siRNA干擾膜聯蛋白A1基因對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖的影響

鐘雪梅 林一民 李倩倩 鄧世山 邵如月 丁 浩

(重慶醫藥高等專科學校臨床醫學院，重慶 401331)

siRNA干擾膜聯蛋白A1基因對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖的影響

鐘雪梅 林一民1李倩倩2鄧世山2邵如月 丁 浩

(重慶醫藥高等專科學校臨床醫學院，重慶 401331)

目的通過小干擾RNA(siRNA)干擾膜聯蛋白(ANX)A1基因在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中的表達，探討ANXA1對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學特性的影響。方法設計并篩選使用高效的siRNA在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株中特異性干擾ANXA1的表達，然后用CCK8法觀察ANXA1干擾后對TPC-1細胞增殖能力的影響。結果篩選的siRNA可高效沉默ANXA1在TPC-1細胞中的表達，顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖。結論siRNA干擾ANXA1表達，可抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖，提示ANXA1可能是甲狀腺乳頭狀癌治療的一個重要的生物學靶標。

甲狀腺乳頭狀癌；膜聯蛋白A1；TPC-1細胞；小分子干擾RNA

膜聯蛋白(ANX) 是一類高豐度蛋白，有鈣依賴性，且能夠和帶負電荷膜磷脂結合的一種蛋白超家族〔1〕。ANXA1作為ANX家族重要成員之一，參與細胞的各種生理病理過程〔2〕。研究還發現，ANXA1與腫瘤關系非常密切，在很多腫瘤中表達異常且參與腫瘤細胞的增殖、分化、細胞信號和轉導以及侵襲等過程，這可能與ANXA1 高度依賴鈣磷脂結合蛋白，很多位點可生物再加工，包括被酪氨酸激酶磷酸化、糖基化、乙酰化、磷酸化，增加水解作用，促進重要分子的增殖有關〔3，4〕。甲狀腺癌(TC) 是內分泌系統常見腫瘤，它的病理分型有甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺髓樣癌、未分化癌和甲狀腺濾泡狀癌，其中PTC惡性程度較甲狀腺癌其他分化類型低，它的發生發展是多基因、多因素導致的，診治較困難，且易轉移和復發〔5〕。過度診治可給患者帶來身心傷害和負擔，其中手術導致的喉返神經損傷引起發聲費力、呼吸困難甚至窒息等是甲狀腺手術的嚴重并發癥之一。本文擬探索一種新的標記物和治療方法，提高PTC的診治，改善PTC患者的生活質量。

1 材料與方法

1.1細胞株 將從深圳百恩維生物公司購買的人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1，在細胞生長90%匯合時進行細胞傳代，加入含10%～15%胎牛血清的RPMI-1640培養基，5%CO2、37℃恒溫孵箱內培養。根據試驗需要進行細胞計數以及細胞的凍存復蘇。

1.2ANXA1 siRNA設計 從GenBank中檢索出人ANXA1全長序列，遵循引物設計原則，使用Version2.0軟件設計出針對ANXA1基因的特異性片段3對及無關序列siRNA片段(NCsiRNA)1對。以上siRNA由廣州銳博生物科技有限公司復核并合成。

1.3細胞轉染 轉染前24 h接種6孔板，將甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞以(2.5～5)×105/孔的密度接種，使其生長至80%或剛好鋪滿培養板且處于對數生長期進行轉染。選擇細胞傳代在5代以內的轉染，根據Lipofectamine(lip)2000(Invitrogen美國)說明書操作，將帶有熒光標記的siRNA轉染至TPC-1細胞內。實驗分空白組(不轉染)，實驗組(三對分別轉染siRNA)、陰性對照組(轉染NCsiRNA)及脂質體組，其中實驗組包括ANXA1-siRNA1組、ANXA1-siRNA2組、ANXA1-siRNA3組。操作步驟：稀釋siRNA，用250 μl無血清培養基稀釋5 μl 的siRNA，輕輕混勻。準備轉染試劑：用250 μl無血清培養基加入lip2000脂質體5 μl；將稀釋后的siRNA和脂質體lip2000混勻，即每個EP管共510 μl混合液，在室溫下孵育15～20 min；將6孔板培養的生長狀態良好的細胞移至超凈臺，先吸出舊培養基，用PBS輕柔洗滌3次，加入1 490 μl無血清培養基；將孵育好的siRNA和lip2000脂質體510 μl加入6孔板中，每孔終體積為2 ml。轉染前后避光，于5%CO2、37℃孵箱培養。6 h后換成含血清培養基繼續培養。

1.4半定量逆轉錄PCR(RT-PCR) 先提取細胞總RNA，并鑒定在RNA的完整性。GenBank中檢索出人ANXA1和β-actin全長序列，用 Oligo6 軟件分別設計引物，以β-actin為內參對照，ANXA1基因上游引物：5′-gTCATCCAAAggTggTCCCg-3′，下游引物：5′-CgCTgTgCATTgTTTCgCTTA-3′，產物大小為153 bp；β-actin上游引物：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物：5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′，產物大小為594 bp。將逆轉錄所得的cDNA模板進行PCR擴增反應。ANXA1及β-actin基因的上下游引物和通過半定量RT-PCR擴增后的產物marker在1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴酚藍染色，凝膠成像系統上觀察擴增的條帶并采集圖片，測量灰度值，計算mRNA相對表達量，用圖像分析軟件PDQuest進行分析。

1.5CCK-8檢測細胞活力 CCK-8實驗步驟按說明書操作：將TPC-1 細胞以密度(2～2.5)×103/個接種于96孔板，每孔終體積為100～200 μl，分別為ANXA1-siRNA3組、空白組、negative-siRNA組，每組設置8個復孔，待細胞鋪滿70%～80%時轉染。分別在轉染后24、48、72、96 h每孔加入CCK-8試劑10 μl，避光置于37℃孵箱中繼續培育孵育，時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度不同而不同，TPC-1細胞分別在0.5、1、2、4 h用酶標儀檢測，孵育1 h后細胞顏色最深，增殖最多。用酶標儀測定450 nm波長的吸光度(A)值，并根據A值分析細胞活力狀況。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1熒光顯微鏡下觀察TPC-1細胞表達 ANXA1-siRNA和negative-siRNA在48 h時轉染效率達80%以上，轉染效率最好。見圖1。

2.2各組TPC-1細胞中ANXA1 mRNA水平比較 各ANXA1-siRNA干擾組siRNA1、siRNA2、siRNA3 mRNA表達水平分別是0.51±0.11、 0.49±0.08、0.41±0.14，空白組、脂質體組及陰性對照組的mRNA表達水平為1.34±0.17、1.15±0.098、1.25±0.175 。ANXA1-siRNA干擾組mRNA表達水平較其他組明顯下降(P<0.05)，其中ANXA1-siRNA3下降最明顯；而空白組、脂質體組及陰性對照組的mRNA表達無明顯變化(P>0.05)。

2.3siRNA干擾ANXA1基因后對TPC-1細胞活力的影響 在轉染后的不同時間點，空白組及negative-siRNA組比較細胞增殖無明顯差異(P>0.05)；而轉染48、72、96 h后，ANXA1-siRNA3組細胞增殖低于空白組及negative-siRNA組(P<0.05)，見表1。

表1 不同轉染時間段各組細胞的OD值(±s)

與空白組比較：1)P<0.05;與negative-siRNA組比較：2)P<0.05

圖1 熒光顯微鏡下觀察TPC-1細胞轉染24 h后圖像(×10)

3 討 論

siRNA由21～25個核苷酸組成，能引起RNA沉寂和抑制靶蛋白的表達。由于siRNA能夠高效、快速地敲除基因的表達，對很多疾病(如腫瘤、基因疾病、病毒性干擾等)具有極好的治療前景。本實驗前期的研究中發現，ANXA1蛋白在PTC組織及淋巴結轉移組織中高表達，在癌旁正常組織中低表達，并與淋巴結轉移和腫瘤大小相關〔6～8〕。靶向治療已經運用與臨床，并顯示出很好的治療前景。這為PTC的研究提供了很好的著眼點，抑制ANXA1基因功能是否影響PTC的生物學特性成為本次的研究目的。

本研究結果顯示，設計并合成的siRNA在mRNA水平顯著抑制了ANXA1的表達，具有高效性和專一性，進而利用篩選的效率最高的siRNA進行后續研究。siRNA顯著干擾了ANXA1蛋白的表達，抑制了甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株的增殖能力，提示ANXA1在PTC中可能是一個癌基因。ANXA1屬于Ca2+的受體蛋白，當蛋白質磷酸化和磷脂代謝等一些信號蛋白功能失常時，細胞膜和細胞內的信息發生改變，研究推斷 ANXA1可能通過各種信號途徑，誘導腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、轉移，在腫瘤的發生、發展中起一定的作用〔9〕。 ANXA1在癌組織中高表達，具有促進腫瘤細胞增殖的能力，并有抗癌細胞凋亡的作用。這為PTC的臨床治療提供了新思路，即通過靶向治療抑制ANXA1蛋白高表達，從而達到控制腫瘤的作用。目前，關于ANXA1研究已成為腫瘤治療領域的熱點。如Babbin 等〔10〕也發現ANXA1在結腸癌表達上調，運用高表達結直腸癌細胞系 SKCO-15，用 siRNA 敲低ANXA1 的表達，顯示其能促進結直腸癌細胞系SKCO-15的增殖，且降低結直腸癌細胞系 SKCO-15的侵襲能力。總之，ANXA1通過多種方式參與信號通路和酶的表達，具體機制待深入探討。

1Perretti M，Flower RJ.Annexin 1 and the biology of the neutrophil〔J〕.J Leukoc Biol，2004；76(1)：25-9.

2Laohavisit A，Davies JM.Annexins〔J〕.New Phytol，2011；189(1)：40-53.

3Perretti M，Acquisto F.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation〔J〕.Nat Rev Immunol，2009；9(1)：62-70.

4Horlacher T，Noti C，de Paz JL，etal.Characterization of annexin A1 glycan binding reveals binding to highly sulfated glycans with preference for highly sulfated heparan sulfate and heparin〔J〕.Biochemistry，2011；50(13)：2650-9.

5Cvejic D，Selemetjev S，Savin S，etal.Apoptosis and proliferation related molecules (Bcl-2，Bax，p53，PCNA) in papillary microcarcinoma versus papillary carcinoma of the thyroid〔J〕.Pathology，2008；40(5)：475-80.

6llsley JN，Nakanishi M，Flynn C，etal.Cytoplasmic phospholipase A2 deletion enhances colon tumorigenesis〔J〕.Cancer Res，2005；65(7)：2636-43.

7Ferlazzo V，Daqostino P，Milano S，etal.Anti-inflammatory effects of annexin-1：stimulation of IL-10 release and inhibition of nitric oxide synthesis〔J〕.Int lmmunopharmacol，2003；3(10-11)：1363-9.

8鐘雪梅，陳 敏，鄧世山，等.AnnexinA1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義〔J〕.重慶醫學，2015；44(25)：3488-90.

9He ZY，Wen H，Shi CB，etal.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2010；16(37)：4670-6.

10Babbin BA，Lee WY，Parkos CA，etal.AnnexinA1 regulates SKCO-15 cell invasion by signaling through formyl peptide receptors〔J〕.J Biol Chem，2006；281(28)：19588-99.

〔2016-12-15修回〕

(編輯 李相軍)

InflunenceofsiRNAinterferingANXA1expressiononcytobiologicalcharacteristicspapillarythyroidcarcinomaTPC-1cells

ZHONGXue-Mei,LINYi-Min,LIQian-Qian,etal.

ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China

ObjectiveTo investigate the effects of ANXA1 on the cytobiological of papillary thyroid carcinoma cells by small RNA(siRNA)knock-down the ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.MethodsThe designed highly efficient siRNA was used to conduct the specific interference on ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.Then the influence on the papillary thyroid carcinoma cells proliferation was observed by CCK-8 method.ResultsThe designed siRAN efficiently inhibited the expression of ANXA1 mRNA in papillary thyroid carcinoma cells; furthermore, markedly suppressed the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.ConclusionsThe siRNA interfering ANXA1 could inhibit the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.

Papillary thyroid carcinoma；ANXA1；TPC-1 cells；siRNA

國家自然科學基金資助項目(No：81172496)

林一民(1965-)，女，主任技師，主要從事臨床血液體液檢驗工作。

鐘雪梅(1980-)，女，碩士，主要從事內分泌基礎與臨床研究。

R735.+1

A

1005-9202(2017)16-3920-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.005

1 重慶市腫瘤研究所 2 川北醫學院基礎醫學院