解淀粉芽孢桿菌AF1發酵液的抗菌活性與抗菌機理

楊艷紅 余瑛 胡永強 余溪 李青青

（重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054）

解淀粉芽孢桿菌AF1發酵液的抗菌活性與抗菌機理

楊艷紅 余瑛 胡永強 余溪 李青青

（重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054）

測定解淀粉芽孢桿菌AF1發酵液的抗菌譜，對發酵液抗MRSA的活性穩定性及抗MRSA機制進行初步探究，為尋找新的抗MRSA化合物提供實驗基礎。以耐藥金葡菌SA46為病原指示菌，不同pH、溫度和蛋白酶處理后，考察AF1發酵液剩余抗菌活性。用顯微鏡和透射電鏡觀察經發酵液處理后的SA46形態變化，并用凝膠電泳分析SA46的蛋白質和DNA滲漏情況，初步探討其抗菌機制。結果顯示，AF1發酵液具有廣譜抗菌活性：不僅對臨床耐藥金葡菌、一般臨床大腸桿菌和金葡菌有很強抑菌作用，同時對大部分試驗的植物病原菌也有較好抑菌作用。發酵液在pH 2.0-9.0，4-80℃，120 min后抗菌活性均保持95%以上；并且對蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶穩定。SA46經發酵液（MIC）處理后，顯微鏡和透射電鏡觀察發現其細胞壁受到不同程度破壞；在DNA和蛋白質電泳圖上，試驗組SA46的DNA和蛋白質條帶很清晰，即SA46蛋白質和DNA出現滲漏，而對照組均沒有條帶出現，初步推斷AF1對MRSA的抗菌機理是破壞病原菌的細胞壁來抑制細胞生長的。菌株AF1可作為抗MRSA藥物研發的潛在新來源。

解淀粉芽孢桿菌；抗菌譜；抗MRSA；細胞壁

近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）已經成為全球社區和醫院感染的重要病原菌之一。每年數百萬人遭受感染，并且出現的頻率越來越高，在2011年至2014年間，美國醫院從患者的鼻孔和血液培養中收集了516種MRSA分離物［1，2］。由于MRSA具有多部位感染和多重耐藥性，已被公認為世界三大最難解決的感染性疾病之一［3，4］。目前，用于臨床的藥物主要是萬古霉素、去甲基萬古霉素、替考拉寧、達托霉素和利奈唑胺等。萬古霉素、去甲基萬古霉素雖然治療效果好，抗菌譜廣，但是對腎、耳有一定的毒性［5］，且已經出現了多種萬古霉素耐藥菌株［6］。替考拉寧雖然腎毒性比萬古霉素低，但與其他糖肽類藥物有交叉耐藥性；達托霉素很難引起和其他抗生素發生交叉耐藥的問題，能達到比萬古霉素更好的治療效果［7］，但其諸如胃腸道反應、發熱、頭疼等不良反應較多［8］；在中國已經發現利奈唑胺耐藥菌株，并且有血小板減少、導致視神經和周圍神經病變等副作用［9-12］。因此，研究和篩選更加安全、有效、穩定的抗MRSA的抗生素，對于控制感染流行和臨床治療有著重要的意義。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在自然界分布廣泛，易分離培養，對人畜無毒無害，不污染環境。解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中可以產生一系列能夠抑制真菌和細菌活性的代謝物。目前研究較多的是其對植物病原菌的抑制作用，被廣泛應用于花卉、水果以及各種農作物病害防治［13-19］。但是，解淀粉芽孢桿菌用于臨床治療的研究尚不多。本研究主要對實驗室分離的一株解淀粉芽孢桿菌［20］的抗菌活性和抗MRSA機理進行初步探究，以期為解淀粉芽孢桿菌的抗MRSA活性物質的進一步研究和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 AF1，重慶理工大學生物工程實驗室分離。病原指示菌（1）病原細菌：WHO2、252、SA44、SA45、SA46、SA47、SA48、SWSA58、SWSA59、SWSA60、SWSA61、SWSA62、35218、SWEC41、SWEC44、SWEC45、SWEC46、SWEC47、 SWKP41、SWKP42、SWKP43、SWKP44、SWKP45、SWKP46、SWKP47和KP42（由第三軍醫大學基礎部藥理學教研室提供）。（2）植物病原菌：柑橘綠霉、枯萎、疫霉、蕃茄早疫、花生黑斑、棉立枯、稻瘟、煙草赤星、黃瓜灰霉（由本校余瑛老師提供）。

1.1.2 培養基 抗菌活性篩選培養基，如表1。

表1 抗菌活性篩選培養基

1.2 方法

1.2.1 AF1發酵液抗菌譜

1.2.1.1 發酵液樣品制備 將斜面菌種挑取1環接種到裝有50 mL生長培養基的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養，待OD600值達到5.0時，按1%接種量接入發酵培養基中，37℃，200 r/min培養24 h，發酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm膜過濾，收集濾液備用。

1.2.1.2 對病原細菌的處理 分別將各斜面病原菌種，接種至裝有30 mL新鮮液體LB培養基的100 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養20 h。然后，采用平板傾注法，把各個病原菌液分別接種至LB固體培養基，再在每個病原菌的LB固體平板上分別均勻打孔，孔徑為8 mm，每孔接入200 μL上述發酵濾液，37℃培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈大小。1.2.1.3 對植物病原真菌的處理 采用平板對峙法，在PDA平板中，將直徑約0.3 cm的兩塊指示病原菌瓊脂塊接種在距平板中央3 cm處的直線上兩點處，平板中央打孔，孔徑為8 mm，接入1.2.1.1制備好的發酵濾液200 μL，置于28℃培養箱培養5 d，測量抑菌圈直徑（中心至兩病原菌菌落菌絲邊緣的距離）的大小作為抑菌活性指標。

1.2.2 不同培養基發酵液對耐藥金葡菌SA46的抗菌活性 將斜面菌種挑取1環接種到裝有50 mL生長培養基的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養，待OD600值達到5.0時，按1%接種量分別接入1.1.2中6種不同的培養基中，37℃，200 r/min培養24 h，發酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm膜過濾，收集濾液。以耐藥金葡菌SA46為指示菌，采用1.2.1.2相同的平板傾注法，測定每種發酵培養基發酵液的抑菌圈大小。

1.2.3 AF1發酵液活性穩定性研究

1.2.3.1 pH值對發酵液活性的影響 取27支潔凈試管，每支分別取1.2.1.1制備好的發酵液10 mL，其中3支對照原液組保持自然pH值，其余用少量鹽酸溶液和NaOH溶液分別調pH為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和11.0。每個pH分別處理30、60、90和120 min，處理后的樣品調回原來的自然pH值，再用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液，每個pH處理重復3次。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測定各樣品的抑菌圈大小。以處理時間為橫坐標，以相對活性為縱坐標，繪制曲線。以對照原液組的抑菌圈大小為活性100%，計算各pH組的相對活性。

1.2.3.2 溫度對發酵液活性的影響 取18支潔凈離心管，每支分別取1.2.1.1制備好的發酵液30 mL，其中3支對照組放置室溫，其余分別放置冰箱和水浴鍋保持4℃、30℃、60℃、80℃和100℃。每個溫度分別處理30、60、90和120 min，處理完畢后每支離心管補加去離子水至原來的刻度線，再用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液，每個溫度處理重復3次。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測定各樣品的抑菌圈大小。以處理時間為橫坐標，以相對活性為縱坐標，繪制曲線。以對照組的抑菌圈大小為活性100%，計算各溫度的相對活性。

1.2.3.3 蛋白酶對發酵液活性的影響 取12支潔凈試管，每支分別取1.2.1.1制備好的發酵液10 mL，其中3支為對照組，不加任何蛋白酶，其余9支，分別加入蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶，使酶的終濃度為1 mg/mL，每處理重復3次。其中，胃蛋白酶組調pH為2.0，蛋白酶K和胰蛋白酶組pH值為7.0，于37℃，處理2 h，處理完畢后，再把各濾液pH調至原發酵液pH，用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測定各樣品的抑菌圈大小。以對照組的抑菌圈大小為活性100%，計算各蛋白酶處理組的相對活性。

1.2.4 AF1 發酵液對耐藥金葡菌SA46抗菌機理初步研究

1.2.4.1 最低抑菌濃度測定［21］按最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）測定法測定上述制備的AF1菌的發酵濾液對耐藥金葡菌SA46的MIC值。將培養至對數生長期的SA46菌液加入96孔細胞培養板，每孔50 μL，在向各孔中加入50 μL經倍比稀釋的AF1菌的發酵濾液，陰性對照為加入無菌水。37℃培養6 h，酶標儀在λ=630 nm檢測OD值，與初始值相比，OD值未有顯著變化的最小濃度定義為AF1發酵濾液對該菌的最低抑菌濃度。1.2.4.2 發酵液對耐藥金葡菌SA46菌株細胞壁的影響 按5%的接種量將對數期的SA46菌分別接種至30 mL液體LB培養基中，分別記作實驗組和對照組，按最低抑菌濃度稀釋比分別向實驗組和對照組中加入10 mL 1.2.1.1制備好的發酵濾液和10 mL無菌水，然后將其在37℃，200 r/min條件下，培養12 h。將實驗組和對照組中的SA46菌液，分別取5 mL，經5 000 r/min離心10 min，菌體用生理鹽水洗滌1遍，分別加入蒸餾水5 mL，待作用15 min后，終止反應，革蘭氏染色，用油鏡觀察結果。另分別取實驗組和對照組中的SA46菌液于5 000 r/min下離心10 min，去上清液，收集菌體于1.5 mL EP管，沿管壁緩慢加入戊二醛固定液，并保持不破壞細菌團塊，送至重慶醫科大學透鏡室處理，切片，觀察，拍片。

1.2.4.3 對耐藥金葡菌SA46菌株基因組DNA和蛋白質滲漏的影響 取對數期的SA46菌液10 000 r/min離心10 min，然后用生理鹽水洗滌2次，收集菌體。分為實驗組和對照組，實驗組加入100 μL 的AF1發酵濾液后加入300 μL無菌水，使其濃度為MIC，對照組加入400 μL水，每個組作兩個平行組，37℃作用90 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察SA46基因組DNA的滲漏情況。同時，另取上清液中加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳。實驗用濃縮膠濃度為5.0%，分離膠濃度為15%，考馬斯亮藍染色后脫色，觀察SA46的蛋白質滲漏情況。

2 結果

2.1 發酵液抗菌譜

2.1.1 發酵液對病原細菌的抗菌活性 以不同病原細菌為指示菌、測定發酵液對各病原菌的抑菌圈大?。ū?），發現AF1發酵液不僅對標準耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）有較強的抑菌活性，同時對臨床MRSA的抑菌作用也很強。對臨床大腸桿菌和普通金葡菌均有抑菌作用，但是其對臨床的假單胞菌株卻沒有任何活性。

2.1.2 發酵液對植物病原菌的抑菌活性 以不同植物病原菌為指示菌，測定發酵液對各病原菌的抑菌圈大小，結果（表3）表明AF1發酵液對大部分試驗菌株有強抑菌活性，特別是柑橘綠霉和棉立枯等菌效果明顯。

2.2 不同培養基發酵液對SA46的抗菌活性

把AF1接種6種不同的培養基進行發酵，以耐藥金葡菌SA46為病原指示菌，分別測定每種發酵培養基發酵液的抑菌圈大小，結果如表4所示。AF1在LB發酵培養基①中不能產生抗SA46活性物質，同時把發酵培養基中的馬鈴薯換成淀粉后培養基⑤也不能產生抗菌活性，所以肯定馬鈴薯汁中的某些成分是抗菌化合物的合成的必要成分。另外在發酵培養基中加入NaCl的培養基⑥無抗菌活性，可見NaCl的添加抑制了活性化合物的生成。

2.3 AF1發酵液活性穩定性

2.3.1 pH值對發酵液活性的影響 對AF1發酵液抗SA46活性的pH穩定性研究結果（圖1）表明，發酵液在pH 2.0-9.0放置120 min均穩定，抗菌活性保留95%以上，只有pH 11.0活性有所下降，但也保持在85%以上。

2.3.2 溫度對發酵液活性的影響 在不同溫度下處理AF1發酵液后，測定其抗SA46活性，發現在4-80℃，經過120 min后抗菌活性仍保持95%以上，只有100℃煮沸后，活性有所下降，但也有原活性的80%（圖2）。

表2 AF發酵液對不同病原細菌的抗菌活性

表3 AF1發酵液對不同植物病原真菌的抗菌活性

表4 不同培養基發酵液對SA46的抗菌活性

圖1 不同pH值對發酵液活性的影響

圖2 溫度對發酵液活性的影響

2.3.3 蛋白酶對發酵液活性的影響 用蛋白酶K處理AF1發酵濾液2 h后，其抗SA46活性保持不變（圖3），可見發酵液中的抗SA46活性物質為非蛋白類化合物，或者化合物中不包含脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵；用胃蛋白酶處理AF1發酵上清液后，抑菌活性也沒有降低，可見發酵液中的抗菌化合物為非蛋白類化合物，或者其不含疏水殘基肽鍵；用胰蛋白酶處理后，活性也無降低，說明發酵液中的抗菌化合物為非蛋白類化合物，或者不含有賴氨酸、精氨酸。因此，AF1發酵液具有非常好的蛋白酶穩定性。

2.4 AF1發酵液對MRSA抗菌機理

圖3 不同蛋白酶對發酵液活性的影響

2.4.1 最低抑菌濃度 由表5可知，稀釋倍數為2和4的處理組處理6 h后與其初始相比，OD630值有所下降，但從稀釋倍數8開始直到256倍，與其初始相比，OD630值開始有所上升，并且隨著稀釋倍數增加到256時，OD630值上升非常明顯，增加了16.22%，而陰性對照CK1上升了32.34%。與初始值相比，把OD630值未有顯著變化的最小濃度定義為AF發酵濾液對該菌的最低抑菌濃度，因此選擇稀釋倍數為4的AF1發酵液濃度為最低抑菌濃度MIC。

表5 AF1發酵液最低抑菌濃度實驗（n=3，x-±s）

2.4.2 發酵液對耐藥金葡菌SA46菌株細胞壁的影響 通過革蘭氏染色鏡檢觀察發現（圖4），不加AF1發酵液處理的正常SA46為紫色葡萄球狀，而經AF1發酵液處理后的SA46的菌株，細胞形態由原來的球狀變為長桿狀，且細胞體積明顯增大。由此說明，在AF1發酵液的最低抑菌濃度（MIC）下，SA46菌株細胞壁受到一定程度的破壞。

圖4 MRSA菌株細胞形態

采用透射電鏡法觀察，結果（圖5）表明，經AF1發酵液處理后的SA46菌株，出現了一些異形（桿狀）菌，并且這些菌的細胞壁出現凹凸不平的松散狀，進一步驗證了耐藥金葡菌SA46在AF1發酵液的作用下，細胞壁受到破壞。

圖5 SA46菌株透射電鏡圖

2.4.3 發酵液對耐藥金葡菌SA46菌株基因組DNA和蛋白質滲漏的影響 采用瓊脂糖凝膠電泳分析，SA46菌株經MIC濃度下的AF1發酵液作用后的DNA滲漏情況。結果如圖6，用生理鹽水處理的對照組SA46和AF1發酵液樣品均沒有條帶出現，而實驗組的SA46的DNA條帶卻很清晰。

SDS-PAGE凝膠電泳（圖7）顯示，用MIC濃度的發酵液處理的實驗組有大量明顯的蛋白質條帶，而用生理鹽水處理的對照組的SA46卻無任何條帶出現，而AF1發酵液樣品出現少量蛋白質條帶。

綜上證明，試驗組處理時其細胞壁遭到破壞，導致胞內DNA和蛋白質滲漏。因此，進一步推斷AF1發酵液對耐藥金葡菌SA46的抗菌機理是破壞病原菌的細胞壁來抑制細胞生長，其具體分子機制還有待進一步研究。

圖6 用AF1發酵液處理后的SA46的DNA電泳圖

圖7 用AF1發酵液處理后的SA46蛋白質電泳圖

3 討論

目前，對解淀粉芽孢桿菌研究主要集中在生防領域，用于植物病原真菌和細菌的防治［22，23］。近年來，隨著進一步深入研究，其作為食品防腐劑和益生菌開發也在不斷受到重視［24，25］。其抑菌物質主要包括3大類即多肽類、脂肽類及抑菌蛋白類，對植物病原真菌和細菌有較好抑制作用，但并未見文獻報道它們對MRSA有抑制作用。除了這3類化合物外，僅有幾篇文獻報道解淀粉芽孢桿菌還可以產生羊毛硫抗生素［26］、大環內酯類抗生素［27，28］、酚類化合物［29］及聚酮類抗生素［30］。除聚酮類外，其他3種均有對MRSA有抑制作用的報道。

本實驗中初步確定AF1產生的抗耐藥金葡菌SA46化合物并不是文獻報道的其他3種化合物即羊毛硫抗生素［26］、大環內酯類抗生素［27，28］和酚類化合物［29］。首先，根據AF1發酵液的抗SA46化合物的pH和熱穩定性研究結果表明，其pH和熱穩定性都非常好，與文獻［25］報道的羊毛硫抗生素相似，但經過發酵培養基篩選實驗，我們認為AF1發酵的抗MRSA化合物和文獻［25］報道的羊毛硫抗生素不是同一個化合物，因為文獻報道的羊毛硫抗生素化合物可以用LB培養基大量發酵生產，而我們的AF1菌經LB發酵以后，發酵液根本就沒有抗耐藥金葡菌SA46的活性；其次，由于大環內酯類抗生素化學性質不穩定，酸性條件下易發生苷鍵水解，堿性條件下內酯環易破裂，而根據上述實驗結果AF1發酵液在酸性和堿性均較穩定，因此AF1產生的抑菌物質也不是文獻所報道的大環內酯類化合物；最后，根據本實驗結果，AF1不能用LB培養基發酵產生抗SA46物質，培養基中NaCl的添加將完全抑制抗SA46物質的產生，這與Jeyanthi［29］報道的產生酚類抑菌化合物的培養基添加12%的NaCl有助于提高抗MRSA活性物的產量完全不同?？梢?，AF1菌產生的抗MRSA活性化合物也并非是文獻報道的酚類化合物。因此，初步推斷AF1菌發酵的抗MRSA化合物不是現有文獻報道的化合物，很可能是一種或多種新化合物。

隨著基因組、蛋白質組學和生物信息學迅猛發展和對微生物細胞結構與分子機制的深入認識，抗生素篩選靶點不斷涌現，增強了新型抗生素篩選的特異性、安全性和高效性。同時，在細胞壁、蛋白質生物合成和DNA復制與修復過程的傳統藥物靶點也找到不少新靶點，引起了研究者們的高度興趣［31］，尤其是對細菌細胞壁合成抑制劑的篩選。由于人體細胞無細胞壁，用于臨床的抗生素中，抑制細菌細胞壁合成的抗生素有很好的“選擇性毒性作用”，即對人體無毒或毒副作用甚微。因此，篩選抑制細胞壁合成的抗生素最具有實用意義。

本實驗初步探討了AF1菌發酵液的抗菌機理，用AF1發酵液處理耐藥金葡菌SA46后，無論是對SA46的形態觀察，還是對SA46的蛋白質和DNA的滲漏情況檢測，均表明SA46經AF1發酵液處理后，其細胞壁遭到破壞。初步推斷AF1發酵液對MRSA的抗菌機理是破壞病原菌的細胞壁來抑制細胞生長。此外，AF1菌發酵的抗MRSA化合物很有可能是一種或多種作用于病原菌細胞壁的新化合物，其對人體毒害性較小，具有一定的研究價值。我們將對其抗菌化合物的分離純化、結構確證以及抗菌分子機制進行進一步的研究。

4 結論

經抗菌譜測定表明解淀粉芽孢桿菌AF1發酵液具有廣譜抗菌活性，尤其對臨床MRSA抗菌活性很強。AF1發酵液穩定性實驗表明AF1發酵液具有很好的溫度、pH和蛋白酶穩定性。臨床耐藥金葡菌SA46經AF1發酵液的最低抑菌濃度（MIC）處理后，用顯微鏡和透射電鏡觀察，均發現其細胞壁受到不同程度的破壞；同時采用SDS-PAGE和瓊脂糖凝膠電泳分析，SA46的DNA和蛋白質發生滲漏。初步推斷AF1對MRSA的抗菌機理是破壞病原菌的細胞壁來抑制細胞生長。

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（責任編輯 朱琳峰）

Antimicrobial Activity and Anti-MRSA Mechanism of the Fermentation Broth of Bacillus amyloliquefaciens AF1

YANG Yan-hong YU Ying HU Yong-qiang YU Xi LI Qing-qing
（School of Pharmacy & Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054）

This study aims to measure the antimicrobial spectrum of fermentation broth of Bacillus amyloliquefaciens AF1 and to explore the activity stability and mechanism of anti-MRSA，for providing an experimental basis in seeking new anti-MRSA compounds. The drugresistant S. aureus SA46 was used as indicating pathogen，the rest antimicrobial activities of AF1 fermentation broth were detected after it was dealed with different pH，temperatures and proteases. The antmicrobial mechanism was studied preliminarily by observing the morphologic change of SA46 tread with AF1 fermentation broth under both optical microscope and transmission electron microscope，and by detecting the protein and DNA leakage of treated SA46 with AF1 fermentation broth with SDS-PAGE and agarose gel electrophoresis. The results showed that AF1 fermentation broth had a broad antimicrobial spectrum. It presented a strong inhibitory ability to all tested clinical drug-resistant Staphylococcus aureus，common clinical Escherichia coli and S. aureus；also it inhibited the most of the tested phytopathogen. The antimicrobial activity of AF1 fermentation broth remained more than 95% in pH 2.0 - 9.0 for 120 min from 4 to 80℃，and it was stable when adding protease K，pepsin and trypsin into the broth respectively. The cell walls of SA46 treated by AF1 fermentation broth（MIC）were destroyed at varied level while observed under both optical microscope and transmission electron microscope. Furthermore，the leakage of protein and DNA of treated SA46 with AF1 fermentation broth were checked by SDS-PAGE and agarose gel electrophoresis. The electrophoretic bands of experimental groups were clear，while there was no bands in control groups on both DNA and protein electrophorograms. Thus，a preliminary deduction was that the cell walls of MRSA were damaged by AF1 fermentation broth. In conclusion，B. amyloliquefaciens AF1 might be developed as a potential new source for the novel anti-MRSA medicines.

Bacillus amyloliquefaciens；antimicrobial spectrum；anti-MRSA；cell wall

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0312

2017-04-18

重慶市自然科學基金項目（cstc2014jcyjA0211）

楊艷紅，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源與天然產物的研究與開發；E-mail：yyh@cqut.edu.cn