葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸信號通路的影響

朱振標 張 壽 沈 慧 林之斌 丁曉莉 劉亦恒

(海口市人民醫院骨科中心，海南 海口 570208)

葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸信號通路的影響

朱振標 張 壽 沈 慧 林之斌 丁曉莉 劉亦恒

(海口市人民醫院骨科中心，海南 海口 570208)

目的觀察葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸(GABA)信號通路的影響。方法選用雌性大鼠45只，分為假手術組15只和手術組30只，手術組行雙側卵巢切除術，造模12 w時測定骨密度(BMD)，確認骨質疏松(OP)復制成功后，將手術組大鼠又隨機分為模型組和葛根總黃酮組，每組均15只；葛根總黃酮組大鼠給予葛根總黃酮灌胃，持續時間為12 w，模型組和假手術組同時給予等量生理鹽水灌胃；實驗結束后測定大鼠的BMD，ELISA法觀察血清谷氨酸脫羥酶(GAD)水平，免疫組化法觀察股骨遠端GABA、GABA受體(GABABR)1和GABA轉運蛋白(GAT)1的表達，RT-PCR法檢測股骨GABABR1 mRNA表達情況。結果在造模12 w時，與假手術組比較，手術組大鼠第5、6腰椎、肱骨近側干骺端、股骨近側干骺端、股骨遠側干骺端的骨組織BMD值出現了下降(P<0.05)；給藥結束后，與模型組相比較，假手術組和葛根總黃酮組大鼠血清GAD水平、股骨GABA、GABABR1的表達均顯著降低(P<0.05)；給藥結束后，與模型組比較，假手術組和葛根異黃酮組大鼠股骨GABABR1 mRNA表達均降低(P<0.01或P<0.05)。結論葛根總黃酮防治OP的機制之一可能是通過降低血清GAD水平、減少股骨GABA和GABABR1含量及GABABR1 mRNA表達實現的。

葛根總黃酮；骨質疏松；γ-氨基丁酸信號

骨質疏松(OP)發病中，女性明顯高于男性〔1～3〕，這是因為絕經后雌激素水平降低是導致女性發病的主要原因。防治絕經后OP的主要方法是雌激素替代療法，但臨床中發現其容易引起癌變及其他副作用。植物雌激素的化學結構與雌激素非常相似，可發揮擬雌激素或抗激素效應。葛根總黃酮是葛根的主要有效成分，具有類似于植物雌激素的作用，且毒副作用低微，可作為雌激素的替代品長期服用，避免了雌激素的致癌作用。本實驗觀察葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸(GABA)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級、3月齡、雌性SD大鼠，共45只，體重(180±20)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司〔許可證號：SCXK(湘)2009-0012〕。

1.2主要實驗藥物及試劑 葛根總黃酮粉(有效成分含量為40%)；GABA受體(GABABR)1多克隆抗體(英國Abcam公司生產)；谷氨酸脫氫酶(GAD)ELISA試劑盒(美國R&D公司生產)；免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；GABA轉運蛋白(GAT1)多克隆抗體(英國Abcam公司生產)；GABA多克隆抗體；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物公司生產)；RT-PCR檢測試劑盒(大連寶生物有限公司生產)。

1.3主要實驗儀器及設備 雙能X線骨密度儀(美國Lunar公司，Prodigy型)；高速冷凍離心機(2-16K，德國Sigma公司)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標儀(680型，美國BIO-RAD公司)；梯度PCR儀(Veriti 96-Well，美國ABI公司)；凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司，GELEQ)；電子天平(ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開發有限公司生產)。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組 大鼠分籠飼養，自由攝取標準飼料，飲用自來水，適應性飼養1 w后按隨機數字表法將45只大鼠隨機分為假手術組15只、手術組30只。假手術組大鼠行腹腔手術找到卵巢，但不切除，手術組大鼠行雙側卵巢切除術。所有動物飼養12 w后檢測骨密度(BMD)，以確定OP動物模型復制成功是否，若成功后即將30只手術組大鼠再隨機分為模型組、葛根總黃酮組各15只。

1.4.2制作OP模型 OP模型制作參照文獻中的方法〔4〕，切除雙側卵巢制作大鼠OP模型。將稱重后的各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，行全身麻醉后取仰臥位，固定后進行腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白線作縱行切口(切口長度2～3 cm)，打開腹腔后即切除雙側卵巢，術后切口用75%酒精棉球消毒。假手術組亦打開腹腔，但不切除卵巢。術后為預防感染各組大鼠腹腔注射10萬U青霉素3 ml/只，1次/d，連續3 d。

1.4.3BMD測定 術后第12周，手術組和假手術組大鼠行全身麻醉后測定BMD。測定部位為第5、6腰椎、肱骨近側干骺端、股骨近側干骺端、股骨遠側干骺端。股骨近側干骺端為股骨近側1/4，肱骨近側干骺端為肱骨近側1/4，股骨遠側干骺端為股骨遠側1/4。

1.4.4給藥方法 模型復制成功后，給藥組大鼠用葛根總黃酮灌胃50 mg·kg-1·d-1。將藥物稀釋成1.0 ml/100 g，體重5 mg/ml后即進行灌胃，1次/d(灌胃前12 h應禁食不禁水，持續12 w)。同時假手術組和模型組用等量生理鹽水灌胃。

1.4.5標本采集 灌胃12 w后處死大鼠，腹腔內注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，心臟采血，離心后取血清，置-20℃備用。再依次灌注生理鹽水200～250 ml、4%多聚甲醛350～400 ml。灌注完以上液體即取左側股骨，用DEPC水處理后，密封包裹保存于液氮中；取出右側股骨，在4℃條件下用4%多聚甲醛中固定24 h。

1.4.6血清GAD含量測定 ELISA法按試劑盒說明書進行操作。

1.4.7免疫組化法檢測GABA、GABABR1和GAT1 按試劑盒說明書進行操作，應用Image-ProPlus6.0醫學圖像分析軟件進行半定量分析〔5〕，測量免疫陽性部位的平均光密度。

1.4.8RT-PCR法檢測GABABR1 mRNA的表達 引物的設計以GAPDH為對照，大連寶生物有限公司合成,RT-PCR方法見參考文獻〔6〕。GAPDH上游5'-ACCACAGTCCAIGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；GABABR1上游5'-AGCTGACCAGACCTTGGTCAT-3'，下游5'-AACTGGCTTCTCCCTATGTGTGG-3'。

1.5統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，方差齊時采用Tukey檢驗，方差不齊時采用DulmettT3檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 實驗結束時可能由于手術、麻醉等原因，一部分大鼠出現死亡，死亡分布情況為：假手術組大鼠死亡1只；模型組死亡2只；葛根總黃酮組死亡1只。給藥一段時間后，發現模型組大鼠體態臃腫，皮毛發黃，欠光澤，反應遲緩，而假手術組和葛根總黃酮組大鼠則皮毛光澤，反應敏捷。

2.2各組大鼠不同部位BMD測定 手術12 w后，與假手術組比較，手術組大鼠全身多個部位出現BMD降低。其中左股骨遠端和右肱骨近端、右股骨遠端、5～6腰椎、右股骨近端、左股骨近端等部位BMD值差異顯著(P<0.05，P<0.01)，說明手術組大鼠骨量明顯丟失，提示OP模型復制成功，見表1。

2.3各組大鼠血清GAD表達 給藥結束后，和模型組大鼠比較〔(33.01±5.08)pmol/L〕，假手術組〔(22.88±4.32)pmol/L〕和葛根總黃酮組〔(21.36±4.45)pmol/L〕大鼠血清中GAD值均顯著增高(P<0.05)，假手術組、葛根總黃酮組GAD值比較無差異(P>0.05)。

表1 手術12 w時各組各部位BMD水平比較(±s，g/cm2，n=14)

與假手術組比較:1)P<0.01，2)P<0.05

2.4骨組織GABA、GABABR1、GAT1的表達 免疫組化結果顯示，與模型組比較，假手術組和葛根總黃酮組大鼠骨組織GABA、GABABR1平均光密度均降低(P<0.05)，但假手術組和葛根總黃酮組之間骨組織GABA、GABABR1平均光密度比較無差異(P>0.05)。與模型組比較，假手術組和葛根總黃酮組大鼠骨組織GAT1的平均光密度均降低，但無顯著差異(P>0.05)，假手術組和葛根總黃酮組之間亦無差異(P>0.05)，見表2。

2.5骨組織GABABR1 mRNA表達 RT-PCR檢測表明，與模型組(0.750 3±0.031)大鼠比較，假手術組骨組織GABABR1 mRNA的表達顯著降低(0.623 2±0.036，P<0.01)，葛根總黃酮組大鼠骨組織GABABR1 mRNA的表達亦降低(0.678 1±0.044，P<0.05)，但假手術組和葛根總黃酮組兩者之間無差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠骨組織GABA、GABABR1、GAT1蛋白含量平均光密度比較(±s)

與模型組比較:1)P<0.05

3 討 論

GABA信號通路由谷氨酸、GAD、GABA-T、GABA、GABAR、GAT等組成〔7，8〕。GABA是哺乳動物神經系統中最豐富和功能最重要的抑制性神經遞質，以GABA為遞質的中樞突觸部位約占50%，GABA在生物體內具有重要的生理功能，參與多種神經生理活動，已報道其具有調節血壓、促進腦部血流、營養神經細胞、預防肥胖、促進乙醇代謝、改善更年期綜合征等生理活性〔9～11〕。有學者等〔9〕通過研究有如下發現：①GABA能促進生長激素(GH)分泌，而生長激素具有促進軟骨、骨骼、肌肉結締組織增長、促進身體許多組織RNA及蛋白質合成的作用。②GH具有增加軟骨中膠原和硫酸軟骨素、其他蛋白質、核酸合成，促進肝臟等組織合成胰島素生長因子(IGF)的作用。IGF是骨組織中含量較豐富的生長因子，它能刺激成骨細胞(OB)增殖、分化，增殖前體成骨，增多功能性OB的數目等。

OP的臨床表現主要為患者骨量明顯下降，易發骨折，同時可能還伴有嚴重的骨痛，其主要是由骨重建高轉換而引起的。女性絕經后出現明顯的OP多由于缺乏雌激素而引起骨重建高轉換的。本實驗結果說明了OP模型大鼠骨組織內GABA信號處于一種高表達水平，由于模型組大鼠骨量嚴重丟失，由此推斷GABA信號的高表達是為了對抗骨量的丟失。而葛根總黃酮可以較好地治療OP，使OP模型大鼠的骨量增加，降低了成骨的迫切性，使神經系統的調節作用減緩，減少了GABA及相關物質的釋放。推測當GABA在身體內大量聚集但又不能及時被轉運的情況下，GABA可能是通過GABABR抑制葛根總黃酮或許能夠通過GABA抑制OB活性這種途徑治療OP，這可能是葛根異黃酮治療OP的機制之一。

1鄭 青,梁 寧.老年性骨質疏松患者血清細胞因子水平與 OPG/RANKL/RANK 軸的相關性〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(17):3651-3.

2褚建國,王季軍.骨質疏松骨代謝的 OPG/RANKL/RANK 作用機制〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(10):5015-7.

3劉 蘋,胡 萍,邢鳳霞,等.中老年人骨密度分析及骨質疏松患病率〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(10)：5139-40.

4Devlin HF,Erguson MW.Compositional changes in the rat femur following ovariectomy〔J〕 Act Anatomic,1989;136(1):38-41.

5Franeiso JS,Moraes HP,Dias EP.Evaluation of the Image Pro Plus4.5 software for automatic counting of labeled nuclei by pcA immunohistochemistry〔J〕.Bra Oral Res,2004;18(2):100-4.

6Yin JL,Shackel NA,Zekry A,etal.Realtime reverse transcriptase poly-merase chain reaction(RT-PCT)for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I〔J〕.Immunol Cell Biol,2001;79(3):213-21.

7呂辰鵬.骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠骨組織GABA信號通路的影響〔D〕.廣州：暨南大學,2011.

8劉志廣.腺苷A1受體在癲癇發病機制中的作用及其與GABA信號通路相關性的研究〔D〕.武漢：華中科技大學,2013.

9林親錄,王 婧,陳海軍.γ-氨基丁酸的研究進展〔J〕.現代食品科技,2008;24(5):496-500.

10張瀅瀅,屈 強,唐顯玲.神經遞質參與精神興奮藥物成癮的研究進展〔J〕.重慶醫學,2011;40(4)：392-4.

11趙 暉,王 蕾,張秋霞,等.竹節參總皂苷對血管癡呆大鼠遞質氨基酸及自由基代謝的影響〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(11):3096-8.

〔2015-08-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

海南省自然科學基金(No.811156)；海南省衛生廳資助項目(No.瓊衛2010-69)

劉亦恒(1976-)，男，博士，副主任醫師，主要從事骨質疏松及脊柱脊髓損傷研究。

朱振標(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事骨質疏松及骨關節疾病研究。

R28

A

1005-9202(2017)16-3940-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.014