菌絲霉素MP1106融合蛋白的復性及純化方法

王鵬舉 譚煥波 蘇文成 張文宇 鄒培建

（中國科學院天津工業生物技術研究所 工業酶國家工程實驗室，天津 300308）

菌絲霉素MP1106融合蛋白的復性及純化方法

王鵬舉 譚煥波 蘇文成 張文宇 鄒培建

（中國科學院天津工業生物技術研究所 工業酶國家工程實驗室，天津 300308）

旨在建立高效、快捷的菌絲霉素衍生物MP1106大腸桿菌表達系統。通過基因融合的方式構建生物表面活性劑-菌絲霉素衍生物（DAMP4-MP1106）融合蛋白表達載體，在大腸桿菌中進行表達；并對目的蛋白MP1106進行分離純化和分子內二硫鍵鑒定。結果顯示，融合蛋白DAMP4-MP1106在大腸桿菌中以包涵體的形式成功表達，表達產物在變性條件下經Ni2+-NTA親和層析純化；經檢測分析，搖瓶中DAMP4-MP1106的發酵產量為118 mg/L，純度為94.7%；采用96孔板篩選并建立復性方法，獲得水溶性融合蛋白DAMP4-MP1106；并經TEV蛋白酶酶切以及二次Ni2+-NTA親和層析純化，可獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，回收率達到了38.4%。通過簡捷方法快速鑒定分子內的二硫鍵，初步證實了抗菌肽MP1106完成了分子內結構正確折疊。建立了高效快捷的菌絲霉素大腸桿菌表達系統。

抗菌肽；菌絲霉素；蛋白融合；復性；蛋白純化

菌絲霉素是第一例被報道的真菌防御素，其抗菌機制清晰，藥物代謝動力學研究透徹，對人的細胞無毒害作用，且能通過微生物重組制備，還可借助已經解析的三維結構對其抗菌活性進行改造提升［1-3］。鑒于此，菌絲霉素被公推為最具有臨床應用潛力的三大抗菌肽之一［4］。

菌絲霉素與細菌細胞壁前體Lipid II以1∶1的化學計量結合，阻止病菌細胞壁的形成，從而阻止病菌繁殖。獨特的作用機制促使了菌絲霉素不易誘導產生耐藥性菌株［5］。NMR三維結構分析顯示，G6、W8、D9、A31、K32、G33、G34、F35、V36和C37這10個殘基參與了菌絲霉素與Lipid II中的焦磷酸鹽形成氫鍵［5］。菌絲霉素的作用機制明晰，為其進一步功能性改造優化奠定了理論基礎［5］。Schneider 等［5］通過單點飽和突變實驗，證實了D12、Y29和G33對菌絲霉素的功能至關重要，不能更改替換；A31和K38僅能做同類氨基酸替換，即：A31-G；K38-R。有趣的是，張琪等［6］通過易錯PCR定向進化菌絲霉素，獲得了抑菌活性增強的突變體A31R。Cao等［7］將菌絲霉素氨基酸序列進行替換改造（D9-S、D11-K、Q14-H和V36-I），將正電荷氨基酸和疏水氨基酸比例提高，獲得了抗菌活力增強的菌絲霉素衍生物MP1106。除此之外，菌絲霉素改造后的類似物NZ2114、AgPlectasin（rAgP）和MP1102對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較高的專一性，抗菌效果等同于甚至優于現有的青霉素和萬古霉素［8-10］。

從原始真菌中提取或化學合成菌絲霉素均面臨著工藝復雜、產率低或成本高等問題。已有多個學者對構建基因工程菌生產菌絲霉素進行了研究，包括原核表達和真核表達。Wang［9，11-13］實驗室利用畢赤酵母表達系統重組制備了菌絲霉素及其衍生物，產量達到了克級每升，為其產業化奠定了堅實的基礎，但其穩定性和半衰期較差，無法滿足實際應用需求。與此同時，Zhang［14］團隊使用大腸桿菌表達系統，將菌絲霉素與Trx-tag融合表達，經Factor Xa酶切，酶切效率較低，搖瓶發酵得到3.5 mg/L純菌絲霉素，產率僅為理論得率的20%。Chen 等［15］系統研究了菌絲霉素與蛋白標簽TrxA、SUMO、Intein和GST融合表達，通過蛋白酶酶切將菌絲霉素與標簽蛋白分離，酶切不完全，菌絲霉素產量較低。Chen［16］實驗室采用大腸桿菌系統重組表達菌絲霉素，使用凝血酶酶切除去GST標簽蛋白，酶切效率較低，目標產物搖瓶發酵產量為1.6 mg/L。大腸桿菌作為實驗室常用的表達系統，具有培養周期短，操作簡便等優點，為了便于對菌絲霉素進行功能性改造升級，提高目標產物與標簽蛋白的分離效率，急需建立一個針對菌絲霉素的高效的大腸桿菌重組表達系統。本研究首次擬將菌絲霉素衍生物MP1106與人工設計的生物表面活性劑DAMP4基因融合，使用大腸桿菌誘導表達，經包涵體復性純化，使用本實驗室制備的高活性煙草蝕紋病毒蛋白酶（Tobacco Etch Virus，TEV）酶切分割，純化制備出高純度抗菌肽MP1106，旨為菌絲霉素后續改造進化實驗建立高效、快捷的大腸桿菌表達系統平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 菌種E.coli BL21（DE3）和質粒pET-28a均保存于中國科學院天津工業生物技術研究所蛋白質工程實驗室。

1.1.2 試劑 卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）購自北京索萊寶科技有限公司；煙草蝕紋病毒蛋白酶由本實驗室重組制備；BCA蛋白定量試劑盒購買于北京康為世紀生物科技有限公司；目的基因MP1106通過中國科學院天津工業生物技術研究所技術支撐平臺全基因合成；Ni2+-NTA親和層析填料購買于美國GE公司；本實驗所使用的其它化學試劑均為分析純。1.2 方法

1.2.1 DAMP4-MP1106融合蛋白的基因設計與合成 據文獻報道［17-19］，將具有耐高溫（90℃，30 min）、溶解度高、可調控等特點的人工設計的生物表面活性劑DAMP4開發成重組蛋白純化制備的融合標簽，與MP1106氨基末端融合，并在DAMP4與MP1106中間插入TEV識別位點序列，蛋白純化后經TEV酶切，便可獲得抗菌肽MP1106。為了便于目的蛋白的Western-blot檢測和Ni2+-NTA純化，在DAMP4氨基末端融合了6個His殘基。最后將融合蛋白基因送至中科院天津工業生物技術研究所技術支撐平臺按照大腸桿菌表達系統進行密碼子優化和全基因合成，并采用EcoR I/Xho I將融合蛋白基因插入pET-28a表達載體。目的蛋白基因設計圖示及序列如圖1所示。

圖1 DAMP4-MP1106融合蛋白基因的設計及序列

1.2.2 DAMP4-MP1106融合蛋白的原核表達及加熱處理 將合成的質粒pET-28a（His6-DAMP4-TEVMP1106）轉化進E.coli BL21（DE3），使用TB培養基37℃培養OD至0.6。TB培養基配方如下：1.2%（W/V）tryptone；2.4%（W/V）yeast extract；0.4%（V/V）glycero；17 mmol/L KH2PO4；72 mmol/L K2HPO4。加入IPTG，終濃度為1 mmol/L，16℃過夜誘導表達。使用落地離心機4℃，5 000×g離心20 min，收集菌體。按照1∶10（W/V）使用高鹽緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，500 mmol/L Na2SO4，pH6.0）懸浮，90℃加熱30 min。4℃，12 000×g 離心40 min，使用SDS-PAGE（NuPAGEs Novex 4-12% Bis-Trisgels）電泳檢測上清和沉淀。

1.2.3 抗菌肽MP1106純化制備工藝 鑒于DAMP4-MP1106融合蛋白以包涵體的形式在宿主體內大量表達和積累，建立了抗菌肽MP1106的包涵體復性、純化制備工藝流程圖，如圖2所示。

圖2 抗菌肽MP1106的純化制備工藝

1.2.4 DAMP4-MP1106融合蛋白的純化制備 將離心收集到的菌體使用裂解緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；150 mmol/L NaCl；pH6.0）按照1∶10（W∶V）比例懸??；使用高壓勻漿破碎儀，700 bar破碎3個循環；使用落地離心機4℃，12 000×g 離心40 min分離上清和沉淀；使用等體積的2% Trition-X-100冰水溶液懸浮、洗滌沉淀；在裂解緩沖液中加入尿素，配置終濃度依次為3-8 mol/L的變性緩沖液，按照1∶5（W∶V）比例分別懸浮、溶解沉淀，4℃攪拌30 min；12 000×g 離心40 min分離上清和沉淀。使用SDS-PAGE對上述實驗流程中得到的樣品進行電泳檢測分析。

使用優化出來的變性劑尿素濃度溶解包涵體，高速離心，分離收集上清；與使用同樣緩沖液平衡后的Ni2+-NTA填料混合，4℃孵育1 h；轉入重力柱分離未結合的雜蛋白，加入5倍柱體積含有30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液進行洗滌；配制含有300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液，一次一個柱體積，洗滌4次。將上述每步收集到的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測分析，將含有DAMP4-MP1106融合蛋白且純度較高的洗脫液進行合并混合。

配置pH1-12的系列緩沖液（氯化鉀-鹽酸緩沖液：pH1、pH2；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：pH3、pH4、pH5、pH6、pH7；Tris-鹽酸緩沖液：pH8；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液：pH9；碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液：pH10；磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液：pH 11；氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液：pH12）。使用96孔板按照180∶20的比例使用系列pH的緩沖液10倍稀釋DAMP4-MP1106融合蛋白樣品，使用酶標儀測定每個樣品孔中的A310值。選取渾濁度最低的緩沖液作為復性緩沖液，將DAMP4-MP1106融合蛋白進行4℃過夜透析復性。

1.2.5 TEV酶切His6-DAMP4-TEV-MP1106融合蛋白 將45 mL DAMP4-MP1106融合蛋白水溶液與5 mL的10×TEV酶切緩沖液（500 mmol/L Tris-HCl；50 mmol/L EDTA；26 mmol/L β巰基乙醇；10 mmol/L DTT；pH8.0）混合，加入0.5 mL TEV蛋白酶，室溫酶切2 h。轉至4℃層析柜，在裂解緩沖液中透析過夜。按照上述Ni2+-NTA親和層析方法進行二次純化，去除His6-DAMP4標簽和TEV酶（氨基末端融合有His6標簽），得到高純度抗菌肽MP1106。1.2.6 抗菌肽MP1106分子內二硫鍵的鑒定 本研究通過在SDS-PAGE電泳制樣緩沖液中加入20 mmol/L DTT，破壞DAMP4-MP1106融合蛋白和抗菌肽MP1106分子內的二硫鍵，使其分子結構松散，SDS-PAGE電泳遷移率降低，表觀分子量變大，以此初步鑒定MP1106分子內的二硫鍵是否正確形成。

2 結果

2.1 DAMP4-MP1106融合蛋白的誘導表達及加熱處理

使用SDS-PAGE電泳檢測分析MP1106融合蛋白誘導表達情況，結果如圖3泳道3所示，25 kD和15 kD Mark條帶間有條明顯的誘導條帶，分子量和DAMP4-MP1106融合蛋白分子量（20.0 kD）相符。DAMP4-MP1106融合蛋白經高鹽高溫處理后，離心分離得到的上清和沉淀，SDS-PAGE電泳結果如圖3泳道4和泳道5所示，全部蛋白均存在于沉淀樣品中。

圖3 SDS-PAGE電泳檢測DAMP4-MP1106融合蛋白的誘導表達和加熱處理

將誘導后菌體進行高壓勻漿破碎，使用SDSPAGE電泳檢測分析DAMP4-MP1106融合蛋白可溶性表達情況。結果如圖4泳道4和泳道5，DAMP4-MP1106融合蛋白全都以包涵體形式存在，經Bio-Rad凝膠成像儀Quantify One軟件檢測分析，DAMP4-MP1106融合蛋白約占總蛋白23.3%。

2.2 DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體洗滌和溶解

選用2%的Triton X-100溶液洗滌DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，結果如圖4泳道6所示，部分雜蛋白被洗滌除去。

圖4 DAMP4-MP1106融合蛋白的純化制備

使用尿素濃度依次為3-8 mol/L的變性緩沖液分別溶解等量的DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，SDS-PAGE電泳檢測溶解上清，結果如圖5所示。隨著變性劑尿素濃度增高，對包涵體蛋白的溶解能力也逐漸提高，其中溶解雜蛋白的能力在尿素濃度6 mol/L和7 mol/L間有大幅度地提高。選用含有6 mol/L尿素的緩沖液溶解DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，進行后續純化。如圖4泳道7所示，DAMP4-MP1106融合蛋白純度提高到54.2%。

圖5 使用梯度濃度尿素變性溶解DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體

2.3 Ni2+-NTA親和層析純化制備DAMP4-MP1106融合蛋白

按照Ni2+-NTA親和層析方法對DAMP4-MP1106融合蛋白進行純化，圖4泳道8為未結合的雜蛋白流穿，圖4泳道9為低濃度咪唑（50 mmol/L）洗滌下來的結合不牢固或非特異性結合的雜蛋白，圖4泳道10為高濃度咪唑（500 mmol/L）洗脫下來的目的蛋白。純化后，DAMP4-MP1106融合蛋白純度達到了90.7%。

2.4 DAMP4-MP1106融合蛋白復興條件篩選

將DAMP4-MP1106融合蛋白的6 mol/L 尿素溶液使用pH1-12的緩沖液和超純水進行10倍稀釋，測定其A310值。結果如圖6所示，pH1-5的A310值較低，對應的DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度較高；pH5到pH6間A310值迅速升高，對應著DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度迅速降低；超純水溶液所對應的DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度也較低。鑒于此，本研究選用pH4的緩沖液透析DAMP4-MP1106融合蛋白進行蛋白復性，結果如圖4泳道11所示，軟件檢測分析，DAMP4-MP1106融合蛋白純度提高到94.7%。

圖6 MP1106融合蛋白的溶解度與pH的關系

2.5 蛋白酶TEV酶切His6-DAMP4-TEV-MP1106融合蛋白

將純化制備得到的水溶性DAMP4-MP1106融合蛋白使用TEV蛋白酶酶切，結果如圖7所示，泳道1為TEV蛋白酶，分子量約25 kD。泳道2為TEV蛋白酶室溫酶切2 h后的DAMP4-MP1106融合蛋白樣品，可清晰的看到DAMP4標簽蛋白（Mw約15.6 kD）和抗菌肽MP1106（Mw約4.4 kD），切割比較完全，并通過二次Ni2+-NTA親和層析純化制備抗菌肽MP1106，純度為99%。

2.6 重組抗菌肽MP1106純化小結

圖 7 TEV蛋白酶切DAMP4-MP1106融合蛋白

對整個純化過程中蛋白的純化和收率做了總結（表1），實驗過程中均采用BCA蛋白定量試劑盒測定每個樣品的蛋白含量，采用Bio-Rad凝膠成像儀Quantify One軟件檢測SDS-PAGE電泳圖，測定目的蛋白的純度。經純化復性，1 L培養物可以純化得到18 mg純度約99%的抗菌肽MP1106，按照抗菌肽MP1106的理論總產量，收率為38.4%。

2.7 MP1106分子內二硫鍵的鑒定

MP1106分子內含有3對二硫鍵，使用含或不含20 mmol/L DTT的SDS-PAGE電泳制樣緩沖液對DAMP4-MP1106融合蛋白和抗菌肽MP1106進行電泳檢測對比分析，結果如圖8所示。泳道1（未加入20 mmol/L DTT的DAMP4-MP1106融合蛋白）和泳道2（加入20 mmol/L DTT的DAMP4-MP1106融合蛋白）相比，20 mmol/L DTT僅引起DAMP4-MP1106融合蛋白電泳條帶稍微向上躍遷，差異不明顯。泳道3（未加入20 mmol/L DTT的MP1106）和泳道4（加入20 mmol/L DTT的MP1106）相比，20 mmol/L DTT引起MP1106電泳條帶明顯向上躍遷。

3 討論

前期文獻報道，DAMP4標簽蛋白具有在高鹽緩沖液中耐高溫的性能，已被開發成通用的小分子量蛋白或短肽的純化工具［17-19］。本研究按照文獻報道的方法，使用高鹽緩沖液懸浮菌體，并進行加熱處理，離心分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測分析顯示，DAMP4-MP1106融合蛋白和其它雜蛋白在加熱過程中全部變性沉淀，未達到純化效果。經分析推測，可能由于抗菌肽MP1106短肽對DAMP4結構域產生了影響，造成包涵體表達。

菌絲霉素的空間結構由3個結構域組成（N-末端Loop環、兩親性α-螺旋中心、C-末端為兩條反向平行的β-折疊），形成典型的CSαβ序。其中α-螺旋通過兩對二硫鍵與β-折疊的一條鏈穩定相連，而N-末端的Loop環則通過一對二硫鍵與β-片層的另一條鏈相連［5，20］。二硫鍵對蛋白質分子高級結構的穩定和生物學功能至關重要。有研究表明，蛋白分子內二硫鍵的形成，能使蛋白質分子的結構更加緊湊嚴密，表觀分子量變小，SDS-PAGE電泳條帶向下躍遷［21，22］。本研究中加入20 mmol/L DTT后，DAMP4-MP106和MP1106電泳條帶均有上移跡象，初步證明了MP1106分子內完成了二硫鍵的正確折疊。由于MP1106相對DAMP4分子量較小，故DAMP4-MP1106使用20 mmol/L DTT處理后，相對于MP1106電泳遷移率變化較小。

表1 MP1106純化過程中的得率和純度

圖8 MP1106分子內二硫鍵鑒定電泳圖

隨著生物技術的飛速發展，利用微生物重組制備抗菌肽成為一種經濟高效的方法?？茖W家們將菌絲霉素及其衍生物與蛋白標簽（TrxA、GST、His6、SUMO和Intein等）基因融合，并在中間預設蛋白酶識別位點，采用大腸桿菌表達系統重組表達，純化后經工具蛋白酶（Thrombin、Enterokinase、Factor Xa、SUMO和TEV等）酶切，獲得具有生物功能活性的菌絲霉素，但其發酵產量較低、蛋白酶切效果差、回收率低［14-16］。國內Wang課題組［9，11-13］利用畢赤酵母表達系統直接表達菌絲霉素及其衍生物多肽，發酵產量提高到克級每升，為其產業化奠定了堅實基礎。但仍面臨著一個世界性難題：菌絲霉素由于分子量小，易降解，體內半衰期短，藥效持久性差，抗菌活性有待進一步提高等，至今尚無產品入市［9，11-13］。本研究利用大腸桿菌系統表達DAMP4-MP1106融合蛋白，經蛋白復性、TEV酶切獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，酶切完全，回收率達到了38.4%，和已有研究報道相比，產量和回收率均得到了提高。菌絲霉素作為最具有應用前景的三大抗菌肽之一，作用機理清晰，對人體細胞無毒害作用［3］，將菌絲霉素應用到臨床，還需對其進行多方面功能性改造進化。所以，建立一個高效、快捷的菌絲霉素大腸桿菌表達系統對其功能性改造是至關必要的。

4 結論

實現了融合蛋白DAMP4-MP1106在大腸桿菌中的表達，并經蛋白復性、純化成功得到了目的蛋白抗菌肽MP1106。融合蛋白DAMP4-MP1106搖瓶發酵產量為118 mg/L，純度為94.7%。經蛋白酶TEV酶切和二次Ni2+-NTA親和層析，可獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，回收率達到了38.4%。通過簡捷快速鑒定蛋白分子內的二硫鍵，初步證實了抗菌肽MP1106完成了分子內結構正確折疊。

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（責任編輯 李楠）

Study on Refolding and Purification of Plectasin MP1106

WANG Peng-ju TAN Huan-bo SU Wen-cheng ZHANG Wen-yu ZOU Pei-jian
（National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

This work aims to establish an efficient and simple Escherichia coli expression system for the antimicrobial peptide，plectasin MP1106. The recombinant MP1106 fusion protein was obtained by genetic fusion with the artificially designed bio-surfactant，DAMP4. Then，the recombinant DAMP4-MP1106 was expressed in E. coli and the protein was isolated，moreover the formation of the disulfide bonds within the protein was identified. The results showed that the recombinant DAMP4-MP1106 was over-expressed in inclusion body. The protein was obtained by the Ni2+-NTA chromatography under the denature condition. The total yield of the fusion protein after the first chromatography was 118 mg/ L in flask and the purity was 94.7%. The refolding buffer condition was screened by 96-well plate and the soluble recombinant DAMP4-MP1106 was obtained by a refolding procedure. The soluble recombinant DAMP4-MP1106 was cleaved by TEV protease and further purified by another Ni2+-NTA column. The purity of final MP1106 was 99% and the recovery of the protein was 38.4%. The comparison of the behaviour of the plectasin derivative，MP1106 with the standard plectasin on electrophoresis indicated that the disulfide bonds in MP1106 were folded correctly. In conclusion，the established E. coli expression system for the plectasin derivative MP1106 was efficient and successful.

antimicrobial peptide；plectasin；protein fusion；refolding；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0287

2017-04-10

天津市科技支撐計劃重點項目（14ZC2DSY00057）

王鵬舉，男，碩士，研究方向：蛋白質工程；E-mail：wang_pj@tib.cas.cn

鄒培建，男，研究員，研究方向：蛋白質工程；E-mail：zou_pj@tib.cas.cn