黃瓜花葉病毒致病性研究進展

邱艷紅王超楠，2朱水芳

（1. 中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所，北京 100176；2. 中國農業大學植物保護學院，北京 100193）

黃瓜花葉病毒致病性研究進展

邱艷紅1王超楠1，2朱水芳1

（1. 中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所，北京 100176；2. 中國農業大學植物保護學院，北京 100193）

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）屬于正義單鏈RNA病毒，寄主廣泛，危害嚴重，是當前最具影響力的植物病毒之一，也是世界公認的重要植物病害。CMV自1916年報道以來，國內外學者從病毒基因、基因編碼產物以及與寄主相互作用等多個方面展開了大量研究。隨著高通量測序技術與蛋白質組學技術的發展，病毒相關致病機制也取得突破性進展。介紹了CMV編碼蛋白，CMV相關的衛星RNA以及寄主因子在CMV侵染植物后的癥狀發展過程中的作用，并對今后的CMV致病性研究進行了討論，旨為CMV的相關研究提供參考。

黃瓜花葉病毒；致病機制；小干擾RNA；蛋白互作

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員。對CMV的描述最早可以追溯到1916年，當時Doolittle和Jagger［1，2］同時報道了CMV可引起黃瓜和其它葫蘆科植物上的病害。目前，CMV分布在世界各地，特別是在溫帶和熱帶地區。CMV株系繁多，寄主廣泛，能夠侵染1 200多種植物，是禾谷類作物、牧草、木本和草本觀賞植物、蔬菜及果樹上發生最廣、危害最大的病害［3］。

CMV的基因組含有3條正義單鏈RNA（RNA1、RNA2和RNA3），共編碼5種蛋白（1a、2a、2b、MP和CP）。有些CMV除基因組RNA以外還攜帶非編碼的衛星RNA（Satellite RNA，satRNA）［4，5］。CMV侵染后可引起植株矮化（Stunt）、葉片畸形（Leaf malformation）以及花葉（Mosaic）等癥狀，研究表明這些癥狀的產生與CMV基因以及基因編碼產物均有相關性［4］。因而本文就黃瓜花葉病毒的相關致病因子以及參與病毒致病過程的寄主蛋白進行綜合闡述，旨在為黃瓜花葉病毒進一步研究提供參考意義。

1 CMV致病相關的病毒編碼蛋白

1.1 1a蛋白

1a蛋白由RNA1編碼，是病毒重要的復制酶組分，具備RNA依賴RNA聚合酶（RdRp）的活性，也是影響寄主癥狀的重要因子［5］。通過比較CMV的Fny株系（CMV-Fny）和CMV的Sny株系（CMVSny）在西葫蘆上的系統發病速度發現，RNA1不僅影響病毒的復制，而且影響病毒在細胞間移動及長距離運輸［6］。CMV-Ns株系能在多種煙草上引起系統性壞死反應，研究發現這與la蛋白的第461位半胱氨酸特性直接相關［7］。1a蛋白在第443位和第472位氨基酸之間有兩個兩親性的α螺旋結構，將第461位半胱氨酸突變為精氨酸或賴氨酸時影響了螺旋結構的完整性和兩親性，導致壞死反應的消失。而第461位半胱氨酸突變為丙氨酸或絲氨酸時并不改變1a蛋白的高級結構，因而不影響病毒在寄主上的壞死癥狀［8］。此外，1a蛋白的第865、896、957和980位氨基酸共同影響了病毒的胞間移動與復制，導致CMV-P1株系可以在含有抗性基因Cmr1的辣椒上進行系統侵染［9，10］。

1.2 2a蛋白

2a蛋白由RNA2編碼與1a蛋白共同完成病毒的復制，同時影響寄主癥狀的發展。Du等［11］發現將2a蛋白的C端缺失會降低病毒在寄主體內含量，減輕在煙草上的致病癥狀。Choi等［12］利用重組的方法證明2a蛋白和MP共同影響病毒在菠菜葉中的細胞間移動速率，進而影響癥狀發展。另外，2a蛋白還是引起細胞壞死反應的重要因子，該蛋白第631位氨基酸突變可導致在豇豆上的壞死反應消失［13，14］。

1.3 2b蛋白

2b蛋白由CMV的來源于RNA2的亞基因組RNA4A編碼。一方面2b蛋白作為基因沉默抑制因子（Viral suppressor of RNA silencing，VSR），保護病毒基因組不被降解，從而影響病毒的積累量，間接影響病毒的致病性［15］。另一方面，2b蛋白在抑制基因沉默介導的抗病毒通路的同時影響了寄主微小RNA（microRNA，miRNA）的代謝途徑，導致相關致病癥狀的產生［16，17］。轉CMV-Fny 2b蛋白的擬南芥表現出明顯的植株矮小等癥狀。進一步研究發現2b蛋白可以干擾寄主擬南芥中miR159的代謝途徑，影響miR159靶基因的轉錄，導致寄主癥狀的產生［17，18］。

此外，將CMV-Q的2b蛋白進行突變以后會導致病毒在煙草上的侵染癥狀延遲以及減弱，甚至導致該病毒不能在黃瓜上系統侵染，因而推測2b蛋白是通過影響病毒的系統移動而間接影響癥狀的發展［19］。Diaz-Pendon等［20］也發現CMV-Q的2b蛋白雖然影響了病毒在擬南芥中的系統侵染，然而卻不是癥狀發展所必須的。

1.4 MP蛋白

MP由病毒的RNA3編碼，負責病毒在細胞間的移動以及長距離運輸［5］。CMV-Fny侵染煙草以后會在系統葉上交替出現花葉和癥狀不明顯現象，而將MP的第51位的Asn和第240位Ile分別替換為Lys和Phe時系統葉將會一直保持花葉癥狀，進一步研究發現兩個氨基酸的替換會引起寄主體內MP的增加，因而推斷癥狀的交替出現跟病毒的運輸有很大關系［21］。然而，帶有同樣兩個氨基酸突變的病毒RNA侵染菠菜會影響病毒的系統移動［22］。說明MP的氨基酸突變對癥狀的影響具有寄主特異性。

1.5 CP蛋白

CP由病毒來源于RNA3的亞基因組RNA4編碼，在病毒的包裹、復制、細胞間移動以及長距離運輸中都起到非常關鍵的作用，也是病毒最重要的癥狀決定因子［23，24］。

CMV侵染后通常引起花葉癥狀，如CMV-M侵染煙草后可引起嚴重的黃白化癥狀，CMV-Fny侵染煙草后引起綠斑駁癥狀。研究證明花葉癥狀的產生與CMV的CP有直接相關性。Rao和Francki［25］利用假重組技術證實寄主出現的花葉癥狀由CMV的RNA3決定。Shintaku等［26］進一步將CMV-Fny和CMVM 的RNA3不同區域進行重組后發現，花葉癥狀由CP上第129位氨基酸（CP129）所決定。將CMV的pepo株系CP129突變為酸性氨基酸類、堿性氨基酸類、以及非極性氨基酸類等，然而并沒有發現氨基酸的極性與癥狀之間的關系［27］，說明CP129對CP的結構并沒有起決定性的作用。此外，從CP的三級結構上也可以看出，CP129并未裸露在CP的表面，只是αE-βEF環的第一個氨基酸，因而CP129的改變很有可能只是影響了該αE-βEF環的靈活性［28］。

花葉癥狀的產生通常伴隨著葉綠體相關代謝受損［29］。我們利用高通量測序技術分析CMV-M侵染煙草后不同階段的基因表達譜發現，大量與葉綠體相關的基因表達受抑制［30］。將CMV-pepo的CP129突變為不同氨基酸后可引發不同花葉癥狀，進一步研究發現不同花葉癥狀的葉片中其葉綠體相關基因的表達量也不同［31］。CMV侵染煙草后還可以引起6個蛋白不同程度的降解，其中光合系統II-放氧復合物降解最為明顯［32］。Di Carli［33］研究小組通過差異雙向凝膠電泳與質譜分析技術發現CMV侵染的野生型番茄與抗CMV的轉基因番茄蛋白表達模式不同，其中很多與光合作用相關的蛋白存在差異表達。病毒侵染后對葉綠體相關基因和蛋白的影響會進一步破壞葉綠體的結構。我們通過掃描電子顯微鏡觀察葉片的亞細胞結構時發現，CMV侵染所引起的黃白化葉片中葉綠體數量減少，而且葉綠體含有較少的類囊體膜［34］。此外，CMV侵染的煙草葉片中過氧化氫含量明顯升高［35］。Song等［36］的研究也發現CMV侵染干擾了葉綠體和線粒體的電子傳遞活性并影響其抗氧化系統，細胞器中過氧化氫的積累，導致細胞器的氧化脅迫。在植物體內，非原生質體、微體、線粒體和葉綠體均可以產生過氧化氫，其中葉綠體是過氧化氫的主要產生位點。而高濃度的過氧化氫對細胞有毒害作用。然而，過氧化氫的產生是否與葉綠體的電子傳遞干擾、葉綠體結構變化以及病毒侵染后植物的癥狀發展有關仍需進一步的研究論證。

2 CMV致病相關的衛星RNA

satRNA是一類非編碼的RNA分子，通常需要輔助病毒提供蛋白來完成復制、包裹、運動及傳播等過程［5］。satRNA對輔助病毒的致病性影響可分為3類：增強型、減弱或致弱型及不改變型。由于在復制過程中satRNA與輔助病毒的基因組RNAs形成競爭關系，因而會導致輔助病毒的基因組RNAs在寄主中的積累量降低，從而減輕病毒在寄主上的癥狀表現，但依然有少數satRNA能在煙草或者番茄上引起壞死［37］、花葉等癥狀［38，39］。然而，CMV-satRNA與番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）混合接種寄主植物時，TAV在寄主上的癥狀減輕，但TAV的基因組含量并沒有降低［40，41］。此外，CMV-satRNA與小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）共同侵染時，ZYMV的基因組含量反而增加［42］，因而satRNA的致病性是satRNA、輔助病毒和侵染寄主三者之間相互作用的結果［43］。

1982年，Gonsalves等［38］就發現WL2 satRNA可以引起西紅柿葉片的白化癥狀，并且葉片中葉綠素含量和胡蘿卜素含量下降非常明顯。在B5 satRNA侵染的番茄葉片中也發現了葉綠素含量降低現象［39］。直到2011年，科研人員發現CMV在侵染煙草過程中，其satRNA產生的小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）是引發葉片黃化癥狀的關鍵因子。病毒siRNA是植物DCL蛋白切割病毒雙鏈RNA而產生的一類約21-24 nt的RNA，是植物抗病毒免疫反應的重要中間產物［44］。然而，由于病毒siRNA與葉綠素合成基因（Chlorophyll biosynthetic gene，CHLI）的mRNA存在22 nt互補區域，因而隨著satRNA的siRNA產生，CHLI的mRNA會被降解，影響了葉綠素合成并導致煙草葉片的黃化癥狀［45，46］。此外，我們利用CMV-M侵染煙草的體系，獲得了大量病毒siRNA數據。通過與煙草基因組比對發現，CMV基因組的siRNA也可靶向煙草基因［47］。而病毒siRNA在CMV-M致病過程中的具體功能需要做進一步的研究。

3 CMV致病相關的寄主蛋白

由于病毒自身編碼蛋白有限，病毒進入植物細胞后會利用各種寄主資源完成其侵染過程。表1是目前已鑒定出的與CMV編碼蛋白互作的寄主蛋白。在CMV的復制過程中，1a蛋白首先錨定在液泡膜上或者液泡膜蛋白上。2a蛋白可通過N端126位氨基酸與1a蛋白進行互作，并定位在液泡膜上，利用寄主體內的其他蛋白協同完成病毒的復制。而當病毒完成復制以后，2a蛋白被磷酸化，停止與1a蛋白的互作，并游離在細胞質中，參與病毒的其它侵染過程［5］。利用酵母雙雜交技術已篩選到煙草的Tcoi1蛋白可以與1a蛋白的甲基轉移酶結構域進行互作，大量表達Tcoi1有利于CMV侵染，而降低Tcoi1的表達會抑制CMV侵染活性，推測該Tcoi1蛋白可以將病毒1a蛋白進行甲基化，從而幫助病毒完成復制與運輸過程［48］。煙草中的Tcoi2蛋白也可以與1a蛋白的甲基轉移酶結構域進行互作，而功能是將1a蛋白的甲基轉移酶結構域進行磷酸化，推測1a蛋白的磷酸化可能影響1a蛋白與2a蛋白或者其它寄主因子的互作［49］。此外，煙草BRP1（Bromodomain containing RNA binding Protein）蛋白與1a蛋白也存在互作，然而沉默BRP1后并不能完全抑制病毒的復制，推測該蛋白很可能是通過影響病毒復制復合物的穩定性而間接影響病毒復制［50］。從辣椒（Capsicum annuum ‘Bukang’）中還分離鑒定出與1a蛋白解旋酶結構域互作的甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase，FDH）和鈣網蛋白前體（Calreticulin-3 precursor，CRT3），在沉默FDH的煙草中病毒不能系統移動，而在沉默CRT3的煙草中病毒不能復制和系統侵染［51］。煙草所編碼的Tsip1蛋白與1a和2a蛋白均可以互作。在超表達Tsip1的煙草中病毒RNA的含量降低，而沉默Tsip1的植株中病毒含量持續增加，推測Tsip1蛋白可以通過與1a、2a蛋白形成復合物來直接影響病毒的復制［52］。煙草所編碼的calcineurin B-like互作蛋白激酶（NtCIPK12）可以與2a蛋白互作，并對2a蛋白進行磷酸化［53］，影響2a蛋白與1a蛋白的互作［54］。

Argonaute蛋白（AGO）是植物小RNA代謝通路中的重要因子。2b蛋白可以通過與擬南芥的AGO1和AGO4互作來影響其剪切活性，不僅干擾植物基因沉默抗病毒通路，同時干擾寄主體內miRNA代謝途徑［55-57］。除了發揮VSR功能以外，2b蛋白還是宿主吸引昆蟲媒介的誘導因子（A viral inducer of host attractiveness to insect vectors，VIA）。JAZ蛋白（Jasmonate ZIM-domain proteins）是茉莉酸信號通路中的重要抑制因子，2b蛋白通過與JAZ蛋白互作抑制該蛋白的降解，從而抑制茉莉酸信號通路并增強寄主植物對蚜蟲的吸引力［58］。此外，2b蛋白可以與擬南芥的過氧化氫酶（CAT3）互作并抑制其酶活性。由于CAT是過氧化氫的重要水解酶類，CAT活性受抑將導致過氧化氫含量積累以及細胞的壞死［59］。

CsAO4是黃瓜所編碼的，定位在細胞壁上的抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase）。病毒侵染后可誘發該蛋白在煙草體內的表達。將編碼該蛋白的基因敲除后可降低CMV在系統葉片上的積累，而將該蛋白進行過量表達后并沒有明顯增加CMV在系統葉上的積累，推測是該蛋白在病毒侵染早期，與MP一同協助病毒運輸至鄰近細胞［60］。

表1 與CMV編碼蛋白互作的主要寄主蛋白

4 結語

植物病毒致病的分子機制一直是植物病毒領域的研究熱點。利用酵母雙雜交（Yeast two hybrid，YTH）、雙分子熒光（Bimolecular fluorescence comp-lement，BiFC）及免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation，COIP）等技術已鑒定出多個參與CMV侵染的寄主蛋白。此外，利用轉錄組測序技術以及蛋白質組學研究發現大量參與病毒致病過程的寄主基因和蛋白，為進一步揭示CMV致病相關的分子機制奠定基礎。

隨著基因沉默介導的植物抗病毒免疫反應機制的研究，尤其CMV-satRNA的siRNA沉默寄主植物基因引發黃白化癥狀的發現，將植物病毒的siRNA參與病毒致病過程的研究推向熱點，也為植物病毒致病性研究開辟了新的研究領域。

雖然CMV的致病機制研究取得了很大進展，但關于CP及第129位氨基酸如何影響寄主癥狀的產生以及如何影響葉綠體結構和功能都有待進一步研究。此外，病毒基因組產生的siRNA如何靶標于寄主基因以及在致病過程中的作用仍需探究。

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（責任編輯 朱琳峰）

Research Advances on the Pathogenicity of Cucumber Mosaic Virus

QIU Yan-hong1WANG Chao-nan1，2ZHU Shui-fang1
（1. Institute of Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176；2. College of Plant Protection，China Agricultural University，Beijing 100193）

Cucumber mosaic virus（CMV）is the type member of single stranded RNA viruses. As it infects wide host species and induces serious symptoms，it has been considered as one of the most impact plant virus and also the severe plant disease in the world. Many domestic and overseas scholars have investigated extensively about the CMV genes，gene-encoded products and plant-virus interactions since it was reported in 1916. With the development of high-throughput sequencing technology and proteomic technology，the molecular mechanism of viral virulence has been made great progresses. In this review，we introduce the role of viral encoding proteins，its associated satellite RNA and host factors that are involved in the development of symptoms，and also discusse the further study on viral virulence of CMV，which will provide a useful reference for CMVrelated studies.

cucumber mosaic virus；pathogenic mechanism；small interfering RNA；protein-protein interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0278

2017-04-09

中國檢驗檢疫科學研究院基本科研業務費項目（2017JK035）

邱艷紅，女，助理研究員，研究方向：植物病毒學；E-mail：qiuyh@caiq.gov.cn

朱水芳，男，研究員，研究方向：植物病毒學；E-mail：zhusf@caiq.gov.cn