黃葵膠囊通過抑制缺氧誘導因子改善單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機制

鐘正霞 裘志成

(遵義醫學院附屬醫院腎內科，貴州 遵義 563000)

黃葵膠囊通過抑制缺氧誘導因子改善單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機制

鐘正霞 裘志成

(遵義醫學院附屬醫院腎內科，貴州 遵義 563000)

目的研究黃葵膠囊是否可以通過抑制缺氧誘導因子(HIF)-1α的表達改善單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型的腎間質纖維化情況。方法將54只雄性成年Sprague-Dawley大鼠隨機分組，每組18只，分為對照組(即假手術組，Sham組)、單側輸尿管結扎建立的腎纖維化模型組(UUO組)和模型+黃葵膠囊治療組(HK組)，UUO組及HK組大鼠進行左側輸尿管結扎建模，術后1 d起，HK組按照1 g/kg的劑量用黃葵膠囊進行灌胃，1次/d；Sham組及UUO組每天以等量生理鹽水進行灌胃。治療后第7、14天，分別處死各組中的9只大鼠，取左側腎臟組織，HE染色進行腎臟組織病理檢查及損傷評分，實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法檢測腎臟組織中HIF-1α mRNA和蛋白的表達。結果UUO組與HK組術后均出現了腎臟局部的病理損害，但HK組腎損傷明顯較輕，各時間點HK組腎小管間質損傷指數與UUO組相比顯著降低；術后7 d與14 d，UUO組及HK組中的HIF-1α mRNA及蛋白表達水平均較Sham組顯著升高，而HK組中的HIF-1α mRNA及蛋白水平均顯著低于UUO組。結論黃葵膠囊可以通過降低腎纖維化模型中HIF-1α的水平緩解病情，修復腎損傷，是一種有效的抗腎間質纖維化藥物。

黃葵膠囊；單側輸尿管梗阻；腎間質纖維化;缺氧誘導因子-1α

慢性腎衰竭(CRF)是多種腎病晚期的轉歸。腎間質纖維化(RIF)與CRF的發生與發展存在著緊密的關聯〔1〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是參與腎纖維化發生的重要分子〔2〕，腎臟損傷可能引起腎局部缺氧，造成HIF-1α上調，進而影響其下游靶基因的表達，而其中就包括了許多被異常激活的纖維化基因，最終引起RIF的發生〔3〕。黃葵膠囊是一種中藥制劑，多年來臨床研究已經證實其具有腎臟保護、修復功能，對于多種腎臟疾病均有較好的療效〔4〕。本項研究建立由單側輸尿管梗阻(UUO)引起的大鼠RIF模型，進而探討黃葵膠囊是否可以通過抑制HIF-1α的表達改善UUO大鼠模型的RIF情況，發揮其抗纖維化的功效。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～220 g)共54只購自南京君科生物工程有限公司，黃葵膠囊購自江蘇蘇中藥業有限公司，Trizol 試劑購自美國Thermo scientific 公司，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司，兔抗大鼠HIF-1α抗體、GAPDH抗體，HRP 標記二抗購自美國Abcam公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，引物購自上海生工，序列：HIF-1α 上游引物5′-CAAGATCTCGGCGAAGCAA-3′，下游引物5′-GGTGAGCCTCATAACAGAAGCTTT-3′；GAPDH上游引物5′-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3′，下游引物5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′。

1.2UUO模型的建立及實驗分組 將SD大鼠隨機分為對照組(即假手術組，Sham組)、單側輸尿管結扎建立的腎纖維化模型組(UUO組)和模型+黃葵膠囊治療組(HK組)每組18只。UUO組及HK組大鼠進行建模〔5〕：使用30 mg/kg巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉后，切開腹腔左側暴露左輸尿管，沿上端結扎兩道后縫合腹腔，而Sham組不結扎即進行縫合。于術后1 d起，HK組按照1 g/kg的劑量用黃葵膠囊灌胃，1次/d。Sham組及UUO組每天以等量的生理鹽水灌胃。在手術后的第7、14天，各組隨機選取9只大鼠處死，解剖后摘取左腎，分成2份，一份浸泡于10%甲醛液中固定后，用于蠟塊包埋和HE染色；其余組織于液氮中凍存，用于檢測組織中mRNA和蛋白的表達水平。

1.3腎臟組織病理檢查及損傷評分 蘇木精-伊紅(HE)染色后的切片在光鏡下觀察腎臟的病理損害程度，并以病變部分占染色總面積的百分比進行評分。評分共分為4級，其中0分表示正常，無病變發生，病變范圍<25%計為1分，表示輕度損傷，病變范圍25%～50%計為2分，表示中度損傷，病變范圍>50%計為3分，表示重度損傷。

1.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測HIF-1α在腎臟組織中的表達 使用Trizol試劑提取腎臟組織中的總RNA，然后使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒，按照說明書進行RT-qPCR擴增。HIF-1α的表達以參照基因GAPDH的表達作為內參，采用△△CT法進行計算，即△CT = HIF-1α基因 CT 值-GAPDH基因CT值，兩組表達倍數差異=2-△△Ct(△△CT =組1△CT -組2△CT)。

1.5蛋白免疫印跡法檢測腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達 凍存的樣品經聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離，之后將SDS凝膠上的蛋白采用濕轉法轉移到PVDF膜上，然后加入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(即封閉液)，在室溫條件下置于搖床上，進行2 h的封閉后，倒去封閉液，用TBST緩沖液洗膜后加入一抗(HIF-1α抗體及GAPDH抗體)4℃孵育過夜。第2天，用TBST緩沖液洗膜后，加入二抗孵育，再次洗膜后，加入ECL化學發光試劑進行發光顯色。

1.6統計學方法 使用SPSS19.0軟件，組間計量資料比較使用t檢驗，計數資料比較使用χ2檢驗，多組間數據比較使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)。

2 結 果

2.1腎臟組織病理檢查及損傷評分 HE染色結果顯示Sham組術后7 d與14 d未見顯著異常病理改變，而UUO組與HK組術后7 d均出現了局部腎小管壞死、炎性細胞浸潤、膠原纖維增生及纖維化；而到了術后14 d時，這兩組中以上表現更顯著。而與同時間UUO組相比，HK組中大鼠腎損傷明顯較輕。在術后7 d與14 d，HK組腎小管間質損傷指數(TIDS)(1.11±0.56，1.44±0.50)與UUO組(1.77±0.62，2.11±0.57)相比均顯著降低，但與Sham組(0.33±0.47，0.22±0.42)相比仍顯著較高(P<0.05)。

2.2HIF-1α mRNA在各組大鼠腎臟組織中的表達 術后7 d，Sham組中HIF-1α mRNA表達(1.00±0.31)較低，UUO組(7.22±2.68)及HK組(5.51±2.65)中的HIF-1α mRNA水平均較Sham組顯著升高(均P<0.05)，而HK組中的HIF-1α mRNA水平則顯著低于UUO組(P<0.05)。術后14 d，UUO組(9.80±4.96)及HK組(6.46±2.46)中的HIF-1α mRNA水平仍顯著高于Sham組(1.00±0.32)(均P<0.05)，而HK組中的HIF-1α mRNA水平仍顯著低于UUO組(P<0.05)。

2.3各組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達 術后7 d及14 d，Sham組中HIF-1α蛋白表達均較低，UUO組及HK組中的HIF-1α蛋白水平均較Sham組顯著升高，而HK組中的HIF -1α的蛋白水平低于UUO組。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達

3 討 論

有研究表明，缺氧可能是造成梗阻性腎病發生發展的一個重要的獨立因素〔5〕，其機制可能是因為缺氧造成了腎臟局部氧氣及其他營養物質的減少，進而引起了腎小管細胞的異常凋亡以及RIF，最終導致了腎小管病變并隨著其程度的不斷加深造成腎單位喪失〔6〕。HIF-1是一種轉錄因子，在缺氧條件下，HIF-1可以與缺氧反應元件(HRE)進行結合，對其下游靶基因進行調控并產生效應〔7～9〕。HIF-1由α及β兩個亞單位組成，而其中的 HIF-1α 是其主要的活性亞基，可能參與RIF的發生，并在腎纖維化的發展中起到至關重要的作用〔10〕，本次研究說明，在UUO模型組的腎臟中的確產生了局部的缺氧狀況，而之前的觀點認為，這種局部缺氧的狀況很可能是因為對輸尿管結扎導致了腎臟局部組織內的血液流動不暢，進而產生了血液循環方面的障礙。值得注意的是，在隨著輸尿管結扎時間的延長，其腎臟病變組織中HIF-1α的表達也呈現出增加的趨勢，這一點進一步證實隨著缺氧時間的增加，HIF-1α 的水平也逐漸升高，并且造成了腎臟的進一步損傷及纖維化。

黃葵膠囊是黃蜀葵花的提取物，其中的主要有效成分包括槲皮素、梅斗皮素、金絲桃苷、楊梅黃素等〔11〕。之前的多項研究已經證實，黃蜀葵花及其提取物具有廣泛的殺菌、抗氧化、抗炎及抗血小板聚集作用。在腎病治療領域，其治療效果更為突出，黃葵膠囊可有效改善腎病患者的蛋白尿狀況，抑制腎小球的炎癥反應，從而修復腎小球損傷并改善其腎功能〔12〕。在本項研究中，我們發現使用黃葵膠囊對UUO大鼠進行治療后，其腎纖維化狀況得到了明顯改善，證實黃葵膠囊可能通過下調HIF-1α 的表達改善局部因缺氧造成的炎性反應，減少活性氧的累積，對局部的腎臟損傷起到修復和保護作用，進而延緩RIF的進一步發展。

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12焦 賀，邢夏囡，宋文剛.黃葵膠囊對大鼠腎小管間質纖維化及PTEN的影響〔J〕.文摘版：醫藥衛生，2015；(10)：299-300.

〔2016-12-07修回〕

(編輯 徐 杰)

遵義醫學院碩士啟動基金〔院字(2012)10號〕

鐘正霞(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事腎病風濕病研究。

R692.3

A

1005-9202(2017)16-3952-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.019