產O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌構建與發酵測試

楊靜李慶剛徐國棟鄭小梅鄭平牟海津

（1. 中國海洋大學食品科學與工程科學院，青島 266003；2. 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

產O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌構建與發酵測試

楊靜1，3李慶剛2，3徐國棟2，3鄭小梅2，3鄭平2，3牟海津1

（1. 中國海洋大學食品科學與工程科學院，青島 266003；2. 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

O-乙酰高絲氨酸（OAH）是具有潛在工業應用價值的前體化合物，可用于制備高絲氨酸與蛋氨酸等。以一株改造自蘇氨酸產生菌的Escherichia coli ThrL為出發菌株，過表達OAH合成途徑中的關鍵酶高絲氨酸脫氫酶基因thrA和高絲氨酸乙酰基轉移酶基因metX，并利用不同強度的啟動子組合優化這兩個基因的表達水平，通過發酵培養基中的蘇氨酸和酵母粉的濃度優化以提升OAH的產生菌株的生產性能。通過啟動子組合優化結果發現，當thrA與metX均采用J23110啟動子時，該重組菌株E.coli OAH4的OAH合成能力最強，搖瓶發酵50 h后，其OAH產量為1.54 g/L。當蘇氨酸的濃度為2 g/L，酵母粉的濃度為6 g/L時，E. coli OAH4的發酵水平最高，搖瓶發酵50 h后，OAH的產量可進一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E. coli中實現了OAH的合成，并通過發酵優化確定了OAH的最優發酵條件，為后續OAH生產應用研究奠定了基礎。

大腸桿菌；O-乙酰高絲氨酸；天冬氨酸激酶I/高絲氨酸脫氫酶I；高絲氨酸乙酰基轉移酶；發酵培養基優化

O-乙酰高絲氨酸（O-acetyl-homoserine，OAH）經水解可以產生高絲氨酸，而高絲氨酸可以作為L-高絲氨酸內酯、γ-丁內酯、1，4-丁二醇等平臺化合物［1］以及農藥草銨膦［2］合成的原料。另外，OAH可以與甲硫醇反應生成蛋氨酸和乙酸［3，4］，是蛋氨酸合成的前體［5］。蛋氨酸廣泛用作動物飼料［6，7］、食品［8］和醫藥［9］等多種領域，年需求量達160萬 t［10］。由此可見，OAH是一種具有潛在工業應用價值的前體化合物。

大腸桿菌（Escherichia coli）作為一種化學品生產的模式菌株，具有代謝調控機制研究清晰［11］、遺傳操作簡便快捷等特點，因此是OAH生產的合適出發菌株。但E. coli菌株并無OAH合成途徑，目前也尚無文獻報道。一些革蘭氏陽性菌株，如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中存在由metX基因編碼的高絲氨酸乙酰基轉移酶（homoserine O-acetyltransferase，MetX），該酶能夠將高絲氨酸乙酰化為OAH。如圖1所示，如在E. coli體內中過表達該metX基因則可利用體內存在的高絲氨酸為前體，實現OAH的合成。

L-高絲氨酸作為合成OAH的重要前體，是實現OAH體內積累的關鍵。但高絲氨酸同時也是多種氨基酸合成的前體，因此，OAH生產菌株的構建中，旁路氨基酸合成途徑的弱化與改造是必須的。如圖1所示，高絲氨酸參與蘇氨酸的合成，高絲氨酸上游前體物質天冬氨酸經過天冬氨酸激酶I/高絲氨酸脫氫酶I（Aspartokinase I/homoserine dehydrogenase I，ThrA）和天冬氨酸半醛脫氫酶（Aspartate-semialdehyde dehydrogenase，ASD）的作用被轉化為高絲氨酸，再經過高絲氨酸激酶（Homoserine kinase，ThrB）和蘇氨酸合成酶（Threonine synthase，ThrC）的作用產生蘇氨酸。因此，蘇氨酸合成途徑中的thrB與thrC基因的弱化改造是關鍵。另外，高絲氨酸的前體天冬氨酸半醛同時是賴氨酸合成的前體，因此，從天冬氨酸半醛到賴氨酸的途徑弱化也是必要的。雖然高絲氨酸也可在高絲氨酸琥珀酰基轉移酶（Homoserine O-succinyltransferase，MetA）的作用下轉化為O-琥珀酰高絲氨酸（O-succinyl-homoserine，OSH），進而合成蛋氨酸，但這與OAH到蛋氨酸合成的目標一致，因此對蛋氨酸合成途徑無需改造。

由于OAH合成途徑的構建中涉及較為復雜的途徑調控的問題，因此選擇合適的出發菌株與各關鍵基因的協同轉錄調控較為重要。OAH可由L-高絲氨酸乙酰化而來，L-高絲氨酸是E. coli合成蘇氨酸的重要中間代謝物，因此蘇氨酸產生菌具有被改造用于生產OAH的潛力。由于蘇氨酸高產菌體內蘇氨酸代謝途徑經過優化，賴氨酸途徑被弱化，減少了天冬氨酸半醛流向賴氨酸合成途徑，可以實現高絲氨酸前體天冬氨酸半醛的積累。通過弱化其體內蘇氨酸合成途徑中的高絲氨酸下游代謝途徑，以及通過過表達thrA提高天冬氨酸半醛轉化為高絲氨酸的含量，可以進一步提高胞內高絲氨酸積累量。另一方面，由于OAH的前體物質天冬氨酸半醛和高絲氨酸在胞內的積累會對細胞的生長產生抑制［12］，考慮到胞內代謝平衡的問題，因此對thrA和metX表達強度進行調控顯得很有必要。

針對上述旁路氨基酸合成途徑的改造問題，本研究前期已將自主擁有的一株蘇氨酸產生菌E. coli ThrH［13］改造為出發菌株，利用E. coli ThrH自身基因組上的賴氨酸等其他氨基酸合成已弱化的特性，再通過將E. coli ThrH體內含有的一個攜帶蘇氨酸代謝關鍵酶基因簇thrABC的質粒丟失后，獲得無蘇氨酸積累的中間菌株E. coli ThrL。在前期研究基礎上，本研究將以E. coli ThrL作為出發菌株，通過過表達thrA基因和metX基因來構建OAH的產生菌株，并采用啟動子組合對thrA基因和metX基因的協同表達水平進行優化，然后經過發酵測試對一系列OAH產生菌株的發酵性能進行評價比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒信息以及引物、啟動子序列 本研究所用的菌株、質粒、引物與啟動子信息見表1。

1.1.2 主要試劑 PCR產物純化試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；一步法無縫克隆試劑盒（ClonExpress? CE II）購自南京諾唯贊生物科技公司；限制性內切酶、PCR擴增使用的phusion DNA polymerase購自Thermo Fisher Scientific公司；酵母粉購自英國Oxoid公司；蘇氨酸購自索萊寶生物公司；氨芐青霉素，2，4-二硝基氟苯購自Sigma公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

圖1 E. coli及C. glutamicum合成賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸途徑

1.1.3 儀器與設備 PCR擴增儀（Applied Biosystems）；DNA凝膠電泳槽（Baygene）；高速冷凍離心機（Sigma）；分光光度計及高效液相色譜儀（日本島津公司）；電擊轉化儀（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Nano drop（美國Thermo公司）；高通量振蕩培養箱（INFORS Multitron Pro）；24深孔板（常州英德生物有限公司）；葡萄糖檢測器所用SBA-40D生物傳感分析儀（山東省科學院）。

1.1.4 培養基 LB培養基成分：胰化蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L。

發酵培養基成分［1，14］：葡萄糖 50 g/L，（NH4）2SO410 g/L，酵母粉（根據需要添加），蘇氨酸（根據需要添加），KH2PO42 g/L，3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MOPS）80 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·5H2O 0.1 g/L，MnSO4·5H2O 0.1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 thrA和metX表達質粒和菌株的構建 為了達到協同調節thrA和metX表達強度的目的，構建不同啟動子組合的thrA和metX協同表達質粒，流程如圖2。以C. glutamicum 13032基因組為模板，使用引物metX110-F/R擴增出帶有J23110啟動子的metX片段（步驟①），命名為J23110-metX（其他片段命名規則與此相同）；使用pTrc99a-F/R擴增出載體片段步驟②，使用一步法無縫克隆試劑盒將2條片段進行同源重組，獲得質粒pSYM-110（步驟③）。以質粒pSYM-110為模板，分別使用引物J23101pTMX-F/R，J23100pTMX-F/R進行PCR擴增，擴增片段使用BamH I酶切后自身連接，獲得質粒pSYM-101（步驟④）和pSYM-100。分別以質粒pSYM-110、pSYM-101和pSYM-100為模板，分別利用thrA114-F、thrA110-F、thrA101-F和thrA100-F為上游引物，利用ptmx-R為下游引物進行PCR擴增，通過3種模板與4對引物的12種不同組合，獲得12種質粒片段，其中啟動子J23114分別與J23110-metX、J23101-metX組合的2條片段獲得過程如步驟⑤所示；以ThrH體內攜帶的蘇氨酸代謝關鍵酶基因簇thrABC的質粒為模板，使用引物thrA-F/R擴增獲得不帶有啟動子的thrA片段（步驟⑥）。利用一步法無縫克隆試劑盒，分別將這12條片段與不帶有啟動子的thrA基因進行同源重組，獲得表1中所示pSYM-1到pSYM-12共12種質粒如步驟⑦。

經過上述方法，將構建的pSYM-1到pSYM-12共12種質粒分別采用電轉化方式轉化到ThrL中，獲得12株菌株，分別命名為：E. coli OAH1、E. coli OAH2、E. coli OAH3、E. coli OAH4、E. coli OAH5、E. coli OAH6、E. coli OAH7、E. coli OAH8、E. coli OAH9、E. coli OAH10、E. coli OAH11和E. coli OAH12。

1.2.2 菌株培養 常規的菌株培養在LB培養基中進行，進行發酵培養時，吸取5 μL甘油保存菌株接入到5 mL LB液體培養基過夜培養作為種子液；測量OD600在4-5之間時，按1%接種量進行接種。發酵培養使用24深孔板進行，裝液量為500 μL，在高通量震蕩搖床中培養，培養溫度為37℃，轉速為800r/min，濕度為90%，培養時間為50 h。如菌株攜帶表1所示質粒，則培養基中加入終濃度為100 mg/L的氨芐霉素。

表1 本研究所用的菌株、質粒、引物和啟動子

圖2 部分pSYM系列質粒構建示意圖

1.2.3 培養基優化

1.2.3.1 菌株生長必需氨基酸優化 以不含蘇氨酸含酵母粉為3 g/L的發酵培養基為基礎，分別測定1 g/L的蘇氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸對菌株生長的影響，每組3個平行。培養50 h后測定菌體生長情況（OD600）。

以不含蘇氨酸含酵母粉為3 g/L的發酵培養基為基礎，測定菌株生長所需的最適蘇氨酸濃度。蘇氨酸添加量分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 g/L，每組3個平行。培養結束后，檢測菌體生長情況（OD600）。

1.2.3.2 菌株發酵產OAH培養基優化 首先以含蘇氨酸為2 g/L不含酵母粉的發酵培養基為基礎，優化酵母粉的濃度，添加量分別為1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7和8 g/L，每組3個平行。發酵結束后，檢測菌體生長情況（OD600）和上清液中OAH濃度。

其次以不含蘇氨酸不含酵母粉的發酵培養基為基礎，組合優化蘇氨酸和酵母粉的濃度對發酵產OAH的影響，如表2所示，共16組不同的蘇氨酸和酵母粉濃度組合，每組3個平行。發酵50 h后，檢測上清液中OAH濃度以及計算葡萄糖轉化為OAH的轉化率（OAH產量與葡萄糖消耗量的質量百分比）。

表2 蘇氨酸與酵母粉協同優化濃度組合

1.2.4 使用HPLC檢測發酵液中OAH濃度的方法及葡萄糖測定方法 取1 mL發酵液于1.5 mL微量離心管中，12 000 r/min離心5 min；取10 μL上清，加入200 μL衍生緩沖液（0.5 mol/L 碳酸氫鈉溶液）、200 μL衍生劑（含量為1%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液），迅速混勻并置于60℃水浴避光反應1 h；衍生結束后，每個樣品體系中再加入390 μL定容緩沖液（50 mmol/L 磷酸二氫鉀溶于29.1 mmol/L NaOH溶液），定容至800 μL；利用0.22 μm濾膜過濾處理。HPLC檢測所用色譜柱為島津Inertsil?ODS分析色譜柱，柱溫箱保持36℃，檢測波長360 nm；流動相A相為50 mmol/L 無水醋酸鈉，冰醋酸調節pH至6.4；B相為50%乙腈溶液。流動相總流量1 mL/min，采用梯度洗脫，A相比例分別為：0 min 16%、0.3 min 16%、4 min 30%、7 min 34%、12 min 43%、22 min 55%、25 min 55%、34 min 98%和35.5 min 16%。

葡萄糖分析方法：采用山東省科學院生產的SBA-40D生物傳感器進行檢測。

2 結果

2.1 不同thrA和metX表達強度質粒的構建

為實現thrA和metX基因表達的組合調控，本實驗中利用不同表達強度的啟動子J23114、J23110、J23101和J23100（J23110、J23101和J23100啟動子強度分別約為J23114的3.3倍、7.0倍和9.9倍，http：//parts.igem.org/Part：BBa_J23100），對thrA和metX基因的表達進行了優化。構建的12種組合中thrA基因和metX基因啟動子的強度比例最高為3倍（J23100強度/J23110強度，pSYM-10），最低為0.1倍（J23114強度/J23100強度，pSYM-3）。通過PCR擴增獲得的J23110-metX片段，PCR結果（圖3-A）顯示，片段長度為1 191 bp，目的條帶大小與預期正確；PCR擴增獲得的thrA基因片段，PCR結果（圖3-B）顯示，片段長度為1 819 bp，目的條帶大小與預期正確；帶有thrA基因的4種啟動子J23114、J23110、J23101、J23100分別與J23110-metX、J23101-metX、J23100-metX組合的12條片段PCR結果（圖3-C）顯示，長度為3 579 bp，目的條帶大小與預期正確。構建獲得的12種質粒分別利用引物testptmx-F和testptmx-R進行PCR擴增，理論上PCR產物長度為1 120 bp，擴增出的產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證大小正確（圖3-D），進一步通過DNA測序進行了證實。最終獲得的12個啟動子組合質粒命名如表1中質粒pSYM-1至pSYM-12所示。

圖3 pSYM系列質粒構建過程中相關電泳驗證結果

2.2 不同thrA和metX表達強度E.coli OAH的發酵測試

2.2.1 E.coli OAH菌株生長所需氨基酸測試 利用E.coli OAH9菌株測試了蘇氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸對其生長的影響。結果顯示，培養50 h后OD600，如圖4所示，不添加任何氨基酸的對照組的OD600為2.43，添加異亮氨酸和蛋氨酸組中，菌株E.coli OAH9的OD600分別為3.51和3.60，而添加蘇氨酸后菌株OD600顯著提高為11.93。

不同濃度的蘇氨酸對菌株生長的影響，其結果如圖5所示。隨著蘇氨酸濃度從0 g/L到2 g/L逐漸升高，OD600也逐漸增加，蘇氨酸濃度為2 g/L時達到最大，繼續增加蘇氨酸濃度，反而OD600有下降趨勢。說明2 g/L的蘇氨酸添加到發酵培養基中能夠滿足菌株的生長需求。

圖4 菌株E. coli OAH9在含有不同氨基酸的發酵培養基中的生長

圖5 菌株E. coli OAH9在含有不同濃度的蘇氨酸發酵培養基中的生長

2.2.2 不同thrA和metX基因表達強度E. coli OAH的發酵測試 為了對12株不同thrA和metX基因表達強度的E. coli OAH菌株產OAH的能力進行評價，利用含有3 g/L酵母粉和2 g/L蘇氨酸的發酵培養基發酵50 h后，檢測發酵液OD600和OAH含量，結果如圖6所示。結果顯示，E. coli OAH5的OD600最低（10.60），E. coli OAH4的OD600最高（18.07），可見thrA和metX基因的表達強度對菌株的生長具有明顯的影響。但是菌株的生長和產OAH的能力卻不呈現正相關，如E. coli OAH9與E. coli OAH12的OD600分別為13.43和13.71，生長水平相當，兩者OAH的產量分別為0.66 g/L和0.19 g/L，前者OAH產量約為后者3.5倍。基本上，當thrA表達強度固定時，OAH的產量隨metX的表達增強呈下降趨勢。當thrA基因的啟動子為J23110，metX基因的啟動子為J23110時，即菌株E. coli OAH4產OAH的能力最強，產量為1.54 g/L，是產量最低的菌株E. coli OAH12的5倍。

圖6 不同thrA和metX表達強度的E. coli OAH菌株生長和產OAH情況

2.3 菌株 E.coli OAH4的初步發酵優化

2.3.1 酵母粉濃度優化 為了考察酵母粉濃度對菌株合成OAH的影響，利用含有2 g/L蘇氨酸的發酵培養基，檢測E. coli OAH4在不同酵母粉濃度條件下發酵產OAH的情況。分別檢測發酵終點時的OAH含量和葡萄糖轉化為OAH的轉化率，結果如圖7所示。酵母粉濃度為1 g/L時菌株OD600為3.63，OAH產量為0.32 g/L，可見此時菌株無法正常生長。濃度處于2 g/L-5.5 g/L之間時，OAH產量處于1.2 g/L-1.4 g/L之間，轉化率處于2.49%-2.69%之間，OAH產量和轉化率基本沒有差別。酵母粉濃度增加到6 g/L時，OAH產量提高到1.92 g/L，轉化率提高到3.85%，隨著酵母粉濃度增加，OAH與轉化率并未提升，反而有不利影響。因此，在發酵培養基中，蘇氨酸為2 g/L酵母粉的濃度為6 g/L時對于菌株E. coli OAH4產OAH最有利。

圖7 菌株E. coli OAH4在不同酵母粉濃度的發酵培養基中生長及產OAH情況

2.3.2 蘇氨酸與酵母粉濃度協同優化實驗 測試了不同的蘇氨酸和酵母粉濃度組合（表2）對E. coli OAH4發酵產OAH的影響，結果如圖8所示。在蘇氨酸濃度固定時，隨著酵母粉濃度的增加，OAH產量、OD600和轉化率基本呈現出上升趨勢。其中蘇氨酸2.5 g/L，酵母粉1 g/L時，OD600為3.07，此時菌株無法正常生長。另外，蘇氨酸濃度為1 g/L時，酵母粉從3 g/L增加至7 g/L時OAH產量、OD600及轉化率均無明顯變化，當酵母粉濃度增加至9 g/L時三者才顯著增加。而蘇氨酸濃度為2 g/L時，OAH產量在1.41 g/L至1.98 g/L范圍類，與其他組相比，該組酵母粉含量變化對OAH的產量變化影響更小，此時酵母粉為6 g/L時，OAH產量為1.98 g/L，轉化率為3.98%，均為最高水平。確定蘇氨酸為2 g/L，酵母粉為6 g/L為發酵培養基最佳組合方式。

圖8 菌株E. coli OAH4在不同蘇氨酸和酵母粉濃度的發酵培養基中生長及產OAH情況

3 討論

本研究中thrA和metX基因的表達強度對E. coli OAH系列菌株產OAH的水平起著重要影響。在出發菌株ThrL中過表達thrA，可以使菌株獲得生產高絲氨酸的能力，進一步引入C. glutamicum來源的metX后，可以將高絲氨酸乙酰化生成OAH。然而，高絲氨酸同時也是菌株生長所需的多種氨基酸代謝途徑中的前體物質［15-18］，在胞內的含量水平會對菌株生長及OAH的生產造成影響；另外，由于ThrH的蘇氨酸代謝途徑得到過優化，可以推測改造自ThrH的ThrL體內代謝葡萄糖生成天冬氨酸半醛的速度較快，而中間物天冬氨酸半醛和高絲氨酸對菌株具有潛在的毒性［12］，大量積累對菌株生理造成影響。考慮到以上兩點，調節thrA和metX的表達強度以改善菌株的代謝、生長以及提高OAH的產量顯得很有必要，在此之前也沒有利用E. coli生產OAH的詳細報道，可以借鑒的經驗較少。因此，改造ThrL生產OAH也面臨很大挑戰。

在遺傳操作系統中，啟動子是一個重要的調控轉錄元件，可以實現關鍵酶的精確表達。已有研究證明，代謝途徑中關鍵酶基因的過強表達會對菌株的生長產生抑制或由于代謝物的積累帶來的毒性作用［19，20］，相關研究采用了強度不同的啟動子對代謝途徑中多個基因的表達進行調節，從而對菌株的生長及目標產物的產量起到了調節作用［21，22］。本研究通過啟動子組合實現thrA和metX的表達調節，啟動子本身的強度相差將近10倍，12種組合中thrA基因和metX基因啟動子強度比例變化范圍為0.1-3之間，強度跨度較大，能夠對OAH的合成途徑進行一定浮動范圍內的調控。對12種組合表達的菌株進行發酵測試發現，菌株E. coli OAH4的OAH產量最高（1.54 g/L），是最低產量菌株的5倍，推測代謝過程中高絲氨酸積累程度和高絲氨酸乙酰化程度是影響菌株生長和生產的重要因素，充分說明了調節thrA和metX的表達強度對于OAH的合成具有重要影響，合適的thrA和metX表達強度可以提高OAH的產量。

蘇氨酸是E. coli OAH系列菌株合成OAH的必需營養因子。出發菌ThrL改造自蘇氨酸產生菌ThrH，實驗結果顯示，E. coli OAH系列菌株需要外源添加蘇氨酸以維持正常生長，推測其基因組上蘇氨酸代謝途徑中thrB和thrC可能發生了一些復雜突變使其喪失了合成能夠維持自身生長所需的蘇氨酸的能力。構建產OAH的E. coli的改造重點是使高絲氨酸代謝生成OAH，在一定程度上也導致了高絲氨酸流向蘇氨酸的流量減少。由于OAH產生菌只是在ThrL的基礎上進一步實現了thrA和metX的協同表達，沒有針對其生長缺乏蘇氨酸的現象進行相應改造。因此，對E. coli OAH體內的蘇氨酸代謝途徑進行改造可能是進一步研究的重點，今后可以通過進一步探索在E. coli OAH體內重新過表達thrB和thrC，對其表達水平以及根據其對OAH代謝途徑的影響效果進行不斷地調節，使其自身能夠合成滿足生長所需的蘇氨酸。

酵母粉同樣是E. coli OAH系列菌株合成OAH的必需營養因子。由于酵母粉含有氨基酸、肽類、維生素、生長因子及微量元素等豐富的營養物質［23］，已有研究表明酵母粉與不同濃度的氨基酸混合添加到培養基中會對目標產物合成的代謝途徑產生復雜影響從而影響菌株生長狀態和產量［24］。針對本研究的OAH產生菌，考察了酵母粉和蘇氨酸濃度配比對菌株的生長和OAH產量的影響。實驗結果顯示，在不含蘇氨酸，酵母粉3 g/L時，菌株E. coli OAH9無法生長，可見酵母粉中營養成分及其含有的蘇氨酸并不能完全滿足菌株生長對蘇氨酸的需求。另外，蘇氨酸2.5 g/L，酵母粉1 g/L時菌株E. coli OAH4無法正常生長，推測酵母粉中除蘇氨酸外的其他營養成分可能對菌株的生長具有重要作用。針對蘇氨酸2 g/L，酵母粉6 g/L時OAH產量與轉化率最高，確定了該組合為最優配比方式。

對于利用微生物生產工業化學品來說，產物濃度和轉化率是兩個重要指標［25］。因此，利用這兩個指標對蘇氨酸和酵母粉添加量進行了評價。優化后，菌株E. coli OAH4的產量從1.54 g/L提高到1.98 g/L，此時轉化率也最高（3.98%）。由于菌株代謝本身的復雜性，消耗葡萄糖進行生長時，其葡萄糖有可能被菌體吸收則表現為OD600的增長，有可能轉化為OAH則表現為OAH產量提高，也有可能產生大量的副產物或被最終降解為CO2產生能量從而影響轉化率。因此，菌株的生長、OAH產量以及OAH轉化率三者之間不一定完全關聯，本研究中OAH產量和轉化率之間并不總是正相關。因此，優化培養基時需要綜合考慮產量和轉化率指標。

4 結論

OAH是一種潛在的重要工業化學品，本文通過啟動子組合優化關鍵酶的基因thrA和metX在E. coli ThrL中的表達，實現了OAH的合成，并通過發酵培養基的初步優化進一步提高了OAH的產量。本研究首次證明了在E. coli中合成OAH的可行性，并通過發酵測試確定了OAH的最優發酵條件。

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（責任編輯 李楠）

Construction and Fermentation Testing of an O-acetyl-homoserine Producing Escherichia coli Strain

YANG Jing1，3LI Qing-gang2，3XU Guo-dong2，3ZHENG Xiao-mei2，3ZHENG Ping2，3MOU Hai-jin1
（1. School of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

O-acetyl-homoserine（OAH）is an important industrial ingredient for homoserine and methionine production. We used the modified threonine-producing strain Escherichia coli ThrL as the host strain，to overexpress homoserine dehydrogenase gene thrA and homoserine acetyltransferase gene metX that are key genes for OAH production. The promoter combination was designed to optimize the transcription of these two key genes. Then，the concentrations of threonine and yeast extract in the fermentation medium were also optimized. After the promoter combination optimization，it showed that the OAH yield of the recombinant strain E.coli OAH4，in which the thrA and metX genes were separately controlled by J23110 promoter，was the highest and reached up to 1.54 g/L after 50 h incubation. When the concentrations of threonine and yeast extract were 2 g/L and 6 g/L，respectively，the OAH yield of E. coli OAH4 was the highest and further increased to 1.98 g/L after 50 h incubation. In this study，the synthesis of OAH was achieved in E. coli for the first time. The expression of thrA and metX，and fermentation conditions of OAH were optimized，which paved the way for the further OAH production research.

Escherichia coli；O-acetyl-homoserine；aspartate kinase I/homoserine dehydrogenase I；homoserine acetyltransferase；fermentation medium optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0310

2017-04-17

天津市高層次創新創業團隊-微生物細胞工廠設計創新團隊，中國科學院重點部署項目（ZDRW-ZS-2016-2）

楊靜，女，碩士研究生，研究方向：食品科學；E-mail：yangjing1109love@163.com

鄭平，女，研究員，博士生導師，研究方向：細菌的代謝工程改造和系統生物學，E-mail：zheng_p@tib.cas.cn；牟海津，男，博士，博士生導師，研究方向：應用微生物，E-mail：mousun@ouc.edu.cn