白細胞介素17A基因rs3748067位點單核苷酸多態性在廣西人群中的分布特點

黃華佗+王榮+陸玉蘭+覃海媚+向陽+郭靜+王春芳+韋葉生

【摘要】目的研究白細胞介素17A（IL-17A）基因rs3748067位點單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在廣西人群中的分布特點，比較其基因型和等位基因頻率在不同種族、地區人群間的分布差異。方法用SNaPshot SNP分型技術和DNA測序法檢測443例廣西人群rs3748067 位點SNPs，分析其基因型和等位基因頻率與國際人類基因組單體型圖（Haplotype map，HapMap）計劃公布的北京漢族人群（HapMap-CHB）、日本人群（HapMap-JPT）、非洲人群（HapMap-YRI）和印度人群（HapMap-GIH）間的差異。 結果廣西人群rs3748067位點存在GG、GA和AA三種基因型，其頻率分別為82.2%、17.4%和0.4%，G和A等位基因頻率分別為90.9%和9.1%。廣西人群IL-17A基因rs3748067位點基因型和等位基因頻率在同一種族不同性別間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。廣西人群IL-17A基因rs3748067位點基因型和等位基因頻率與HapMap-CHB人群比較差異無統計學意義（P>0.05），然而與HapMap-JPT、HapMap-YRI和HapMap-GIH人群比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論廣西人群存在IL-17A基因rs3748067位點多態性，與其他種族、地區人群比較存在不同程度的差異，這些差異可能是導致IL-17A基因相關疾病在不同種族、地區人群間臨床表現和發病率存在較大差異的因素之一。

【關鍵詞】IL-17A；基因多態；種族

中圖分類號：R394文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.001

【Abstract】ObjectiveTo explore the distribution characteristics of SNPs（single nucleotide polymorphisms）of IL-17A（Interleukin-17A）in gene rs3748067 locus in Guangxi population，and to compare its genotype and allele frequency among populations with different races and regions.MethodsThe SNPs in rs3748067 locus among 443 people in Guangxi was detected by SNaPshot SNP and DNA sequencing methods.Then their genotype and allele frequency were compared with HapMap-CHB，HapMap-JPT，HapMap-YRI and HapMap-GIH published by international HapMap（Haplotype map）project.ResultsGG，GA and AA genotypes existed in rs3748067 locus，and the frequency of them was 82.2%，17.4% and 0.4% respectively，and the frequency of G and A allele was 90.9% and 9.1% respectively.The genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus in Guangxi population were not statistically different between the same races（P>0.05）.Difference of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus between Guangxi population and HapMap-CHB population was not statistically significant（P>0.05），however，that of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus between Guangxi population and HapMap-JPT，HapMap-YRI and HapMap-GIH populations was statistically significant（P<0.01）.ConclusionThere is a polymorphism of IL-17A at gene rs3748067 in Guangxi population，with different levels of difference while comparing with other races and regions.And the difference may be one of the factors that causes difference of clinical manifestations and morbidity of IL-17A gene related diseases in populations among different races and region.

【Key words】IL-17A；genetic polymorphism；race

白細胞介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）為IL-17家族成員之一，同時也是最早被發現的成員[1]。輔助T細胞Th17為IL-17A的主要分泌細胞，此外IL-17A還廣泛表達于中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、γδ-T細胞和NK細胞等多種免疫、炎癥相關細胞中[2～3]。IL-17A通過與其異二聚體受體IL-17RA-IL-17RC結合發揮生物學作用，被活化后的IL-17RA-IL-17RC二聚體通過核因子KB 激活劑1（ACT1）激活NF-kB信號通路，引起促炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF 和 IL-8）、細胞集落刺激因子（G-CSF）以及CXCL1、CXCL2 和 CXCL8等趨化因子的釋放[4～5]，在系統性紅斑狼瘡、銀屑病、類風濕性關節炎、克羅恩病以及多發性硬化等多種自身免疫和炎癥相關疾病的發病中發揮重要作用[3]。IL-17A調節異常與多種免疫和炎癥疾病發病相關，然而，其具體機制目前尚未被完全闡明。近年來研究發現，IL-17A基因SNPs與兒童鏈球菌肺炎、肺結核、牙周炎、哮喘和動脈粥樣硬化等免疫炎癥相關疾病以及胃癌等發病相關[6～10]。目前，廣西人群IL-17A基因rs3748067多態性的研究尚未見文獻報道。因此，我們利用SNaPshot SNP分型技術和DNA測序法檢測rs3748067多態性，并將所得結果與國際人類基因組單體型圖（Haplotype map，HapMap）計劃公布的不同種族和地區人群的結果比較，分析不同種族和地區人群間rs3748067多態性的分布差異，旨在為后期IL-17A基因相關疾病的研究和群體遺傳學研究提供參考。endprint

1對象與方法

1.1研究對象研究對象共443 例，其中男性278 例，女性165 例，年齡25～84歲，均為右江民族醫學院附屬醫院體檢中心健康體檢者，通過各項血液和影像學檢查，未發現腫瘤以及肝臟、腎臟、心腦血管和神經系統疾病，排除遺傳病家族史。所有研究對象均為相互間無血緣關系的廣西地區人群。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA提取用EDTA-K2抗凝的采血管采集體檢者靜脈血3 ml，放于-50℃冰箱保存備用。基因組DNA提取采用試劑盒離心柱法（TIANamp Blood DNA Kit），提取后存放在-50℃冰箱保存備用。

1.2.2引物設計與合成 在NCBI上查找并選取包含rs3748067位點的適宜長度DNA片段，輸入網頁Primer 3.0軟件設計引物，得出序列交予上海天昊生物科技有限公司合成。rs3748067上游引物序列為：CACTCCTAGGGCCTGGCTTCTG，下游引物序列為：GGATGGAGCAGGATGGAGTGAA，延伸引物序列為：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCTGAACTTTTCTCATACTTAAA。

1.2.3PCR擴增及測序 PCR擴增反應體系（20 μL）包含1x GC-I buffer（Takara.），3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.），1 μL 樣本DNA和1 μL多重PCR引物，不足的體積用滅菌雙蒸水補充。PCR產物用5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶純化后用SNaPshot Multiplex Kit （ABI）進行延伸反應，延伸產物加入1 U SAP酶純化后上ABI3730XL測序儀測序，測序原始數據用GeneMapper 4.1（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA）分析。

1.3統計學方法統計學計算在SPSS 17.0軟件上完成。基因型和等位基因的頻率用直接計數法計算。基因型和等位基因數據屬于計數資料，不同組間基因型和等位基因頻率的比較分別用行×列表χ2檢驗和四格表χ2檢驗，檢驗水準：α=0.05。

2結果

2.1IL-17A基因rs3748067位點分型 IL-17A基因rs3748067位點PCR擴增產物大小為287 bp。測序結果表明，rs3748067位點包含GG、GA和AA三種基因型，其頻率分別為82.2%、17.4%和0.4%，G和A等位基因頻率分別為90.9%和9.1%。基因測序進一步證實我們的結果。見圖1。

圖A、B、C箭頭指向分別表示GG、GA和AA基因型。

2.2IL-17A基因rs3748067位點多態性在不同性別間的比較 經檢驗，廣西人群IL-17A基因rs3748067位點基因型數據符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）法則（P= 0.33），表明本次實驗所選研究對象具有群體代表性。IL-17A基因rs3748067位點基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3IL-17A基因rs3748067位點基因型和等位基因頻率與其他不同種族和地區人群的比較廣西人群IL-17A基因rs3748067位點基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI和HapMap-GIH人群比較差異有統計學意義（P<0.01），然而與HapMap-CHB人群比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2和表3。

3討論

編碼IL-17A的基因位于6號染色體短臂上（6p12.2），包含3個外顯子。國際人類基因組單體型圖計劃掃描發現，IL-17A基因存在多個功能性SNPs位點，這些位點多態性改變可能會引起IL-17A編碼活性及IL-17A基因相關疾病遺傳易感性發生改變，導致IL-17A相關疾病的發生和發展。最近研究表明，IL-17A基因rs3748067 SNP與胃癌、肺結核、冠心病、塵肺、布魯氏菌感染以及潰瘍性結腸炎等疾病的遺傳易感性相關，引起人們廣泛關注[10～15]。然而，基因多態性可因地理位置、環境、飲食和生活習慣以及種族不同呈現不同程度差異，而同一SNP位點在不同種族、地區人群間對疾病遺傳易感性的影響也表現出很大區別。例如，Vazgiourakis等[16]在希臘進行的病例對照研究中發現，CD40基因rs4810485位點基因型和等位基因在SLE組和對照組間比較差異有統計學意義，T等位基因降低了希臘人SLE的患病風險（OR=0.65，95% CI 0.54～0.79）。然而Piotrowski等[17]人卻在波蘭進行的病例對照研究中發現，rs4810485基因型和等位基因頻率在SLE組和對照組間比較差異無統計學意義。由此可見，不同種族和地區人群間正常人群基因多態性研究可為我們提供這些地區人群的遺傳背景資料，為與之相關疾病的遺傳多態性研究提供基礎理論依據和數據支持。

本研究發現，IL-17A基因rs3748067位點SNP在廣西人群不同性別間比較差異無統計學意義，表明rs3748067位點SNP在同一人群無性別間差異。進一步將廣西人群數據與國際人類基因組單體型圖計劃公布的HapMap-CHB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH人群比較發現，廣西人群rs3748067基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH人群比較差異均有統計學意義（P<0.01），然而與HapMap-CHB人群比較差異無統計學意義。廣西人群rs3748067 G等位基因頻率，與同一種族的HapMap-CHB人群G等位基因頻率相近，然而與HapMap-JPT、HapMap-YRI以及HapMap-GIH人群的G等位基因頻率相差較大。HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH和廣西人群屬于不同種族，地理位置和親緣關系遠，且在飲食和生活習慣上存在較大差異，這可能是造成他們之間遺傳差異較大的原因。而HapMap-HCB人群與廣西人群雖在飲食和生活習慣以及氣候上有較大差別，但二者屬同一種族，且地理位置和親緣關系較近，因此二者遺傳差異較小。以上基因型和等位基因的分析結果均與“親緣關系越近，基因型的分布差異越小”的遺傳定律吻合。endprint

隨著人類基因組計劃的完成，基因多態性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區的分散研究。基因多態研究的展開在解釋不同群體、個體對疾病特別是對復雜疾病的易感性和對各種藥物的耐受性以及對環境因子反應的表型差異方面起著很大的作用。本研究發現，廣西人群存在IL-17A基因rs3748067遺傳多態性，其基因型和等位基因頻率與不同種族、地區人群比較存在不同程度的差異。廣西人群IL-17A基因rs3748067遺傳多態性的研究將為群體遺傳學和IL-17A基因相關疾病的研究提供參考資料，同時可為廣西地區建立區域基因數據庫貢獻一份力量。

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