應(yīng)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根再生體系

劉 莉， 李培英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830052)

狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)，又名拌根草、鐵線草、爬地草、百慕大草(Bermudagrass)，系禾本科狗牙根屬C4型多年生草本植物[1]。狗牙根亦是我國(guó)分布廣泛、栽培應(yīng)用較多、最重要的暖季型草坪草之一[2-4]。目前，國(guó)產(chǎn)狗牙根品種匱乏，國(guó)內(nèi)栽培的狗牙根主要依賴(lài)進(jìn)口，存在品種較單一、抗逆性差、容易退化等問(wèn)題，極大地限制了狗牙根在草坪中的應(yīng)用，因此國(guó)家提倡開(kāi)發(fā)本土狗牙根資源，選育優(yōu)質(zhì)、高抗的狗牙根新品種，滿足市場(chǎng)需求[5]。

狗牙根育種主要手段包括常規(guī)育種及生物技術(shù)育種兩種方式，生物技術(shù)育種的瓶頸在于狗牙根胚性愈傷組織得率較低、且難以分化。狗牙根組培研究開(kāi)展較早，上世紀(jì)80年代Ahn以普通狗牙根未成熟花序?yàn)橥庵搀w誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，并獲得了再生植株[6]。此后狗牙根組培多以未成熟胚及花序?yàn)橥庵搀w開(kāi)展研究，但其取材困難且易受季節(jié)限制[7-9]。近些年來(lái)，以匍匐莖為外植體的組織培養(yǎng)也獲得了再生植株，其中，盧少云以匍匐莖為外植體建立了再生體系，并在再生植株中發(fā)現(xiàn)了狗牙根‘Tifeagle’的矮化變異體新株系TV4。匍匐莖取材簡(jiǎn)單，但仍存在消毒困難，易受污染的問(wèn)題[10]。相對(duì)而言，成熟穎果取材方便、消毒簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)建立再生體系較好的材料。國(guó)內(nèi)方面，胡張華在2003年首次以成熟胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)并獲得再生植株[11]，此后何陽(yáng)鵬、姜茜、陳瓊等都以成熟種子為材料進(jìn)行了狗牙根組培研究[12-14]。但已有研究大多采用單因素試驗(yàn)方法，可能得不到最優(yōu)組合，并且不能確定出各個(gè)階段起關(guān)鍵作用的因素[15-16]。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)方法[15,17]，不但可以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，還可以確定建立再生體系中各階段的主因素。在草坪草上，陳繼琴用正交試驗(yàn)法對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化[18]；劉君通過(guò)多因子正交試驗(yàn)篩選出草地早熟禾(PoapratensisL.)的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基，證明了用正交設(shè)計(jì)篩選愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是一種較好、可靠的方法[19]。因此，為了進(jìn)一步優(yōu)化‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根再生體系，本試驗(yàn)在陳瓊[14]的單因素法建立的再生體系的基礎(chǔ)上，采用了正交設(shè)計(jì)方法，探討生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、外源添加物等因素對(duì)‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根成熟種子愈傷誘導(dǎo)和分化的影響，為狗牙根生物技術(shù)育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中，試驗(yàn)材料為2012采于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪農(nóng)場(chǎng)的‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根(Cynodondactylon‘Xinnong No.1’)成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子表面消毒及愈傷組織誘導(dǎo) 挑選籽粒飽滿的‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根種子，脫殼，在清水中浸泡24 h，70%酒精處理2 min后，置于20%次氯酸鈉中浸泡20 min，無(wú)菌水沖洗多次。將滅菌后的狗牙根種子進(jìn)行橫切，挑選有胚部分，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，脯氨酸(Proline， Pro 或P)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine， 6-BA)按3因素3水平(L9)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行添加(表1)。

表1 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of induction medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每種培養(yǎng)基30瓶，每瓶接入20個(gè)外植體， 25±1.0℃條件下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)25 d后，觀察愈傷組織狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)愈傷數(shù)，計(jì)算出愈率。

1.2.2愈傷組織的繼代培養(yǎng) 挑取淡黃色顆粒狀的愈傷組織切割成3 mm左右的愈傷團(tuán)塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，脫落酸(abscisic acid， ABA)、2,4-D、6-BA按3因素3水平(L9)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行添加(表2)。

表2 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根繼代培養(yǎng)基試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of subculture medium Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個(gè)處理組合接種30瓶，每瓶6塊愈傷組織，溫度25±1.0℃、光照強(qiáng)度36 mmol·m-2·s- 1， 14 h光照與10 h黑暗培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷數(shù)、胚性愈傷的增殖數(shù)(直徑大于5 mm的胚性愈傷組織塊數(shù))、褐化數(shù)。計(jì)算胚性愈傷誘導(dǎo)率、愈傷增殖率以及褐化率。

1.2.3愈傷組織的分化培養(yǎng) 將胚性愈傷組織均勻地切割成3 mm左右團(tuán)塊，轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(表3)。

表3 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基Table 3 Embryogenic callus differentiation medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個(gè)處理接種30瓶，每瓶6塊胚性愈傷。分化30 d后，統(tǒng)計(jì)綠點(diǎn)數(shù)、再生小植株數(shù)(以出現(xiàn)3個(gè)芽為一個(gè)再生苗)、再生愈傷組織塊數(shù)，計(jì)算綠點(diǎn)率、再生愈傷組織頻率、小植株形成強(qiáng)度(小植株形成強(qiáng)度=小植株數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))。

1.2.4再生苗的生根與移栽 將分化培養(yǎng)的再生苗轉(zhuǎn)移到添加8 g·L-1瓊脂和15 g·L-1蔗糖的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2周后打開(kāi)蓋子，洗去培養(yǎng)基，室內(nèi)煉苗2 d，再移栽到含營(yíng)養(yǎng)土的花盆中。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)以正交設(shè)計(jì)作為分析方法，記錄3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)作為結(jié)果，對(duì)結(jié)果的極差分析及單因素方差分析采用Excel、Spss等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

接入外植體培養(yǎng)4 d后，一些白色透明、無(wú)固定結(jié)構(gòu)、松軟的愈傷組織逐漸產(chǎn)生；10 d出現(xiàn)出愈高峰，12 d左右開(kāi)始膨大，15 d愈傷長(zhǎng)至3～5 mm，誘導(dǎo)25 d后，愈傷已長(zhǎng)至5～11 mm。在愈傷誘導(dǎo)階段形成的愈傷主要有4種類(lèi)型：A型為半透明水漬狀愈傷(圖1-A)；B型為半透明水漬狀、帶有少數(shù)淡黃色顆粒的愈傷(圖1-B)；C型為淡黃色顆粒較多的愈傷(圖1-C)；D型為白色疏松狀的愈傷(圖1-D)。其中C型為胚性愈傷，B型可經(jīng)繼代改造為胚性愈傷，而A型和D型為不可再生的非胚性愈傷。不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷大小和狀態(tài)主要受2,4-D濃度的影響。2,4-D濃度為1.0 mg·L-1水平時(shí)，愈傷生長(zhǎng)速度較快，愈傷直徑可達(dá)8～11 mm，但愈傷質(zhì)量較差，形成的愈傷組織少數(shù)為B型、大多為A型和D型；當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，愈傷生長(zhǎng)速度適中，愈傷直徑可達(dá)4～8 mm，愈傷質(zhì)量較好，主要為B型和C型，但也有一定數(shù)量的D型愈傷；當(dāng)2,4-D濃度為4.0 mg·L-1時(shí)，愈傷生長(zhǎng)較慢，直徑為3～5 mm，愈傷質(zhì)量也較好，大多為B型和C型，也有一些A型愈傷。

圖1 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根愈傷組織類(lèi)型圖
Fig.1 Callus induction type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖1-A：半透明水漬狀愈傷組織；圖1-B：少數(shù)淡黃色顆粒的愈傷組織；圖1-C：淡黃色顆粒較多的愈傷組織；圖1-D：白色疏松狀愈傷組織
Note：Fig.1-A: translucent water-soaked callus; Fig. 1-B: a few light yellow particles callus;
Fig. 1-C: pale yellow particles more callus. Fig. 1-D: white loose callus

表4‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)
Table 4 The orthogonal test result of callus induction ofCynodondactylon‘Xinnong No.1’

處理Treatment因素及水平Factors and levels/mg·L-1出愈率Callus induction rate/%2,4-D6-BA脯氨酸123愈傷狀態(tài)Callus type11.00.01061.561.559.5B,D21.00.0520054.053.556.0A,B,D31.00.1040057.559.058.0A,B,D42.00.0120069.570.568.0A,B,C52.00.0540064.562.565.5B,C,D62.00.10056.057.558.5B,C,D74.00.0140051.053.053.0B,C84.00.05053.556.054.0A,B,C94.00.1020053.552.554.0A,B,CX157.83bB60.84aA57.55bAX263.61aA57.72bB59.28aAX353.61cC56.50bB58.22abAR10.004.341.73

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；X1、X2、X3分別代表3個(gè)不同水平的出愈率均值，R代表3個(gè)水平間的出愈率極差,下同

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, and different capital letters indicate significant differences at the 0.01 level;X1, X2 and X3 represent average callus induction rate of three different levels, and R represents the maximum difference between the 3 levels; The same below

由表4可知，對(duì)出愈率而言，不同2,4-D和6-BA濃度間均存在極顯著差異(P<0.01)，而不同脯氨酸濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的出愈率為63.61%，極顯著高于1.0 mg·L-1與4.0 mg·L-1水平 ；0.01 mg·L-16-BA水平下的出愈率為60.84%，極顯著高于0.05與0.1 mg·L-1水平；200 mg·L-1脯氨酸水平下的出愈率為59.28%，顯著高于不添加脯氨酸。由極差分析可知，各因素對(duì)出愈率的作用效果不同，其中 2,4-D的影響最大，其次為6-BA，脯氨酸。水平優(yōu)選后即可得出‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

2.2 愈傷組織的繼代

轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中2～5 d后，愈傷變得稀軟，形成E型愈傷(圖2-A)；大多愈傷之后逐漸干燥，一些形成緊實(shí)致密的F型可再生愈傷(圖2-B)，少數(shù)變成褐化的G型愈傷(圖2-C)，還有一部分出現(xiàn)生根現(xiàn)象的H型愈傷(圖2-D)，另外一些逐漸變得水漬化，需轉(zhuǎn)入新的繼代培養(yǎng)基。

圖2 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根愈傷組織類(lèi)型圖
Fig.2 Callus subculture type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖2-A：稀軟，粘稠狀的愈傷組織；圖2-B：呈淡黃色顆粒狀，質(zhì)地緊密的愈傷組織； 圖2-C：褐化的愈傷組織； 圖2-D：愈傷呈顆粒狀，有生根現(xiàn)象
Note：Fig.2-A: Callus was soft, sticky；2-B: Callus was pale yellow particles, close texture；2-C: Callus browning；2-D: Callus granular, a root phenomenon.

由表5可知，對(duì)胚性愈傷得率而言，不同6-BA、ABA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)， 2,4-D濃度間存在顯著差異(P<0.05)。其中2,4-D，6-BA，ABA的最優(yōu)濃度分別為2.0，0.20和2.0 mg·L-1，其胚性愈傷誘導(dǎo)率分別為52.96%，55.56%和56.85%。由極差分析可知，各因素對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)率的作用效果不同，其中2,4-D的影響最大，其次為ABA，6-BA。水平優(yōu)選后可得在‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根繼代試驗(yàn)中，胚性愈傷得率較高的培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

對(duì)愈傷增殖率而言(表5)，不同6-BA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)，不同2,4-D、ABA濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的愈傷增殖率達(dá)44.26%，顯著高于0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的愈傷增殖率達(dá)64.82%，極顯著高于0.05和0.10 mg·L-1；1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1ABA水平下的愈傷增殖率分別為47.03%和45.37%，都顯著高于3.0 mg·L-1水平，但這兩個(gè)水平間沒(méi)有顯著差異。由極差分析可知，各因素對(duì)愈傷增殖的作用效果不同，其中6-BA的影響效果最大，其次為ABA、2,4-D。水平優(yōu)選后，愈傷增殖率較高的培養(yǎng)基為：2,4-D (2.0 mg·L-1) +6-BA (0.20 mg·L-1) + ABA (1.0～2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

對(duì)褐化率而言(表5)， 2,4-D、6-BA濃度間存在極顯著(P<0.01)差異，但ABA濃度間不存在顯著差異。2.0 mg·L-12,4-D的褐化率僅為9.82%，顯著低于0.5和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的褐化率為12.04%，極顯著低于0.10 mg·L-1；由極差分析可知，對(duì)褐化率而言，2,4-D的影響最大，其次為6-BA和ABA。水平優(yōu)選后即可得褐化率較低的培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+ 6-BA(0.20 mg·L-1)+ ABA(1.0～3.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

綜合分析繼代培養(yǎng)中胚性愈傷率、愈傷增殖率和褐化率3個(gè)指標(biāo)，可確定‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根繼代培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)。此條件下的胚性愈傷率達(dá)71.67%，愈傷增殖率為61.67%，褐化率5.56%。

2.3 愈傷組織的分化

繼代改造后的胚性愈傷組織可轉(zhuǎn)移到不同的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷的再生培養(yǎng)。愈傷分化過(guò)程中，4種處理的綠點(diǎn)率、再生愈傷組織頻率、小植株再生強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及方差分析結(jié)果如表6所示。

表6 4種培養(yǎng)基對(duì)‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根愈傷分化的影響Table 6 Analysis of four medium’s effect on callus differentiation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

由表6可知，在‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根分化階段，MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基上的綠點(diǎn)率最高為86.67%，顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基(P<0.05)，而極顯著高于MS分化培養(yǎng)基和1/2MS分化培養(yǎng)基(P<0.01)，且未添加6-BA的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)在后期的分化過(guò)程中出現(xiàn)大量的毛狀根，愈傷逐漸褐化，直至死亡，因此最終小植株形成強(qiáng)度和再生愈傷組織頻率較低；接種在MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基上的胚型愈傷的小植株形成強(qiáng)度和再生愈傷頻率都極顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基(P<0.01)，其中再生愈傷頻率最高為24.45%，小植株形成強(qiáng)度最高為49.44%。綜合分析認(rèn)為，‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根的優(yōu)化分化培養(yǎng)基為添加1.0 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基。

2.4 再生苗的生根與移栽

轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基大約10～15 d，部分分化培養(yǎng)基上逐漸出現(xiàn)綠點(diǎn)(圖3-a)，20～25 d再生出叢生狀的再生綠色植株(圖3-b)，還有一些分化培養(yǎng)基上的愈傷長(zhǎng)出毛狀根并逐漸褐化直至死亡(圖3-c)。將分化的再生綠色植株轉(zhuǎn)移至無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，15 d后移栽到含有砂質(zhì)土壤的花盆中(圖3-d)，移栽成活率可達(dá)到100%。

圖3 ‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根的分化與再生
Fig.3 Regeneration and transplantation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

3 討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、各種外源添加物以及培養(yǎng)基種類(lèi)都會(huì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及小植株的再生產(chǎn)生影響，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是其中一個(gè)最關(guān)鍵的因素，調(diào)節(jié)激素種類(lèi)和水平，可以很大程度上優(yōu)化組培再生體系。但是在具體試驗(yàn)中，激素種類(lèi)以及濃度組合錯(cuò)綜復(fù)雜，單因素試驗(yàn)往往會(huì)錯(cuò)過(guò)最佳組合。實(shí)踐證明，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)配方的優(yōu)化，是一個(gè)切實(shí)可行的方法，能夠發(fā)揮正交設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)：即用最少的處理得到最佳的組合；另一方面可以確定組織培養(yǎng)各個(gè)階段的關(guān)鍵因素[20]。國(guó)內(nèi)已有將正交設(shè)計(jì)法應(yīng)用于草坪草組織培養(yǎng)，揭示愈傷誘導(dǎo)階段各因素的作用效果的相對(duì)大小，并篩選出合理培養(yǎng)條件的研究報(bào)道[18-19]。本研究首次將正交法應(yīng)用于草坪草愈傷組織的繼代培養(yǎng)中，具有重要的實(shí)踐意義。

提高愈傷誘導(dǎo)率是優(yōu)化‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根再生體系的第一步，沒(méi)有高頻的誘導(dǎo)率，就無(wú)法得到大量的、高品質(zhì)的愈傷組織，其隨后分化得到的再生植株也就少。從目前狗牙根組織培養(yǎng)相關(guān)研究文獻(xiàn)來(lái)看，比較一致的觀點(diǎn)是2,4-D是愈傷誘導(dǎo)階段最重要的激素；本試驗(yàn)證實(shí)，愈傷誘導(dǎo)率隨2,4-D濃度升高呈先增后降的趨勢(shì)，因此添加2.0 mg·L-12,4-D是愈傷誘導(dǎo)的最適濃度，這與陳瓊以成熟穎果為外植體研究結(jié)果一致[14]；但據(jù)Chaudhury和Qu[21]的研究來(lái)看，以未成熟花序?yàn)橥庵搀w時(shí)低濃度2,4-D更利于愈傷組織的誘導(dǎo)，一般適宜濃度為1.0 mg·L-1,這些都可以證實(shí)，不同外植體對(duì)2,4-D的敏感程度有所不同。而6-BA對(duì)愈傷誘導(dǎo)的作用比2,4-D弱，一般與其他生長(zhǎng)素配合使用，可以提高愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率[22]。低濃度的6-BA(0.01 mg·L-1)有利于形成淡黃的、緊湊的、有顆粒狀突起的胚性愈傷，但濃度過(guò)高反而會(huì)抑制愈傷誘導(dǎo)、影響愈傷質(zhì)量[23]。本研究表明，脯氨酸對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，錢(qián)海豐等研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸對(duì)高羊茅(FestucaelataKeng)愈傷誘導(dǎo)沒(méi)有效果,而Shetty曾報(bào)道脯氨酸能促進(jìn)紅頂草(AgrostisalbaL.)愈傷的誘導(dǎo)[24]；Shaoyun Lu的研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸對(duì)狗牙根的愈傷誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用[25]，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。說(shuō)明脯氨酸在不同草坪草的愈傷誘導(dǎo)中效果可能不一致，這可能由不同草坪草中內(nèi)源脯氨酸含量的不同引起的。

繼代培養(yǎng)基中降低生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例，對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生起重要作用[26]，與本試驗(yàn)的結(jié)論一致。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)提高6-BA的濃度可顯著提高胚性愈傷的誘導(dǎo)和增殖率，減少褐化。原因可能是6-BA作為外源激素，可改善細(xì)胞內(nèi)源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化狀態(tài)，有利于胚性愈傷組織的發(fā)生，從而增加分化頻率[27]。本研究表明，高濃度的ABA可促進(jìn)胚性愈傷組織的生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)樵缙谂咛グl(fā)育要求高滲條件，而增加ABA含量有利于提高培養(yǎng)基的滲透勢(shì)[28]。

狗牙根成熟穎果誘導(dǎo)的愈傷組織存在根先于莖葉發(fā)生的現(xiàn)象，而長(zhǎng)出毛狀根后就很難發(fā)育成再生植株了，愈傷很快褐化、變黑。一些作物器官發(fā)生中也常存在這種現(xiàn)象[29-30]。胚性愈傷組織只有轉(zhuǎn)入到生長(zhǎng)素含量很低或完全沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，才能發(fā)育為成熟的體細(xì)胞胚并形成植株，而6-BA可減少根的發(fā)生，促進(jìn)愈傷向再生植株的方向發(fā)展[30-31]。因此本試驗(yàn)中分化培養(yǎng)基未添加2,4-D，而添加了一定量的6-BA。試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)入繼代后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入到不含激素的培養(yǎng)基以及含有6-BA的培養(yǎng)基中都可分化出再生植株，但是添加6-BA的培養(yǎng)基分化的小植株數(shù)量顯著高于未添加6-BA的培養(yǎng)基。這可能是在愈傷誘導(dǎo)和繼代過(guò)程中都添加了相對(duì)較高濃度的2,4-D，2,4-D的積累使得內(nèi)源生長(zhǎng)素的濃度升高，而生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比例可能控制著根的發(fā)育或者莖的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究對(duì)‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根進(jìn)行再生體系的優(yōu)化試驗(yàn)，得出‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根優(yōu)化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基，此時(shí)愈傷誘導(dǎo)率達(dá)69.5%；愈傷繼代的優(yōu)化培養(yǎng)基為2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基，其胚性愈傷率和愈傷增殖率分別可達(dá)71.67%和61.67%，且褐化率較低；優(yōu)化的分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA，小植株形成強(qiáng)度可達(dá)49.44%。

本研究?jī)?yōu)化了‘新農(nóng)1號(hào)’狗牙根的再生體系。誘導(dǎo)培養(yǎng)基下的愈傷誘導(dǎo)率差別不大；優(yōu)化的繼代培養(yǎng)基下的胚性愈傷率提高了21.5%，愈傷增殖率提高了20.4%，且褐化率下降了10%；優(yōu)化的分化培養(yǎng)基下小植株強(qiáng)度提高了32.7%。