3-（4-羥基苯基）丙酸在釀酒酵母中的生物合成

江晶潔莊以彬殷華劉濤劉少偉

（1. 華東理工大學(xué)，上海 200237；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

3-（4-羥基苯基）丙酸在釀酒酵母中的生物合成

江晶潔1莊以彬2殷華2劉濤2劉少偉1

（1. 華東理工大學(xué)，上海 200237；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

3-（4-羥基苯基）丙酸（HPPA）是一種芳香類化合物，作為中間體主要應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化學(xué)領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟價值。旨在實現(xiàn)HPPA在釀酒酵母中的從頭合成，通過在釀酒酵母中過表達(dá)約氏黃桿菌來源的酪氨酸轉(zhuǎn)移酶（FjTAL）、擬南芥來源的對香豆酰輔酶A連接酶（At4CL），同時利用釀酒酵母BY4742自身來源的超長鏈烯酰輔酶A還原酶（ScTSC13）、硫酯水解酶，實現(xiàn)了在釀酒酵母中從頭合成HPPA，產(chǎn)量約為70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸為前體、半乳糖誘導(dǎo)FjTAL過表達(dá)、30℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h的條件下，約36%的酪氨酸轉(zhuǎn)化生成對香豆酸；在以4 mmol/L 對香豆酸或咖啡酸為前體，半乳糖誘導(dǎo)At4CL過表達(dá)，同時利用酵母內(nèi)源ScTSC13、硫酯水解酶，30℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h的條件下，約94% 的對香豆酸被還原成HPPA，約91% 的咖啡酸被還原成3，4-二羥基苯丙酸（DHPPA），為進(jìn)一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基礎(chǔ)。

釀酒酵母；3-（4-羥基苯基）丙酸（HPPA）；生物合成；酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；對香豆酰輔酶A連接酶

3-（4-羥基苯基）丙酸，英文名稱3-（4-Hydroxyphenyl）propionic acid（HPPA），是藥物（如鹽酸西曲酸酯、鹽酸艾司洛爾）［1，2］，天然產(chǎn)物（如楊梅醇、根皮素）的重要中間體［3，4］，也是一些生物降解材料的基本骨架［5］，存在于鐵皮石斛、小葉榕等植物中［6，7］。目前，HPPA主要通過化學(xué)方法合成，如以苯酚為起始原料，在催化劑三氯化鋁的作用下，與丙烯腈反應(yīng)生成3-（4-）羥基苯丙腈，再通過水解得到化合物HPPA［8］。然而，化學(xué)合成方法產(chǎn)率低，成本高，反應(yīng)條件復(fù)雜且難于控制，容易造成環(huán)境污染。利用微生物合成HPPA將會有效的避免化學(xué)合成中復(fù)雜條件的控制以及環(huán)境污染等問題［9］。之前已經(jīng)有報道在大腸桿菌中合成HPPA［10］。然而在酵母中合成HPPA尚未見報道。酵母菌作為公認(rèn)的食品安全菌株，具有遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)簡單，生長迅速，培養(yǎng)成本低，易于大規(guī)模化液體發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)勢，被廣泛地應(yīng)用于生物合成研究中［11］。

對香豆酸（p-coumaric acid），是苯丙氨酸次級代謝途徑中的重要中間體。在植物中，主要通過苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）催化苯丙氨酸生成對香豆酸［12］。在微生物大腸桿菌、釀酒酵母中，主要通過異源表達(dá)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAL），催化酪氨酸轉(zhuǎn)化生成對香豆酸［13，14］。本研究以釀酒酵母BY4742為出發(fā)菌株，引入約氏黃桿菌來源的酪氨酸轉(zhuǎn)移酶（FjTAL）［15］、擬南芥來源的對香豆酰輔酶A連接酶（At4CL）［13］以及釀酒酵母自身來源的超長鏈烯酰輔酶A還原酶（ScTSC-13）［16，17］、硫酯水解酶（Acyl-CoA thioesterase），以實現(xiàn)HPPA在釀酒酵母中的從頭合成，為生物合成高價值的HPPA衍生物奠定基礎(chǔ)。本研究所構(gòu)建的合成途徑如圖1所示。

圖1 3-（4-羥基苯基）丙酸的生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α和釀酒酵母BY4742均由本實驗室保存，DH5α用于質(zhì)粒擴增和基因克隆，釀酒酵母BY4742用于蛋白的過表達(dá)及HPPA的合成。pESC-LEU，pESC-URA是酵母表達(dá)載體，分別具有2μ復(fù)制起始點，半乳糖誘導(dǎo)的GAL1/10雙向誘導(dǎo)型啟動子，購于Novagen公司。1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 Phusion超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs（NEB）公司；限制性內(nèi)切酶Sal I、Hind III、BamH1、Xho I以及T4連接酶均購于Fermentas公司；對香豆酸、咖啡酸、3-（4-羥基苯基）丙酸（HPPA）、3，4-二羥基苯丙酸（DHPPA）的標(biāo)準(zhǔn)品購于南京廣潤生物化學(xué)有限公司。

YPD培養(yǎng)基：1% 酵母膏（Yeast Extract），2%蛋白胨（Peptone），2% 葡萄糖（Glucose），若制固體培養(yǎng)基，加入2% 瓊脂粉（Agarpower）；SC-1培養(yǎng)基：0.67% 無氨基酵母氮源（YNB，Yeast Nitrogen Base），0.2% Dropout mix，2% 葡萄糖（Glucose）；SC-2培養(yǎng)基：0.67% 無氨基酵母氮源（YNB，Yeast NitrogenBase），0.2% Dropout mix，2% 半乳糖（Galactose）。

1.2 方法

1.2.1 基因擴增 At4CL（GenBank：KX817185.1）來自植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），以擬南芥全長cDNA為模板，PCR引物為At4CL-5FPBamHI：CGCGGATCCATGGCGCCACAAGCAGTT（下劃線為BamHI酶切位點），At4CL-3RP-xhoI：CCGCTCGAGTCACAATCCATTTGCTAG（下劃線為XhoI酶切位點），PCR擴增At4CL基因片段被克隆到載體pESC-URA質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒pESC-URAAt4CL。PCR參數(shù)：預(yù)變性95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min共30個循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min；凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 基因擴增 FjTAL（Genpet：WP_012023194.1）來自約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae），由上海捷瑞公司合成，為了在釀酒酵母使用對FjTAL基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，命名為FjTALsyn來表示。合成的基因片段被克隆到pUC19載體上，由捷瑞公司構(gòu)建成載體pUC19-FjTALsyn。用此質(zhì)粒作PCR模板；PCR引物為FjTALsyn-5FP-SalI：GCGGTCGACATGAATACTATTAATGAA（下劃線為SalI酶切位點），F(xiàn)jTALsyn-3RP-HindⅢ：CCCAAGCTTTTAATTATTAATCAAATG（下劃線為HindⅢ酶切位點）。PCR程序：預(yù)變性95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min共30個循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min；凝膠電泳回收目的片段。

1.2.3 質(zhì)粒及重組菌構(gòu)建 以限制性內(nèi)切酶BamH1和XhoI對質(zhì)粒pESC-URA和At4CL分別進(jìn)行酶切；通過凝膠電泳回收載體及基因片段，以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pESC-URA-At4CL。以限制性內(nèi)切酶SalI和HindⅢ 對質(zhì)粒pESC-LEU和FjTALsyn分別進(jìn)行酶切；凝膠電泳回收載體及基因片段后再進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pESCLEUFjTALsyn。利用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母［18］，分別轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pESC-LEU，pESCLEU-FjTALsyn，pESCURA，pESC-URA-At4CL，pESC-LEU & pESC-URA，pESCLEU-FjTALsyn& pESC-URA-At4CL至釀酒酵母菌BY4742（BL100），獲得重組菌BL101，BL102， BL103，BL104，BL105，BL106。

1.2.4 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取重組菌株單克隆于3 mL的液體SC-1培養(yǎng)基中（含葡萄糖2%），30℃培養(yǎng)16 h；按體積比1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL的液體SC-1培養(yǎng)基中，30℃ 培養(yǎng)48 h；3 000 r/min 離心5 min，收集菌體，加入50 mL SC-2發(fā)酵培養(yǎng)基（含半乳糖2%）進(jìn)行重懸，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h并在此培養(yǎng)過程中進(jìn)行取樣分析。

1.2.5 對香豆酸及其衍生物的LC-MS分析鑒定 收集SC-2 發(fā)酵液1 mL，12000 r/min，離心10 min取上清進(jìn)行檢測。LC-MS檢測系統(tǒng)配有紫外檢測器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI例子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質(zhì)譜儀。液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測波長為201 nm；流動相 A= H2O（含0.1%甲酸），B=100 % 甲醇；流速 = 1 mL/min，檢測條件為：0-5 min 5% B，40 min 5% B到 100 % B（線性梯度）；進(jìn)樣量20 μL；ESI負(fù)離子源，分子量掃描范圍50-800。

2 結(jié)果

2.1 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶FjTAL在重組菌BL102中的生物轉(zhuǎn)化活性研究

對重組菌BL102進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，添加4 mmol/L外源酪氨酸，取72 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果（圖2-A）顯示，在29.3 min處有新化合物的產(chǎn)生，與對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時間（Rt）一致。對香豆酸的分子量為164，LC-MS檢測結(jié)果（圖2-B）顯示29.3 min峰的［M+H］+= 165，確定該峰對應(yīng)的化合物為對香豆酸（1）。在發(fā)酵24 h、48 h、72 h進(jìn)行取樣，測定產(chǎn)物對香豆酸生成量。結(jié)果（圖2-C）顯示隨著發(fā)酵時間的延長，對香豆酸產(chǎn)量逐步增加，72 h時產(chǎn)量達(dá)到237.5±3.3 mg/L，酪氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到36.2±0.5%。

2.2 對香豆酸、咖啡酸在重組菌BL104中的生物轉(zhuǎn)化

圖2 酵母菌BL101，BL102發(fā)酵液HPLC檢測及LC-MS結(jié)果

對重組菌BL104進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，添加4 mmol/L外源對香豆酸，取72 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果（圖3-A）顯示，在29.3 min處的對香豆酸（1）基本全部被轉(zhuǎn)化，而在27.5 min 處有新化合物的產(chǎn)生，與HPPA的標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時間（Rt）一致。HPPA的分子量為166，LC-MS檢測結(jié)果（圖3-B）顯示27.5 min峰的［M+H］+= 167，確定該峰對應(yīng)的化合物為HPPA（2）。在發(fā)酵24 h、48 h、72 h進(jìn)行取樣，測定產(chǎn)物HPPA生成量。結(jié)果（圖3-C）顯示隨著發(fā)酵時間的延長，HPPA產(chǎn)量逐步增加，72 h時產(chǎn)量達(dá)到624.8±7.9 mg/L，對香豆酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.1±1.2%。以同樣的方法培養(yǎng)菌株BL104，添加4 mmol/L咖啡酸（3），取72 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果（圖4）顯示，72 h時DHPPA產(chǎn)量達(dá)到665.4±8.7 mg/L，咖啡酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.4±1.2%。

圖3 酵母菌BL103，BL104發(fā)酵液（添加4 mmol/L對香豆酸）HPLC檢測及LC-MS結(jié)果

圖4 酵母菌BL103，BL104發(fā)酵液HPLC檢測及LC-MS結(jié)果

2.3 在重組菌BL106中實現(xiàn)化合物HPPA的從頭合成

圖5 酵母菌BL106發(fā)酵液HPLC檢測與分析

對重組菌BL106進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取72 h發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果（圖5-A）顯示，在29.3 min、27.5 min處有兩個新峰，分別與對香豆酸（1）、HPPA（2）的標(biāo)準(zhǔn)品保留時間（Rt）一致，LC-MS檢測結(jié)果顯示29.3 min峰的［M+H］+= 165，27.5 min峰的［M+H］+= 167，確定兩個峰對應(yīng)的化合物分別為對香豆酸（1）、HPPA（2）。在發(fā)酵12、24、36、48、60和72 h進(jìn)行取樣，測定產(chǎn)物HPPA生成量。結(jié)果（圖5-B）顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，HPPA產(chǎn)量逐步增加，72 h時產(chǎn)量達(dá)到70.1±0.2 mg/L。按照以上條件發(fā)酵培養(yǎng)BL106菌株，同時添加4 mmol/L酪氨酸前體，在發(fā)酵12、24、36、48、60和72 h進(jìn)行取樣，測定產(chǎn)物HPPA生成量。結(jié)果（圖5-C）顯示，HPPA產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增加，72 h后產(chǎn)量達(dá)到155.3±2.3 mg/L。

3 討論

本研究在釀酒酵母BY4742中表達(dá)了來自擬南芥的對香豆酸輔酶A連接酶（At4CL）基因，約氏黃桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（FjTAL）基因，同時利用釀酒酵母內(nèi)源酶，首次實現(xiàn)了在釀酒酵母中從頭合成HPPA，產(chǎn)量達(dá)到70 mg/L。在釀酒酵母中，HPPA的合成路徑及其相關(guān)的酶尚未鑒定清楚［19］，推測HPPA是由對香豆酸轉(zhuǎn)化生成的。

近年來，Michael Eichenberger等［16，17］在釀酒酵母中合成二氫查耳酮類化合物的研究中，利用酵母內(nèi)源ScTSC13，植物來源的二氫查耳酮合酶（CHS）合成根皮素。其中，ScTSC13是酵母細(xì)胞膜依賴的脂肪酸鏈延長系統(tǒng)中催化反式-2-稀酰-輔酶A雙鍵還原的酶，對香豆酰輔酶A含有a，β-稀酰-輔酶A基團，由此推測ScTSC13催化對香豆酰輔酶A生成3-（4-羥基苯基）丙酰輔酶A。以對香豆酸為前體，在釀酒酵母中異源表達(dá)4CL，CHS合酶基因，實現(xiàn)了根皮素的生物合成，并初步確定了ScTSC13對對香豆酰輔酶A的催化活性。

本研究在釀酒酵母中異源表達(dá)At4CL的條件下，添加4 mmol/L外源對香豆酸，發(fā)酵結(jié)果顯示，對香豆酸幾乎全部轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物HPPA。推測其合成路徑是：（1）對香豆酸在At4CL的作用下生成對香豆酰輔酶A；（2）對香豆酰輔酶A利用ScTSC13還原生成3-（4-羥基苯基）丙酰輔酶A；（3）3-（4-羥基苯基）丙酰輔酶A在內(nèi)源硫酯酶的作用下水解生成HPPA與游離的輔酶A。除了對香豆酸之外，咖啡酸在At4CL存在的條件下，也能被酵母菌轉(zhuǎn)化生成DHPPA，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到90%以上，為后續(xù)研究ScTSC13的底物寬泛性提供了良好的基礎(chǔ)。目前，途徑中的內(nèi)源硫酯酶還尚未鑒定。在酵母中存在多種酰基輔酶A硫酯酶，包括脂肪酸代謝途徑中已鑒定的YJR019C［20］、Pte1p［21］，均有可能水解3-（4-羥基苯基）丙酰輔酶A生成HPPA與游離的輔酶A，有待進(jìn)一步的探索與研究。

4 結(jié)論

本研究在釀酒酵母中表達(dá)了約氏黃桿菌及擬南芥來源的兩個外源基因，同時利用酵母內(nèi)源超長鏈烯酰輔酶A還原酶、硫酯水解酶，首次實現(xiàn)了在釀酒酵母中從頭合成HPPA。通過前體添加實驗，對HPPA生物合成途徑中關(guān)鍵酶的生物轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了分析，HPPA產(chǎn)量得到顯著提高。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Biosynthesis of 3-（4-Hydroxyphenyl）Propionic Acid in Saccharomyces cerevisiae

JIANG Jing-jie1ZHUANG Yi-bin2YIN Hua2LIU Tao2LIU Shao-wei1
（1. College of Biotechnology，the State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237；2. Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

3-（4-Hydroxyphenyl）propionic acid（HPPA）is an aromatic compound with importantly economic value，because it is an intermediate mainly used in medicine，food and chemical industry. In this work，we aim to achieve the De novo synthesis of HPPA in Saccharomyces cerevisiae，and it was conducted via overexpressing a tyrosine ammonia-lyase from Flavobacterium johnsoniaeu（FjTAL）and a p-coumaroyl-CoA ligase from Arabidopsis thaliana（At4CL），as well as using super long-chain enoyl-CoA reductase（ScTSC13）and acyl-CoA thioesterases from S. cerevisiae BY4742. The yield of HPPA reached 70 mg/L. Bioconversion rate of tyrosine into p-coumaric acid was 36% under the condition of 4 mmol/L tyrosine enhancement in shake flask after 72 h fermentation at 30℃ and galactose inducing FjTAL overexpression. While in the recombinant S. cerevisiae overexpressing At4CL combined with enzymes ScTSC13 and acyl-CoA thioesterases，94% of 4 mmol/L p-coumaric acid was converted to HPPA in shake flask after 72 h fermentation at 30℃，and 91 % of 4 mM caffeic acid was converted to DHPPA. This work laid a foundation for the biosynthesis of HPPA and its derivatives.

Saccharomyces cerevisiae；3-（4-hydroxyphenyl）propionic acid；biosynthesis；tyrosine ammonia-lyase；p-coumaroyl-coA ligase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0208

2017-03-19

國家自然科學(xué)基金資助項目（31400026，21302214），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）（2012CB721100）

江晶潔，女，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：jiang_jjie@tib.cas.cn

劉少偉，男，博士，研究方向：食品科學(xué)；E-mail：swliu@ecust.edu.cn