利用孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測定水樣中微量磷酸鹽

朱靖蓉,溫云杰,宋書會 ,馬 磊,張金堯 ,汪 洪

(1.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,烏魯木齊 新疆830091;2.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術國家工程實驗室/農業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室 北京100081)

利用孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測定水樣中微量磷酸鹽

朱靖蓉1,溫云杰2,宋書會2,馬 磊1,張金堯2,汪 洪1

(1.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,烏魯木齊 新疆830091;2.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術國家工程實驗室/農業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室 北京100081)

【目的】磷鉬藍分光光度法是水中磷酸鹽含量的常用檢測方法，但不適用于磷酸鹽含量低(<0.04 mg/L)的水樣。建立一種更準確的水中微量磷酸鹽檢測方法。【方法】對孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法中最大吸收波長、顯色劑中孔雀綠和濃硫酸的比例與用量、表面活性劑聚乙烯醇(PVA)用量、顯色穩(wěn)定時間等指標依次優(yōu)化，選擇1個湖水樣品和系列低濃度磷標準溶液，用優(yōu)化后的測定方法進行方法回收率、精密度和檢出限研究。【結果】優(yōu)化后的關鍵點是最大吸收波長620 nm，顯色劑配制比例鉬酸銨溶液(176.5 g/L)/孔雀綠溶液(11.2 g/L)/濃硫酸=40/32/34(體積比)，顯色體積中顯色劑比例占8%，顯色穩(wěn)定時間30 min，方法檢出限為1.2 g/L，磷(P)濃度小于10.00μg/L時相對標準偏差RSD 8.3%～9.1%，P濃度大于10.00μg/L時RSD小于5%，加標回收率在97.0 %～108.2 %。【結論】優(yōu)化后的孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法檢測限低，靈敏度高，線性范圍寬，顯色溶液穩(wěn)定，準確度、精密度符合水質測定需求，操作簡便，適合環(huán)境中水體微量磷酸鹽含量的檢測。

孔雀綠；分光光度法； 磷酸鹽； 水

0 引 言

【研究意義】人類活動和自然因素導致磷素進入湖泊、水庫造成水體富營養(yǎng)化已經是一個嚴重的環(huán)境問題[1-3]。磷酸鹽被認為是水生植物過量生長的關鍵因素之一，水中磷酸鹽的含量是評價水質的重要指標[4]。磷鉬藍分光光度法是目前水樣中磷酸鹽含量測定的常用方法，但該法絡合物穩(wěn)定時間短，檢測限高，靈敏度低，不適于水樣中微量磷的測定。《地表水環(huán)境質量標準》(GB 3838-2002)規(guī)定我國III類水的水體中總P濃度臨界指標是0.2 mg/L，湖泊和水庫中總P濃度臨界指標是0.05 mg/L。因此研究水中微量磷酸鹽含量(低于0.04 mg/L)的檢測方法，是評價水質、對水體污染進行早期預警的關鍵[4]。【前人研究進展】水中磷酸鹽含量的分析方法有分光光度法、重量法等化學方法，離子色譜、ICP-AES、電極電位等儀器分析方法也在快速普及[5-8]。分光光度法是經典測定方法，在水樣中磷酸鹽含量分析時仍起著不可替代的作用。其中的磷鉬藍分光光度法是目前水樣中磷酸鹽含量測定的常用方法，其中《水質總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》(GB 11893-89)[9]此標準適用于地面水、污水和工業(yè)廢水，最低檢出濃度為0.01 mg/L，測定上限為0.6 mg/L。《水質 磷酸鹽和總磷的測定 連續(xù)流動-鉬酸銨分光光度法》(HJ 670-2013)[10]當檢測光程為50 mm時，方法檢出限(以P計)為0.01 mg/L，測定范圍為0.04～1.0 mg/L。這個方法測定磷的含量范圍能滿足判定水質是否符合《地表水環(huán)境質量標準》(GB 3838-2002)規(guī)定的我國III類水的水體中總P濃度臨界指標0.2 mg/L、湖泊和水庫中總P濃度臨界指標0.05 mg/L。但磷鉬藍分光光度法測定磷酸鹽的缺點是靈敏度不夠高，對于水中微量磷(低于0.04 mg/L)的檢測難以應用[6,7,11-13]，這對于研究水體中磷的積累過程、進行早期預警是不利的。【本研究切入點】孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法的原理是在酸性條件下，堿性染料孔雀綠與磷鉬雜多酸生成綠色離子締合物，同時以聚乙烯醇穩(wěn)定顯色液，直接用分光光度計測定。它可用于水中低含量濃度范圍磷的檢測，但顯色劑的配制方法和用量、孔雀綠的溶解過程、表面活性劑用量和最大吸光度波長等關鍵內容尚無明確結論[14-18]。研究建立一種更準確的水中微量磷酸鹽檢測方法。【擬解決的關鍵問題】研究孔雀綠磷鉬雜多酸分光光度法中關鍵環(huán)節(jié)技術條件變化對水中微量磷測定值的影響，評價其準確度和精密度，建立一種水中微量磷酸鹽檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

濃硫酸、鉬酸銨、孔雀綠、聚乙烯醇(PVA)、 磷酸二氫鉀均為分析純。水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計(島津 UV-2700)、精密分析天平(精確至0.1 mg)、超純水系統(tǒng)(阻抗18.02MΩ·cm)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液配制

鉬酸銨溶液(濃度176.5 g/L)：溶解176.500 g鉬酸銨于水中，稀釋定容至1 000 mL；孔雀綠溶液(濃度11.2 g/L)：加熱溶解5.600 g 孔雀綠于水中，稀釋定容至500 mL；1%聚乙烯醇(PVA)溶液：加熱溶解10.000 g PVA于水中，冷卻，稀釋定容至1 000 mL，經濾紙過濾備用；鉬酸銨:濃硫酸:孔雀綠=40:32:34(體積比/mL)顯色劑：濃硫酸和孔雀綠溶液依次緩慢加入鉬酸銨溶液中，混勻后冷卻，經濾紙過濾備用，避光貯藏；100 mg/L磷標準儲備溶液：溶解 0.219 7 g磷酸二氫鉀(105℃下烘干2 h)于水中，定容至500 mL，臨用前稀釋至所需濃度。

1.2.2 優(yōu) 化

準確吸取1.0 mg/L磷標準使用液1.0、1.5、2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入2.00 mL顯色劑及1.00 mL 1% PVA溶液，搖勻，用水定容，室溫放置30 min，在400 ～700 nm波長處掃描測定吸光度，得到最大吸收波長。選擇特征波長620 nm，依次對顯色劑比例與用量、表面活性劑PVA用量，顯色穩(wěn)定時間等指標優(yōu)化。選擇1湖水樣品和系列低濃度磷標準溶液，用優(yōu)化后的測定方法進行方法回收率、精密度、檢出限等。

1.2.3 標準曲線

用1.0 mg/L磷標準溶液配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L磷標準梯度溶液，按1.2的條件測定，以空白溶液為參比，于620 nm波長處測吸光度。以磷含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線并計算回歸方程。標準曲線方程為Y=3.485 9X-0.007 96(R2=0.999 1)。

1.3 數據處理

每個樣品平行測定6次，樣品中磷含量用P元素的質量分數表示。6次測量值pi的算術平均值為樣品中磷的估計值，即測量結果，并計算相對標準偏差(RSD)。

2 結果與分析

2.1 吸收波長與吸光度關系

在0.04、0.06和0.08 mg/L的標準磷溶液中，加入按文獻[15-18]常用比例配制的顯色劑(鉬酸銨/孔雀綠/濃硫酸=40/35/35，體積比)2.00 mL，在400～700 nm波長內，分別掃描溶液的吸光度，吸光度均在620 nm處達到最大，因此實驗測定波長選擇620 nm。雖然有研究發(fā)現綠色締合物與空白的吸光度差值在580 ～680 nm較大，在660 nm處最大[17]。圖1

圖1 孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測定不同磷濃度標準溶液的吸收光譜

Fig.1 The MG colorimetric method of determinate absorption spectra of different phosphorus concentrations

2. 2 顯色劑配比對吸光度的影響

孔雀綠用量和溶液酸度對孔雀綠磷鉬雜多酸顯色反應影響較大，在已有文獻中顯色劑配制比例均有差異[15-18]。試驗中設計了由不同比例孔雀綠和硫酸配制的顯色劑，通過比較吸光度選擇合適的孔雀綠與硫酸用量。

以40 mL鉬酸銨溶液和32 mL孔雀綠溶液為基液，再添加不同體積硫酸溶液，配制成不同酸度的顯色劑，分別吸取2.00 mL加入到0.1 mg/L磷標準溶液中，按1.2步驟，在620 nm波長處測定吸光度。研究表明，當硫酸用量為32～36 mL時，顯色反應吸光值較大，也較穩(wěn)定。

以40 mL鉬酸銨溶液和34 mL濃硫酸為基液，加入不同體積孔雀綠溶液，配制成顏色不同深度的顯色劑，加入0.1 mg/L磷標準溶液中，按1.2步驟，在620 nm波長處測定吸光值。加入的孔雀綠溶液為34 mL時吸光值最高，加入量在32～38 mL之間吸光值并無顯著變化。圖2

確定顯色劑配比為：鉬酸銨溶液(176.5 g/L)/孔雀綠溶液(11.2 g/L)/濃硫酸=40/36/34(體積比)。

圖2 不同硫酸和孔雀綠用量的顯色劑下相同濃度磷溶液吸光度

Fig. 2 The absorbance of different amount of sulfuric acid and malachite green

2. 3 顯色劑用量的確定

在0.1 mg/L的磷標準溶液中，分別加入按2.2方法配制的顯色劑1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL，及1 mL PVA試劑，定容至25 mL。在620 nm測定吸光度分別是0.268、0.309、0.345、0.344、0.335、0.315。顯色劑用量2和2.5 mL時吸光度最大，最終確定顯色劑用量為2 mL，即顯色體積中顯色劑比例占8%。

2.4 聚乙烯醇(PVA)用量對吸光度的影響

PVA是表面活性劑，作用就是作為增敏劑與增溶劑，通過疏水作用，在酸性條件下磷鉬雜多酸與孔雀綠發(fā)生化學反應時，使孔雀綠分子與磷鉬雜多酸更好的結合，生成穩(wěn)定的綠色離子締合物。在5 mL的0.1 mg/L的磷標準溶液中，加入2 mL按2.2方法配制的顯色液，分別加入0.5、1、1.5、2、2.5 mL的PVA試劑，定容至25 mL，測定吸光度分別為0.311、0.342、0.335、0.339、0.340。表明PVA用量對吸光度影響不大。

2. 5 顯色時間與磷酸締合反應的關系

在各5 ml的0.10、0.20 mg/L的磷標準溶液中，加入2.0 mL按2.2方法配制的顯色劑和1 mL PVA溶液，定容至25 mL后，在顯色10 min到12 h之間的9個顯色時間后，在620 nm迅速測定吸光度。發(fā)現在顯色30 min后，兩個濃度磷溶液的吸光度達到最大，隨著顯色時間增長吸光度再沒有明顯增大。說明30 min后磷酸締合反應基本完成，并且磷酸締合物穩(wěn)定時間較長，至少可達12 h。圖3

圖3 不同顯色時間的磷溶液吸光度

Fig. 3 Theabsorbance of different color-developing time

2. 6 方法準確度、精密度和檢出限

采用優(yōu)化后的測定方法，即分別在湖水樣、5.0、10.0、60.0、100 μg/L磷標準液，以及湖水樣+10.00、湖水樣+20.00、湖水樣+60.00 μg /L磷標準液中，加入2 .0 mL顯色劑和1.0 mL PVA溶液，顯色30 min，在620 nm波長處測定吸光值。結果表明，無論是磷標準溶液，還是加入磷標準液的湖水樣，所測的回收率均在97.0 %～108.2 %之間。溶液磷濃度小于10 μg /L時，測定值的相對標準偏差RSD在8.3%～9.1%；大于10 μg/L時RSD則小于5 %。顯然方法的準確度、精密度符合水質監(jiān)測需求。表1

3 討 論

表1 優(yōu)化方法測定的相對標準偏差和回收率(n=6)

Table. 1 The relative standard deviation and recovery rate of the optimized test method(n=6)

處理TreatmentsP平均值(μg/L)MeasuredPvalue相對標準偏差RSD(%)回收率(%)Recoveryrate湖水樣24．5±1．87．4/湖水+10．00μg/LP標準溶液35．1±1．54．3106．0湖水+20．00μg/LP標準溶液43．9±1．22．797．0湖水+60．00μg/LP標準溶液85．4±1．11．3101．55．00μg/LP標準溶液5．50±0．59．1108．2%10．00μg/LP標準溶液10．80±0．98．3108．1%60．00μg/LP標準溶液59．3±2．13．598．8%100．00μg/LP標準溶液101．1±2．12．1101．1%

注：測定值為平均值±標準方差(n=6)

按照國際應用化學聯(lián)合會(IUPAC)檢出限測定方法[19,20]，用空白試劑進行了12次重復測定，試劑空白平均值3.2 μg/L，標準方差(SD)為0.0004，檢出限MLD=3×SD=1.2 μg/L。這個檢出限遠小于《水質 磷酸鹽和總磷的測定 連續(xù)流動-鉬酸銨分光光度法》標準(HJ 670-2013)[13]和《水質總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》標準(GB 11893-89)[12]的檢出限0.01 mg/L(10 μg/L)，也小于《水質磷酸鹽的測定 離子色譜法》標準(HJ 669-2013)[8]的檢出限7μg/L。

4 結 論

對孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法關鍵技術條件優(yōu)化后，檢出限低至1.2 μg/L，靈敏度高，線性范圍寬，顯色溶液穩(wěn)定時間長，準確度、精密度符合水質監(jiān)測需求，操作簡便，可用于水中微量磷酸鹽含量的測定；優(yōu)化后的關鍵條件是：顯色劑按鉬酸銨(176.5 g/L)/孔雀綠(11.2 g/L)/ 濃硫酸=40/32/34(體積比)配制，顯色劑用量2.0 mL，1%聚乙烯醇(PVA)溶液1.0 mL，顯色30 min，在620 nm波長處測定吸光度。

References)

[1] Serediak, N. A., Prepas, E. E., & Putz, G. J. (2014). 11.8-eutrophication of freshwater systems.TreatiseonGeochemistry, 305-323.

[2]Meinikmann, K., Hupfer, M., & Lewandowski, J. (2015). Phosphorus in groundwater discharge - a potential source for lake eutrophication.JournalofHydrology, 524, 214-226.

[3]Mcdowell, R. W., Cox, N., Daughney, C. J., Wheeler, D., & Moreau, M. (2015). A national assessment of the potential linkage between soil, and surface and groundwater concentrations of phosphorus.JawraJournaloftheAmericanWaterResourcesAssociation, 51(4), 992-1002.

[4]GB 3838-2002 .地表水環(huán)境質量標準[S].

GB 3838-2002.SurfaceWaterEnvironmentalQualityStandard[S]. (in Chinese)

[5]Islam, S., Reza, M. N., Jeong, J. T., & Lee, K. H. (2016). Sensing technology for rapid detection of phosphorus in water: a review. , 41(2), 138-144.

[6]Worsfold, P. J., Gimbert, L. J., Mankasingh, U., Omaka, O. N., Hanrahan, G., & Gardolinski, P. C., et al. (2005). Sampling, sample treatment and quality assurance issues for the determination of phosphorus species in natural waters and soils.Talanta, 66(2), 273-293.

[7]Worsfold, P., Mckelvie, I., & Monbet, P. (2016). Determination of phosphorus in natural waters: a historical review.AnalyticaChimicaActa,918, 8-20.

[8]水質磷酸鹽的測定 離子色譜法[S].

DeterminationofwaterqualityPhosphateIonChromatography[S.](in Chinese)

[9]GB 11893-89. 水質 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法[S].

GB 11893-89.SpectrophotometricDeterminationoftotalPhosphorusinammoniummolybdate[S].(in Chinese)

[10]水質 磷酸鹽和總磷的測定 連續(xù)流動-鉬酸銨分光光度法[S].

Waterquality-DeterminationofPhosphateandtotalphosphorusContinuousflowanalysis(CFA)andAmmoniummolybdatespectrophotometry[S].(in Chinese)

[11]Murphy, J. and J. P. Riley. (1962). A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters.AnalyticaChimicaActa. 27 31-36.aterandwastewatermonitoringandanalysismethods(fourth edition) [M]. Beijing: .

[12]Broberg, O., & Pettersson, K. (1988). Analytical determination of orthophosphate in water.Hydrobiologia, 170(1), 45-59.

[13]中華人民共和國環(huán)境保護部. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]第4版. 中國環(huán)境科學出版社, 2002.

Ministry of Envioronmental Protection of the People's repuiblic of China. (2002).Waterandwastewatermonitoringandanalysismethods[M]. the fourth edition. Beijing: China Environmental Science Press.(in Chinese)

[14]梁英. 海水中超痕量活性磷的檢測方法研究[D]. 廈門大學, 2006.

Ying.(2006).Studyonthedetectionmethodofsupertraceactivatedphosphorusinseawater[D].Xiamen University.(in Chinese)

[15]Van Veldhoven, P. P., & Mannaerts, G. P. (1987). Inorganic and organic phosphate measurements in the nanomolar range. Analytical Biochemistry, 161(1), 45-48.

[16]Hashitani, H., & Okumura, M. (1987). A simple visual method for the determination of phosphorus in environmental waters. Fresenius Zeitschrift Für Analytische Chemie, 328(3), 251-254.

[17]李星，聶學峰，楊艷玲，等. 孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法檢測水中痕量磷[J]. 哈爾濱商業(yè)大學學報( 自然科學報)，2005，21(5)：6-7.

LIXing,NIEXue-feng,YANGYan-ling.(2005) Spectrophotometric determination of trace phosphorus in water by malachite green - phosphomolybdic heteropolyacid, [JJournalofHarbinUniversityofCommerceNatural Science 21(5):6-7. (in Chinese)

[18]楊艷玲，李星，孫麗欣. (2007). 飲用水中痕量磷的檢測[J]. 哈爾濱工業(yè)大學學報，39(2):322-325.

YANGYan-lin,LIXing,SUNLi-xin (2007) Detection of trace phosphorus in drinking waterJournalofHarbinInstituteofTechnology, 39(2):322-325. (in Chinese)

[19]Currie L A. (1995).Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities (IUPAC Recommendations 1995)PureandAppliedChemistry, 67(10)1699-1723.

[20]Mocak J, Bond A M, Mitchell S and Scollary G. (1997). A statistical overview of standard (IUPAC and ACS) and new procedures for determining the limits of detection and quantification: application to voltammetric and stripping techniques (technical report)PureAppliedChemistry, 69(2)297-328.

Determinationofphosphateinwaterbythecomplexesofmalachitegreen-phosphomolybdatespectphotometry

Zhu Jing-rong1,Wen Yun-jie2,Song Shu-hui2, Ma Lei1, Zhang Jin-yao2, Wang Hong2

(1.InstituteofQualityStandards&TestingTechnologyforAgro-products,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China;2.NationalEngineeringLaboratoryforImprovingQualityofArableLand/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer，MinistryofAgriculture/InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081，China)

【Objective】 Phosphorus molybdenum blue spectrophotometry is a commonly used method for the determination of phosphate in water, but it is not suitable for low concentration (<0.04 mg / L). This paper attempts to establish a more accurate method for the determination of trace phosphate in water. 【Method】 The maximum absorption wave length, the ratio and amount of malachite green and concentrated sulfuric acid in the colorant, the amount of PVA, the color stability time and so on were optimized in the range of the maximum absorption wave length of the malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometry. The recovery rate, precision and detection limit of the optimized method were studied using a lake sample and a series of low concentrations of phosphorus standard solution.【Results】 The maximum absorption wavelength was 620 nm, the volume ratio of ammonium molybdate(176.5 g/L)/sulfuric acid(11.2 g/L)/malachite green was 40/32/34 in chromogenic agent. The proportion of color reagent in color development accounted for 8%, PVA 4%. Color stability time was up to 12 h. The detection limit was 1.2 μg/L, the relative standard deviation RSD was in the range of 8.3% -9.1% when the phosphorus concentration was less than 10.00 μg / L, and the RSD was less than 5% when the P concentration was more than 10.00 μg/L. The recovery rate was in the range of 97.0%-108.2%. 【Conclusion】The modified malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometric detection limit is low, the sensitivity is high, the linear range is wide, the color solution is stable, the accuracy and precision meet the water quality requirement, and the operation is simple and suitable for the microphosphate content of the detection.

malachite green (MG); spectphotometry; phosphate; water sample

Wang hong(1970- ), male, native place: Anhui. Professor, Ph.D.,research field: Study on crop nutrition and detection technology. (Email) wanghong01@caas.cn*

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.023

2017-04-15

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2013CB127402)

朱靖蓉(1972-)，女，浙江人，高級實驗師，碩士，研究方向農產品質量安全與檢測技術, zhujr2030@163.com

汪洪(1970-)， 男，安徽人， 研究員，博士，研究方向作物營養(yǎng)與檢測技術，wanghong01@caas.cn

S19

：A

：1001-4330(2017)08-1559-07

Supported by: The Major State Basic R & D Program of China (973 Program) (2013CB127402)