貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病大鼠p38MAPK和MIP-T3表達的影響

吳忠練 黃學寬 駱 言 張超男 蔣 娟 萬 磊 王 玲

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 401331)

貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病大鼠p38MAPK和MIP-T3表達的影響

吳忠練 黃學寬 駱 言1張超男 蔣 娟 萬 磊 王 玲

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 401331)

目的觀察貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺組織中p38MAPK信號通路和腫瘤相關因子受體因子MIP-T3的影響。方法將40只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組及貝母瓜蔞散組，每組10只；采用脂多糖(LPS)氣管滴入加煙熏法制造COPD大鼠模型，為期30 d。從造模第8天開始，地塞米松組給予地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，貝母瓜蔞散組給予貝母瓜蔞散灌胃(20 ml/kg)，1次/d，連續22 d，模型組予0.9% 生理鹽水灌胃(20 ml/kg)。Western印跡檢測p38MAPK蛋白和MIP-T3蛋白的表達水平。結果與正常組比較，模型組大鼠肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和貝母瓜蔞散組可降低大鼠肺組織中p38MAPK和MIP-T3的表達(P<0.05)；而地塞米松組和貝母瓜萎散組p38MAPK和MIP-T3的表達無明顯差異(P>0.05)。結論貝母瓜蔞散有抑制p38MAPK和MIP-T3表達的作用。

貝母瓜蔞散；慢性阻塞性肺疾病；p38MAPK；MIP-T3

氣道炎癥反應在慢性阻塞性肺病(COPD)發病過程中起重要作用，COPD較普通人群更容易發生肺癌〔1〕。貝母瓜蔞散可潤肺清熱，理氣化痰，尤其方中川貝在我國有廣泛的運用〔2〕，在我國咳嗽患者服用川貝蒸梨緩解咳嗽癥狀療效甚佳。瓜蔞可以寬胸理氣，現代研究證明改善心功能和血液流變學指標〔3〕。貝母瓜蔞散出自《醫學心悟》卷3：“燥痰澀而難出，多生于肺，肺燥則潤之，貝母瓜蔞散。”冉先德《歷代名醫良方注釋》“燥痰之證，多由肺陰不足、虛火灼津而成。”研究證明p38MAPK信號通路是炎癥相關的信號通路〔4〕，脂多糖(LPS)氣管滴入可刺激大鼠肺泡巨噬細胞釋放的炎性細胞因子，腫瘤壞死因子(TNF)和p38MAPK的表達明顯上升，說明p38MAPK信號通路的激活對炎性細胞因子和TNF等釋放有促進作用。而加入p38MAPK特異性抑制劑，則可抑制MAPK信號通路的轉導和表達，而減少炎癥介質等釋放，減緩COPD發展進程。本實驗觀察貝母瓜蔞散對COPD大鼠肺組織中p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)和腫瘤壞死因子受體相關因子3結合蛋白(MIP-T3)1的表達，作為研究貝母瓜蔞散對COPD大鼠的作用機制。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器 貝母瓜蔞散(川貝母、瓜蔞、天花粉、茯苓、橘紅、桔梗)，冷水浸30 min，煮沸后煎30 min，共煎3次，合并藥液，濃縮為含2.0 g生藥/ml，購于西部大藥房，由中醫藥學院鑒定；地塞米松注射液(山東新華制藥股份有限公司)，SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫療用品有限公司)，LPS(美國Sigma公司)，宏聲牌香煙(川渝中煙工業有限責任公司，焦油量11 mg/支，煙氣CO量12 mg/支，煙氣煙堿量10 mg/支)，MIP-T3抗體(Santa Cruz)，p38MAPK(EPITOMICS)。高速離心機(美國Sigma)，凝膠成像分析系統(GDS8000，英國UVP公司)，光學顯微鏡BH-2型(日本Olympus)，顯微攝像儀(Olympus)；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統Image-Pro Plus(美國Media Cybernetics公司)等。

1.2動物分組與造模 清潔級雄性SD大鼠，40只，體重(200±20)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供〔生產許可證號：SCXK(渝)2007-0001〕。將大鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組和貝母瓜蔞散組，每組10只，適應性飼養1 w后，除正常組外，參照宋一平等〔5〕的方法，將其余30只大鼠分別于第1、15天氣道內注入LPS生理鹽水溶液(200 μg/100 μl)；第2～14天、16～30天則將大鼠置于密閉玻璃染毒箱中，香煙插在50 ml注射器針頭上，點燃并抽推活塞，將產生的煙霧注入箱內，濃度達5%左右(每次約打入3 600 ml煙霧)，使大鼠被動吸煙，持續30 min后再將大鼠移出染毒箱，2次/d，每次間隔4 h以上，其余時間正常喂養。造模過程注意觀察大鼠的一般情況。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.3治療方法 實驗造模第8天起，正常組：不造模，每日予以0.9%生理鹽水20 ml/kg連續灌胃，1次/d，連續22 d。模型組：造模，每日予以0.9% 生理鹽水20 ml/kg灌胃，每日1次，連續22 d。地塞米松組：造模，用地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，1次/d，連續22 d。貝母瓜蔞散組：造模，用貝母瓜蔞散20 ml/kg灌胃，每日1次，連續22 d。

1.4肺組織病理觀察及p38MAPK、MIP-T3表達的測定 解剖取出大鼠的肺，用生理鹽水洗凈肺組織表面殘血，濾紙吸干后，精密稱取0.1 g肺組織研磨，滴加蛋白裂解液0.5 ml使之裂解。低溫4℃離心10 min(3 000 r/min)，取上清液。在上樣緩沖液中加入100 μg蛋白煮沸3分，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，37℃ TTBS封閉液封閉2 h，滴加兔抗鼠p38MAPK、MIP-T3單克隆抗體，4℃冰箱內過夜，加1∶2 500辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37℃放置2 h，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。抗體剝脫液剝脫抗體后，相同方法與1∶300的β-actin抗體孵育。內參以β-actin 蛋白條帶為準，分析灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.5統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結 果

2.1大鼠一般狀態及肺組織病理學改變 與正常組比較，模型組大鼠明顯出現了咳嗽、喘、精神不振、張口抬頭、口角流涎等。經過貝母瓜蔞散和地塞米松干預的大鼠上述癥狀和體征明顯減輕或消失。實驗結束后，正常大鼠肺組織顏色偏白，而模型組大鼠肺組織灰白晦暗呈膨隆狀，地塞米松組和貝母瓜蔞散組大鼠肺組織顏色灰暗明顯較模型組好轉。

2.2大鼠肺組織p38MAPK和MIP-T3蛋白的表達 與正常組比較，模型組肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和貝母瓜蔞散組p38MAPK和MIP-T3的表達明顯下降(P<0.05)；而地塞米松組和貝母瓜組相比，兩者無顯著性差異(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 大鼠肺組織中p38MAPK和MIP-T3表達灰度值(±s)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

1正常組；2模型組；3地塞米松組；4貝母瓜蔞散組圖1 各組肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達

3 討 論

COPD是以進行性氣流受限為特征的慢性疾病，與香煙煙霧等有害氣體或粉塵顆粒等引起的肺部異常炎癥反應相關，主要病理改變是慢性炎癥所致的氣道損傷、修復、重塑等，與COPD的發病密切相關。本實驗通過氣管滴注LPS和被動吸煙法制備COPD大鼠模型。

炎癥反應中p38MAPK信號轉導通路占很重要地位，它參與細胞存活、分化和發育等過程，實驗表明p38MAPK能增強細胞存活概率，也能抗凋亡。特別在炎癥反應時抗凋亡能力更強〔6〕。研究顯示，p38MAPK可能參與支氣管哮喘的發病過程〔7〕。另外，腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)是TNF超家族成員之一，不僅能加強TNFR誘導的炎癥因子的產生〔8〕，還與炎癥細胞的分化有關，介導機體自然免疫和獲得性免疫〔9〕。MIP-T3，可能參與胞質中合成的纖毛蛋白運送到纖毛內組裝的過程。在MIP-T3突變、缺陷和敲除后纖毛會出現不同程度的改變，如纖毛稀疏、短小、微管結構缺陷或紊亂。人體觀察發現MIP-T3在人體很多組織中，比如在支氣管、肺組織都有表達。COPD患者存在氣道上皮纖毛結構和功能的異常，纖毛的異常會導致黏液纖毛清除功能的障礙，引起分泌物異常分泌，小氣道受阻，局部防御系統破壞，引起反復炎癥反應及感染，是疾病反復發生并漸漸加重的關鍵原因之一〔10〕。纖毛的結構和功能異常在COPD的發病中起重要作用。另外，TRAF腫瘤壞死因子受體相關因子在肺癌患者肺組織中表達明顯升高〔11〕。

本文結果顯示貝母瓜蔞散可以抑制p38MAPK信號通路，抑制COPD大鼠肺組織的炎癥反應。對MIP-T3的抑制可能反映了貝母瓜蔞散能通過抑制COPD的炎性反應從而抑制了COPD惡性病變的趨勢。

1薄曉霞,彭 芳,謝美云,等.慢性阻塞性肺病合并肺癌臨床分析〔J〕.中國實用醫藥,2012;7(10):132-3.

2顏曉燕,彭 成.川貝母藥理作用研究進展〔J〕.中國藥房,2011;22(31):2963-5.

3張承志,韓林濤,黃 芳,等.“瓜蔞-薤白”藥對大鼠抗急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.湖北中醫雜志,2012;34(7):19-21.

4黃翠萍,張珍祥,徐永健,等.p38蛋白激酶對大鼠肺泡巨噬細胞活化機制的調控〔J〕.中國病理生理雜志,2003;19(5):661-3.

5宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預〔J〕.中華內科雜志,2000;39(8):556-7.

6梁先敏,楊克敵.Caspase和JNKPSAPK、p38MAPK與細胞凋亡〔J〕.國外醫學·衛生學分冊,2008;35(1):5-10.

7黃翠萍,楊和平,楊穎喬,等.黃芪注射液對哮喘大鼠p38MAPK和Th1/Th2類細胞因子變化的影響〔J〕.中國病理生理雜志,2008;24(12):2386-90.

8Wicovsky A,Henkler F,Salzmann S,etal.Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1 enhances proinflammatory TNF receptor-2 signaling and modifies TNFR1-TNFR2 cooperation〔J〕.Oncogene,2009;28(15):1769-81.

9Dupoux A,Cartier J,Cathelin S,etal.clAP1-dependent TRAF2 degradation,regulates the differentiation of monocytes into macrophages and their response to CD40 ligand〔J〕.Blood,2009;113(1):175-85.

10高志睿.MIP-T3在慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道上皮的表達研究〔D〕.廣州:南方醫科大學,2011.

11黃建安,王天立,王光杰,等.CD40配基化對肺癌細胞腫瘤壞死因子受體及相關因子表達的影響〔J〕.江蘇醫藥雜志,2004;30(9):641-3.

〔2016-05-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

重慶市渝中區科技項目(No.20110318)

黃學寬(1972-)，男，教授，碩士生導師，主要從事中醫基礎理論與臨床研究。

吳忠練(1960-)，男，講師，主要從事中醫經典及臨床運用研究。

R289.5

A

1005-9202(2017)16-3936-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.012

1 重慶市中醫院