生物逆境脅迫的蛋白[15]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，預測GhNAC1-6的功能，發(fā)現(xiàn)GhNAC2和GhNAC3與ATAF1親緣關系較近，可能具有響應干旱和ABA脅迫的功能；GhNAC1與CsNAC親緣關系最近，可能有響應機械損傷、缺氧、低溫和乙烯脅迫的能力；GhNAC4與RD26親緣關系最近，可能有響應干旱、鹽和ABA脅迫的作用；GhNAC5與NAP親緣關系最近，可能與植株衰老相關；GhNAC6與CUC1親緣關系最近，可能有花器官發(fā)育方面的功能。

油菜素內(nèi)酯(BR)是一種新型植物激素 ,在植物體內(nèi)含量極低,但生理活性卻極高 ,植物經(jīng)極低濃度處理便能表現(xiàn)出明顯的生理效應。 許多研究證明,BR具有改善植物生理代謝 ,提高品質(zhì)和產(chǎn)量的作用 ,并能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的許多過程[16-20]，在生產(chǎn)中有極為廣泛的作用。植物激素在協(xié)調(diào)植物生長、發(fā)育和抗逆應答中具有重要作用，其作用機制和信號傳遞過程各異，但最終都是通過引起特定基因表達水平的改變，來調(diào)控特定的生物學過程。

植物激素作用的強弱與其濃度關系不大，植物細胞對激素的敏感程度才是激素作用的控制因素[21]。研究中，不同濃度油菜素內(nèi)酯浸種后干旱脅迫下各NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達不完全相同，結(jié)合之前的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)GhNAC2和GhNAC3基因的變化趨勢基本相同，在0.25 mg/L BR浸種后PEG干旱脅迫下棉花子葉中GhNAC2和GhNAC3基因的表達與對照組相比表達明顯升高，分別是對照組的1.75和1.59倍，表明GhNAC2和GhNAC3基因在干旱脅迫下受到低濃度BR誘導，高濃度BR則對其產(chǎn)生抑制，這一變化規(guī)律與之前相同條件下測的生理指標[22]中的保護酶含量(POD、CAT、SOD)變化趨勢相同，表明GhNAC2和GhNAC3基因可能通過調(diào)節(jié)棉花中酶的含量增強棉花抗旱性。而GhNAC1基因的表達隨BR浸種濃度增大而降低，GhNAC1在1 mg/L和2 mg/L BR浸種后，在子葉和胚根中，與對照組相比，表達量顯著下調(diào)，在胚根中，分別下調(diào)了2.27和7.69倍；在子葉中，分別下調(diào)了3.22和5.55倍。說明GhNAC1基因在干旱脅迫下的表達可能受BR抑制，這一結(jié)果與生物信息學分析結(jié)果相同。GhNAC4和GhNAC6基因在胚根中表達類似，都在BR濃度較高時表達有顯著上升，GhNAC4在2 mg/L BR浸種時，與對照組相比，表達量升高7.34倍，GhNAC9在1 mg/L BR浸種時，與對照組相比，表達量升高28.85倍，而造成這樣的原因可能是因為采樣造成的誤差。

4 結(jié) 論

通過對陸地棉GhNAC1-6的生物信息學分析及分析BR浸種后干旱脅迫下GhNAC1-6基因的表達，結(jié)果表明在GhNAC1-6中，GhNAC2-3在0.25 mg/L油菜素內(nèi)酯處理后PEG脅迫下表達量是對照組的1.5倍左右，有較大可能在干旱脅迫下棉花萌發(fā)期受BR誘導參與棉花抗旱，油菜素內(nèi)酯能夠影響GhNAC的表達響應干旱脅迫。對新疆陸地棉GhNAC1-6的克隆和表達分析的探討，將為研究干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯影響NAC的表達進而調(diào)控棉花的抗旱機制奠定理論基礎，也為油菜素內(nèi)酯在提高棉花抗旱大田的應用提供指導。

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InfluencesofBrassinolideunderDroughtStressontheExpressionsofNACTranscriptionFactorsinGerminationStageofCottonSeeds

YAN Xiao-hong, BAO Qiu-juan, ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

【Objective】 In order to investigate the expression of NAC transcription factors during seed germination of cotton(Gossypiumhirsutum)under drought stress and to analyze the function of NAC transcription factors in the pathway of brassinolide (BR) regulation for drought resistance in cotton. 【Method】The gene sequences of upland cotton NAC transcription factor family were used to amplify the 6 genes ofGhNACfrom cotton Xinluzao17. Quantitative RT-PCR was used to detect the change ofNACgene expression in cotyledon and radicle of cotton seeds at germination stage after seed soaked with different concentrations of brassinolide under drought stress. 【Result】In cotton cotyledons，the expressions ofGhNAC1under drought stress were suppressed by different concentrations of brassinolide, the expressions ofGhNAC2 andGhNAC3 were induced by 0.25 mg/L brassinolide. The expressions ofGhNAC5 were only induced by 0.5 mg/L brassinolide, and the expressions ofGhNAC4 andGhNAC6 did not change significantly. However, in cotton radicle, the expressions ofGhNAC1 were also inhibited by different concentrations of brassinolide, the expressions ofGhNAC2 andGhNAC3 were induced by 0.25 mg/L brassinolide. At same time, high expressions ofGhNAC3 were induced by 2 mg/L brassinolide, the expressions ofGhNAC5 did not change significantly, the expressions ofGhNAC4 andGhNAC6 were induced by the high concentration of brassinosteroids. 【Conclusion】The expressions ofGhNAC1 in cotton cotyledons and radicles during seed germination were inhibited by brassinolide, and the expressions ofGhNAC2 andGhNAC3 was induced by low concentration of brassinolide. The results showed that brassinolide could affect the expression ofGhNACin response to drought stress.

short ultivars; growth stages; major gene plus polygene inheritance; genetic analysis

ZHANG Fu-chun(1962-)，male,native place: Urumqi,Xinjiang. Professor, research field:Molecular biology. (E-mail)zfcxju@xju.edu.cn

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.005

2017-05-10

國家自然科學基金-新疆聯(lián)合基金重點項目“棉花水分高效利用的關鍵基因的挖掘及抗旱種質(zhì)材料的創(chuàng)制”(U1303282)

嚴曉紅(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學，(E-mail)527863765 @qq.com

張富春(1962-)，男，教授，博士，研究方向為分子生物學，(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn

S565.4

：A

：1001-4330(2017)08-1414-08

Supported by: Joint key fund of National Natural Science Foundation of China and Xinjiang "Exploring key genes related to high-efficiency water utilizationand creating of drought resistant materials in cotton"(U1303282)