老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經細胞凋亡與caspase-3、-4表達的關系

李 力 李曉寧 張仁宇

(第四軍醫大學西京醫院神經內科，陜西 西安 710032)

老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經細胞凋亡與caspase-3、-4表達的關系

李 力 李曉寧 張仁宇

(第四軍醫大學西京醫院神經內科，陜西 西安 710032)

目的探討老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經細胞凋亡與信號傳導通路中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-4表達的關系。方法老年難治性顳葉癲癇患者21例為難治性顳葉癲癇組，術中均切除顳葉組織；選取同期因腦外傷入院行手術入路中必須切除的顳葉組織15例為對照組。免疫組化SP法檢測顳葉組織中神經細胞caspase-3、caspase-4陽性表達情況；Western印跡檢測顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白表達情況；TUNEL法檢測兩組神經細胞凋亡情況。結果免疫組化檢測顯示，難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4陽性細胞表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。Western印跡檢測顯示，難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)。對照組顳葉組織中僅存在少量TUNEL陽性神經細胞，難治性顳葉癲癇組中TUNEL陽性神經細胞數明顯增多。難治性顳葉癲癇組細胞凋亡指數明顯高于對照組(P<0.05)。結論老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中存在caspase-3、caspase-4傳導的神經細胞凋亡，同時caspase-3、caspase-4表達水平與神經細胞凋亡呈正相關。

難治性顳葉癲癇；信號傳導；細胞凋亡

癲癇引發神經元凋亡主要包括內源性和外源性兩種途徑。研究發現，內質網可能是細胞凋亡的另一場所，提出了內質網應激反應性凋亡途徑〔1〕。在不同的凋亡途徑中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族成員均起到重要作用，其中caspase-3是內源性和外源性途徑中共同的終末成分，發揮執行凋亡的作用〔2〕；caspase-4則與人內質網應激凋亡途徑密切相關〔3〕。本研究旨在探討難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經細胞凋亡情況及信號傳導通路中caspase-3、caspase-4陽性表達情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2016年5月第四軍醫大學西京醫院收治的老年難治性顳葉癲癇患者21例，術中切除顳葉組織。入選標準：①年齡≥60歲，接受手術治療，均行頭顱CT或磁共振成像(MRI)掃描；②先后單獨使用2種以上一線抗癲癇藥物且達到最大耐受劑量但治療仍無效，平均每月癲癇發作≥1次，連續超過6個月；③本次研究通過本院倫理委員會審查，入選患者均簽署知情同意書。男14例，女7例；年齡60～72歲，平均(64.05±3.51)歲；病程2～15年，平均(8.54±4.91)年；強直陣攣發作15例，復雜部分性發作4例，單純部分性發作、失神發作各1例。選取同期因腦外傷入院行手術入路中必須切除的顳葉組織15例為對照組，男9例，女6例；年齡60～70歲，平均(63.61±3.39)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2主要試劑 兔抗人caspase-3多克隆抗體、兔抗人caspase-4多克隆抗體(上海酶聯生物科技有限公司)，工作濃度1∶75；KIT-9710即用型免疫組織化學UltraSensitive TM SP試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)；原位細胞凋亡檢測試劑盒、DAB顯色試劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海百蕊生物科技有限公司)；GAPDH(碧云天生物技術研究所)。

1.3方法

1.3.1兩組caspase-3、caspase-4在神經細胞中的表達 采用免疫組化SP法檢測，以已知的陽性切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，操作按檢測試劑盒說明書進行，染色呈棕黃或棕黑色顆粒為陽性結果。caspase-3、caspase-4均定位于細胞質，先于低倍鏡視野下觀察切片總體表達情況，隨機選取5個完整視野并在高倍鏡視野下拍照。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量caspase-3、caspase-4的平均吸光度值。

1.3.2Western印跡檢測 RIPA蛋白裂解試劑盒提取兩組標本組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，取30 μg行PAGE，濕法轉移到PVDF膜，奶粉封閉后分別加入兔抗人caspase3、caspase4一抗(1∶1 000稀釋)和小鼠抗人GAPDH一抗(1∶3 000稀釋)，4℃孵化過夜，加入二抗(1∶3 000稀釋)后ECL顯色，用熒光圖像分析儀采集圖像。

1.3.3兩組神經細胞凋亡情況檢測 采用TUNEL法檢測，選擇顳葉組織中非壞死區，用已知的陽性切片為陽性對照，用不含TdT的液體替代TUNEL混合液為陰性對照。TUNEL陽性細胞呈棕褐色，表達于細胞核內并呈分散或成片分布，部分染色較深且呈橢圓形或圓形；部分染色不均勻，形態不規則。高倍鏡視野下拍照，使用圖像分析軟件計數陽性細胞數并計算陽性細胞率，取5個視野的均值為凋亡指數。

1.4統計學分析 使用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組顳葉組織神經細胞中caspase-3、caspase-4陽性表達情況 對照組顳葉組織神經細胞中存在caspase-3、caspase-4弱表達，難治性顳葉癲癇組caspase-3、caspase-4陽性表達，包括神經元和膠質細胞中均明顯增多。難治性顳葉癲癇組caspase-3、caspase-4吸光度值分別為(0.70±0.05)、(0.51±0.08)，明顯高于對照組的(0.25±0.03)、(0.19±0.05)(P<0.05)。見圖1。

2.2兩組細胞凋亡情況比較 對照組顳葉組織中僅存在少量TUNEL陽性神經細胞，難治性顳葉癲癇組TUNEL陽性神經細胞數明顯增多。難治性顳葉癲癇組細胞凋亡指數(12.80±2.65)明顯高于對照組(2.47±1.13)(P<0.05)。見圖2。

2.3Western印跡檢測兩組caspase-3、caspase-4蛋白表達情況 難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白灰度值分別為(0.475±0.082)、(0.690±0.103)，明顯高于對照組的(0.124±0.031)、(0.183±0.035)(P<0.05)。見圖3。

圖1 兩組caspase-3、caspase-4表達情況免疫組化染色(×400)

圖2 兩組細胞凋亡情況

圖3 Western印跡檢測兩組caspase-3、caspase-4蛋白在顳葉組織中的表達

3 討 論

顳葉癲癇是臨床常見的難治性癲癇，在動物實驗模型中已證實特征性的凋亡變化是癲癇發作后神經元損傷的主要表型〔4〕。癲癇發作時，線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質中，與胞質中的成分相互作用，激活caspase-3而引發內源性凋亡〔5〕。外源性凋亡主要起始于細胞膜上多種死亡受體活化后聚集相關接頭蛋白，進而活化caspase-8、-10，之后激活caspase-3引發凋亡〔6〕。除去內源性和外源性凋亡途徑之外，癲癇發病過程中還可誘發內質網應激，導致神經元損傷。caspase-12是內質網應激中一個重要的促凋亡蛋白，但其僅存在于部分嚙齒類哺乳動物中，人體中caspase-12基因功能失去〔7〕。相關研究發現，人體中caspase-4基因在內質網應激凋亡途徑中的作用類似于caspase-12〔8〕。癲癇導致的慢性腦損傷晚期神經細胞會出現凋亡，因此研究顳葉癲癇神經細胞凋亡的相關機制有助于探尋潛在的抗癲癇途徑。本研究提示人難治性顳葉癲癇顳葉組織中神經元和膠質細胞中可能存在凋亡相關的信號傳導。Western印跡檢測結果說明caspase-3、-4蛋白參與了人難治性顳葉癲癇的凋亡信號傳導，其高表達會提升顳葉組織中細胞凋亡水平。由于癲癇病理變化非常復雜，既可能是癲癇的原發改變，也可能是癲癇反復發作后的繼發性改變，本研究中探討的顳葉組織中神經細胞凋亡和促凋亡相關蛋白表達具體是癲癇發病的原因還是發病的結果難以確定，需進一步深入探討。

1Zheng H,Wang X,Tang Z,etal.The PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways mediate the erythropoietin-modulated calcium influx in kainic acid-induced epilepsy〔J〕.Neuroreport,2013;24(6):335-41.

2Bakir-Gungor B,Baykan B,Iseri SU,etal.Identifying SNP targeted pathways in partial epilepsies with genome-wide association study data〔J〕.Epilepsy Res,2013;105(1/2):92-102.

3Gorter JA,Iyer A,White I,etal.Hippocampal subregion-specific microRNA expression during epileptogenesis in experimental temporal lobe epilepsy〔J〕.Neurobiol Dis,2014;62:508-20.

4Meng FX,You Y,Liu ZL,etal.Neuronal calcium signaling pathways are associated with the development of epilepsy〔J〕.Mol Med Rep,2015;11(1):196-202.

5姜立剛,李 雪,李海平,等.局灶性腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡的研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;17(2):205-8.

6Russo E,Citraro R,Constanti A,etal.The mTOR signaling pathway in the brain:focus on epilepsy and epileptogenesis〔J〕.Mol Neurobiol,2012;46(3):662-81.

7Liu G,Guo H,Guo C,etal.Involvement of IRE1alpha signaling in the hippocampus in patients with mesial temporal lobe epilepsy.〔J〕.Brain Res Bull,2011;84(1):94-102.

8Berdichevsky Y,Dryer AM,Saponjian Y,etal.PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy〔J〕.J Neuroscience,2013;33(21):9056-67.

〔2017-01-11修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

第四軍醫大學教學研究課題(LG201422)

李 力(1976-)，男，博士，主治醫師，講師，主要從事神經重癥及腦血管病研究。

R74

A

1005-9202(2017)16-3975-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.030