新疆紅棗軟腐病病原菌的鑒定

白劍宇，宋峰惠，吳正保，劉正興，崔燕華，史彥江

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院博士流動站，烏魯木齊 830052；2.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所，烏魯木齊 830063；3.阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆阿克蘇 843000)

新疆紅棗軟腐病病原菌的鑒定

白劍宇1,2，宋峰惠2，吳正保2，劉正興3，崔燕華3，史彥江2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院博士流動站，烏魯木齊 830052；2.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所，烏魯木齊 830063；3.阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆阿克蘇 843000)

【目的】鑒定棗軟腐病的致病病原，為有針對性的開展病害防治奠定基礎(chǔ)。【方法】采用病原菌常規(guī)分離技術(shù)獲取疑似病原物，通過形態(tài)學(xué)特征和回接驗(yàn)證對病原進(jìn)行鑒定；利用PCR技術(shù)獲取病原菌的ITS基因的序列片段，通過與GenBank中已有的相關(guān)序列進(jìn)行比對分析，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鑒定病原。【結(jié)果】新疆棗軟腐病病原的形態(tài)學(xué)特征與米根霉(Rhizopusoryzae)相似。棗軟腐病的病原與GenBank中已知的米根霉菌株的ITS序列顯示99%～100%的相似性，在遺傳進(jìn)化樹分析中并聚在同一組。【結(jié)論】基于形態(tài)學(xué)特征、致病性試驗(yàn)以及分子鑒定結(jié)果，新疆棗軟腐病病原被鑒定為Rhizopusoryzae。

棗軟腐病；rDNA-ITS；病原鑒定；遺傳進(jìn)化樹分析

0 引 言

【研究意義】紅棗(ZiziphusjujubeMill.)在中國因其對干旱和土壤pH值的廣泛適應(yīng)性以及其保健作用而收到廣大消費(fèi)者的歡迎[1]。近年來，紅棗在南疆地區(qū)廣泛種植，并成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的重要來源。目前，新疆南疆四地州已成為世界上最大的紅棗生產(chǎn)基地。然而，隨著棗樹種植面積的增加，栽培模式的多樣化以及新品種的不斷引進(jìn)造就了不同類型的新疆棗園生態(tài)小氣候，一些次要病害逐漸上升為主要病害，一些新病害也相繼出現(xiàn)，諸如由Alternariaalternata引起的棗葉斑病和棗褐色斑點(diǎn)病[2-3]，以及由Nothophomaquercina引起的棗褐斑病[4]等新病害。而棗軟腐病曾是紅棗生育后期危害紅棗的次要病害，但近年來，該病發(fā)生呈逐年加重的趨勢，且針對該病害的防治常常被棗農(nóng)忽略，造成紅棗品質(zhì)下降和產(chǎn)量損失。 因此，明確棗軟腐病的致病病原，在棗果生長期有針對性的開展病害防治，降低爛果率，對提高新疆紅棗產(chǎn)量和品質(zhì)，增加農(nóng)民的收入具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】目前，針對棗軟腐病病原的說法不一，大部分研究者認(rèn)為棗軟腐病是一種由多病原復(fù)合侵染引進(jìn)的爛果病，文獻(xiàn)報道的致病病原主要有細(xì)極鏈格孢Alternariatenuissima(Fr.) Wiltshire、青霉菌PenicilliumcitrinumThom、根霉Rhizopusstolonifer(Ehrenb.ex Fr.) Vuill、層出鐮刀菌Fusariumproliferatum(Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg、尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumSchlecht和短小芽孢桿菌BacilluspumilusMeyer and Gottheil等多種[5-8]，但大部分研究報道均缺少對病原的準(zhǔn)確鑒定[9]，且這些病原菌在果實(shí)烘干加工前的存儲期侵染能力更強(qiáng)，危害更加嚴(yán)重，并且隨著存放時間的延長，爛果率隨之增高[10-11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)棗軟腐病在南疆紅棗主產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，尤以阿克蘇地區(qū)最為嚴(yán)重。該病在棗成熟期開始顯癥，當(dāng)遇上雨水天氣及采后儲存期常與其它病原菌發(fā)生交叉感染現(xiàn)象，造成棗軟腐病對南疆紅棗的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。【本研究切入點(diǎn)】由于該病在棗果成熟期發(fā)病，特別是在新疆高溫、干燥的氣候條件下癥狀不明顯，常與棗果生理性皺縮病混淆，錯過病害的防治適期，造成果實(shí)存儲期病原菌交叉感染，爛果病發(fā)生加重。研究在前期實(shí)驗(yàn)調(diào)查的基礎(chǔ)上，以阿克蘇地區(qū)及周邊紅棗產(chǎn)區(qū)發(fā)生的棗軟腐病為重點(diǎn)，在病害發(fā)生的潛伏期和發(fā)病期分別采集病害標(biāo)本，準(zhǔn)確鑒定病原。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究棗軟腐病在田間侵染過程中的潛伏期和發(fā)生期分別進(jìn)行病原菌的分離、純化和鑒定，減少交叉感染現(xiàn)象的發(fā)生，從而準(zhǔn)確鑒定病原，為有針對性的開展病害防控和探索病害防控的關(guān)鍵點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

分別選取庫爾勒地區(qū)若羌縣米蘭鎮(zhèn)，阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣的多浪鄉(xiāng)紅棗示范基地、新和縣尤魯都斯鄉(xiāng)、溫宿縣佳木鎮(zhèn)和阿克蘇市一桿旗鄉(xiāng)等紅棗種植園作為樣品的采集地點(diǎn)，并于每年7月中旬至8月下旬病害發(fā)生的潛伏期和9月病害發(fā)病期分別采集疑似軟腐癥狀的果實(shí)樣本(75份)作為病原鑒定材料。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化

每個取樣地點(diǎn)選取10個棗軟腐病癥狀的棗果標(biāo)本(圖1a-b)，用75% 的酒精消毒后切取病健交界處組織，置于PDA 平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d，分離到的疑似病原真菌采用單孢分離技術(shù)進(jìn)行純化。

1.2.2 病原菌的致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

致病性實(shí)驗(yàn)于2016年8月在田間棗園進(jìn)行，棗樹樹齡為7～8 a，采用傷口接種法將疑似病原物接種于健康棗果，不同來源的每種疑似病原菌選取3個代表單孢菌株，每個菌株接種50個健康果實(shí)，以接種無菌水為對照，并用0.4 mm 的塑料袋保濕48 h后，每天觀察病害侵染情況，統(tǒng)計接種果實(shí)的發(fā)病率。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將通過致病性試驗(yàn)驗(yàn)證的病原在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，進(jìn)行病原形態(tài)特征觀察，測量分生孢子大小。采用玻片-水瓊脂生長培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行病原菌生長性狀及分生孢子著生方式觀察，初步鑒定病原，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)的方法[12]。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

選擇不同縣(市)共10個代表菌株作為分子鑒定材料，依據(jù)真菌 DNA 提取試劑盒操作說明提取各單孢菌株DNA，采用通用引物B9G[13]和ITS4[14]擴(kuò)增ITS基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物測序后，在GenBank進(jìn)行blast 分析，利用MEGA5.0序列分析軟件分別構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)行病原菌的鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

在潛伏期樣本中，疑似病原物主要是根霉菌(Rhizopussp.)和細(xì)菌(未鑒定)，分離頻率分別為59%和6%，而在發(fā)病期樣本中疑似病原物種類主要為根霉菌(Rhizopussp.)、鏈隔孢菌(Alternariasp.)和細(xì)菌(未鑒定)，分離頻率分別為71%、17%和8%，其中發(fā)病期存在病原物交叉感染現(xiàn)象。

2.2 病原菌的致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

研究表明，分離到的3種疑似病原物在接種5～7 d后開始陸續(xù)顯癥，其中根霉菌的顯癥最早，5 d 后接種傷口處出現(xiàn)黑色壞死斑點(diǎn)，后期病斑逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)與棗軟腐病相似的癥狀，發(fā)病率為67%(圖1c)；接種鏈隔飽菌的棗果在接種7 d后，傷口處出現(xiàn)黑褐色壞死斑，后期逐漸愈合，發(fā)病率為26%，呈過敏性壞死癥狀，與棗軟腐病癥狀不同；接種細(xì)菌的棗果，在7 d后亦出現(xiàn)壞死癥狀，后期愈合，發(fā)病率僅為7%。而在接種無菌水的健康棗果，未表現(xiàn)任何病害癥狀，發(fā)病率為0% (圖1d)。基于致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，棗軟腐病的致病病原為根霉菌。圖1

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

針對致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的根霉菌的顯微鏡觀察結(jié)果顯示：在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d 后，直徑為441～469 mm，呈灰白色，后變成灰黑色，具假根。孢囊梗產(chǎn)生于菌絲上，形成匍匐絲，每束2～4 株，壁光滑，長達(dá)(205)450～2 000(2 500)μm ×(5)10～18 μm，頂部膨大形成囊軸和孢子囊；囊軸球形，淡褐色，直徑(28)55～145(200)μm；孢囊梗束基部形成假根；孢囊孢子橢圓形，黃灰色，直徑 6～11 μm。孢子囊形大小為(60)145～215(245)μm，初期白色，成熟后變黑色。真菌的形態(tài)學(xué)與根霉屬中的米根霉的形態(tài)學(xué)特征一致，病原初步鑒定為米根霉Rhizopusoryzae(圖1e)。

注：a: 田間自然侵染條件下棗果軟腐病發(fā)病癥狀；b：發(fā)病棗果內(nèi)部軟腐癥狀；c田間人工接種后棗果的發(fā)病癥狀；d：接種無菌水的癥狀對照；e：棗軟腐病病原菌在水瓊脂上的生長培養(yǎng)癥狀

Note： (a) Natural infections on fruit of field-grown plants； (b)The symptoms of diseased fruit internal； (c) Chlorotic lesions on fruit surfaces 5-7 days after artificial inoculation； (d) Hypersensitive symptoms on fruit surfaces 5-7 days after artificial inoculation； (e) Characteristics of a colony ofRhizopusoryzaeon the upper surface of Water agar (WA).

圖1 棗軟腐病田間自然發(fā)病的果實(shí)受害癥狀及人工接種后的發(fā)病癥狀

Fig.1 Symptoms of fruit soft rot of jujube caused by natural infections and inoculations with Rhizopus oryzae in the field

2.4 病原菌的分子鑒定

PCR擴(kuò)增片段回收測序后大小分別為622 bp(圖2)，10單孢菌株各自的ITS基因片段彼此間的相似度為100%，1個代表菌株(XJRF 003)的ITS基因序列提交到基因庫中，序列號為KY886224。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：ITS序列片段 (GenBank accession no. KY886224)和基因庫中已知的米根霉ITS序列聚類明顯聚在一組，并且boot-strap 值為100%。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征、致病性實(shí)驗(yàn)和分子鑒定結(jié)果，棗軟腐病的病原被鑒定為R.orzage。圖2，圖3

圖2 棗軟腐病病原菌(Rhizopus oryzae)部分單孢rDNA-ITS擴(kuò)增片段

Fig.2AgarosegelshowingrDNA-ITSfragmentsfrompartisolatesofRhizopusoryzae

圖3 1個供試單孢與GenBank 中已報道的22個Rhizopus oryzae及相關(guān)單孢菌株ITS的遺傳進(jìn)化樹

Fig.3 Phylogenetic tree constructed with nucleotide sequences of ITS of different Rhizopus oryzae isolates. including one new isolate of this study，and 22 isolates available in GeneBank

3 討 論

研究針對棗軟腐病在棗樹生育期內(nèi)病害發(fā)生潛伏期和顯癥期的病害樣本進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，將病原鑒定為米根霉[R.oryzae]。而一些研究者在對新疆紅棗存儲期爛果病病原研究中，也發(fā)現(xiàn)該病菌是造成棗爛果病的主要病原菌之一[6-7]。由此說明，新疆發(fā)生的棗軟腐病在棗樹生長期間就已侵染部分棗果，而在采收后的存儲期由于其它病菌的交叉感染，加劇了棗爛果病的發(fā)生。但研究中對棗軟腐病的病原鑒定結(jié)果與內(nèi)地報道的棗軟腐病的致病病原種類不同。2011年王葉等[8]針對內(nèi)地發(fā)生的棗軟腐病的病原進(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)并證明層出鐮刀菌Fusariumproliferatum(Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg和尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumSchlecht可引起棗田間軟腐病。而研究中的病害樣本僅限于南疆部分縣(市)的5個采集地，至于整個南疆地區(qū)棗軟腐病病原種類及其致病優(yōu)勢種群如何，是否存在其它病原種類的可能，還需要進(jìn)一步的擴(kuò)大采集區(qū)域分區(qū)分類進(jìn)行鑒定，并針對特定病原靶標(biāo)開展有效的防控技術(shù)研究，為新疆紅棗產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級和提質(zhì)增效目標(biāo)任務(wù)的完成提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

研究針對采自南疆地區(qū) 5 個縣(市)的棗軟腐病潛伏期的75份棗果實(shí)標(biāo)本，經(jīng)組織分離和純化得到根霉菌(Rhizopussp.)、鏈隔孢菌(Alternariasp.) 和細(xì)菌3種疑似病原物，分離頻率分別為71%、17%和8%。致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：接種根霉菌的健康棗果5 d 后在接種傷口處出現(xiàn)黑色壞死斑點(diǎn)，后期病斑逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)與棗軟腐病相似的癥狀，發(fā)病率為67%。接種鏈隔飽菌和細(xì)菌的健康棗果盡管在初期也具有一定的致病力，發(fā)病率分別為26%和7%，但發(fā)病癥狀與棗軟腐病癥狀明顯不同，且在后期傷口愈合，呈過敏性壞死癥狀。因此，基于致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，棗軟腐病的致病病原為根霉菌。通過形態(tài)學(xué)鑒定和病原菌ITS序列分析，進(jìn)一步明確了棗軟腐病致病病原為米根霉。因此，基于形態(tài)學(xué)鑒定、致病性實(shí)驗(yàn)和分子鑒定結(jié)果，南疆地區(qū)棗軟腐病致病病原被鑒定為米根霉(R.oryzae)。

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IdentificationofthePathogenofJujubeSoftRotinXinjiang

BAI Jian-yu1,2，SONG Feng-hui2，WU Zheng-bao2，LIU Zheng-xing3， CUI Yan-hua3，SHI Yan-jiang2

(1.PostdoctoralMobileResearchStationofCollegeofForestryandHorticulture，Urumqi830052，China; 2.ResearchInstituteofEconomicForestry，XinjiangAcademyofForestrySciences，Urumqi830063，China; 3.AgriculturalTechnologyExtensionCenterofAksuPrefecture,AksuXinjiang843000,China)

【Objective】 The pathogen of soft rot disease of jujube was accurately identified so as to lay a foundation for disease prevention and control. 【Method】The suspected pathogens were obtained by the conventional isolation technology and were preliminarily identified by morphological features and loop validation. The fragments of ITS gene of the suspected pathogens were obtained by the PCR technique. When the related trains ofRhizopusoryzaein GenBank were compared and analyzed, the genetic evolutionary tree was constructed and the pathogen was identified by morphological identification and pathogenicity experiments.【Result】According to the morphological characteristics and the pathogenicity test results, the morphological characteristics of Rhizopus soft rot pathogen of Xinjiang jujube were similar to that ofRhizopusoryzae. The phylogenetic analysis of the pathogen showed that the ITS gene of pathogen of jujube soft rot showed 99 % to 100 % similarity with part ITS gene ofRhizopusoryzaein GenBank, and in the analysis of phylogenetic tree, they were clustered in the same group.【Conclusion】Based on the morphological characteristics, pathogenicity test and molecular identification of the pathogen, the pathogen of jujube soft rot was identified asRhizopusoryzae.

jujube soft rot; rDNA-ITS; pathogens identification; phylogenetic analysis

SHI Yan-jiang, (1961- ), male, native place: Shanxi. Professor, research field: Introduction and breeding of forest trees, (E-mail) syj504@126. Com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.013

2017-06-09

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目“新疆紅棗黑斑病菌的田間追蹤檢測技術(shù)研究”(2014M552565XD)；新疆維吾爾自治區(qū)林業(yè)發(fā)展補(bǔ)助資金項(xiàng)目“南疆紅棗主產(chǎn)區(qū)紅棗主要病害普查鑒定及田間追蹤監(jiān)測技術(shù)研究”(XJLKY2016056)

白劍宇(1977-)，男，河北承德人，副研究員，博士后，研究方向?yàn)榱謽I(yè)有害生物防控，(E-mail)bjyhao2010@sina.com

史彥江(1961-)，男，山西人，研究員，研究方向?yàn)榱帜疽N育種，(E-mail)syj504@126.com

S436.64

：A

：1001-4330(2017)08-1475-06

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation Project "The Tracking and Detection Technology of Pathogen of the Black Spot of Jujube in Fields in Xinjiang" (2014M552565XD) and Xinjiang Uygur Autonomous Region Research Institute Fund Project "Study on the Monitoring Technology of Screening and Identification of Main Diseases and Field Tracking in the Main Jujube Producing Areas in Southern Xinjiang" (KYGY2016055)