紫花苜蓿苗期耐鹽指標篩選及耐鹽性綜合評價

田小霞， 毛培春， 李杉杉， 郭 強， 孫建明， 張 琳， 孟 林*

(1. 北京市農(nóng)林科學院北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心， 北京 100097；2. 北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心， 北京 100029)

土壤鹽漬化使得土壤溶液滲透壓增大[1]，土體透水性、通氣性變差，養(yǎng)分有效性降低，影響植株的正常生長，并阻礙農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展[2-3]。因此，如何合理開發(fā)利用鹽漬土資源一直是國際生物科學研究的重大課題之一。實踐證明，應用生物措施改良鹽漬土是有效措施之一，其中發(fā)掘更多的耐鹽植物，尤其是耐鹽優(yōu)良牧草，既可以充分利用鹽堿地發(fā)展畜牧業(yè)和現(xiàn)代鹽土農(nóng)業(yè)，又可以遏制土地退化、促進生態(tài)良性循環(huán)[4]。植物在鹽分脅迫下，其形態(tài)特征、生理生化或分子機制發(fā)生一定程度的變化，但不同植物種間和不同品種間，甚至同種不同種質(zhì)材料間其耐鹽性都存在明顯的差異[5]。因此，從現(xiàn)有的種質(zhì)材料中篩選出耐鹽性強的種質(zhì)材料是植物抗逆雜交育種及基因工程育種的主要手段之一。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種全球廣泛栽培的豆科草本植物，被譽為“牧草之王”，屬中等耐鹽堿植物，在增加優(yōu)質(zhì)飼料生產(chǎn)、推動畜牧業(yè)發(fā)展和改良土壤中發(fā)揮了重要作用[6]。因此，選育耐鹽苜蓿品種，是開發(fā)利用鹽堿地的有效措施之一，其中苜蓿種質(zhì)材料耐鹽性的評價鑒定則是培育耐鹽苜蓿品種以及研究耐鹽機理的基礎(chǔ)。目前在苜蓿耐鹽品種和種質(zhì)鑒定綜合評價方面已有大量相關(guān)報道。AL-khatib等[7]研究表明，苜蓿苗期階段對鹽比較敏感，是耐鹽鑒定的最佳時期。劉春華等[8]將69個苜蓿品種的耐鹽性分為三級，劉彥等[9]對19個苜蓿品種進行了耐鹽堿研究，篩選出3個耐鹽性強的苜蓿品種。李源等[10-11]對19份苜蓿種質(zhì)材料進行綜合評價，篩選出4份耐鹽性強的種質(zhì)材料；以48份苜蓿種質(zhì)為研究材料，采用室內(nèi)盆栽法，以存活率和苗高及地上、地下植株干重等形態(tài)指標進行聚類分析，從48份材料中篩選出15份耐鹽種質(zhì)材料。岳明強等[6]研究表明營養(yǎng)液培養(yǎng)法是苜蓿材料苗期耐鹽性鑒定的最優(yōu)方法。鑒于此，本研究以48份紫花苜蓿種質(zhì)為試驗材料，利用多元統(tǒng)計分析法對鹽脅迫下紫花苜蓿苗期的形態(tài)及生理指標進行耐鹽性綜合評價，探討各指標與耐鹽性之間的關(guān)系，篩選出耐鹽性較高的種質(zhì)材料，并建立紫花苜蓿種質(zhì)材料苗期耐鹽性預測回歸模型，以期為規(guī)范、準確的苜蓿耐鹽性種質(zhì)資源評價及新品種選育提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為48份紫花苜蓿，其中對照(CK)為‘中苜一號’， AZ-88NDC由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供，其余46份為俄羅斯引進材料，由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1材料培養(yǎng)與處理 試驗于2015年春、夏季進行。將紫花苜蓿種子用5%NaClO消毒15 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后置于墊兩層濾紙的培養(yǎng)皿中。發(fā)芽培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)中，培養(yǎng)條件：光周期16 h(晝)/8 h(夜)，光強約為600 μmol·m-2s-1，相對濕度為60%～80%。發(fā)芽7 d后，挑選發(fā)芽一致的幼苗置于內(nèi)徑35 cm×27 cm×10.5 cm(長×寬×高)長方形無孔塑料水培盒中，盒外用錫箔紙包裹，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，幼苗用0.5 cm厚的聚苯乙烯泡沫板和海綿固定，水培盒每間隔3 h通氣1 h，試驗在北京市農(nóng)林科學院日光溫室進行，期間室內(nèi)日平均溫度(25±3)℃，平均相對濕度(60±5)%，每7 d更換一次營養(yǎng)液。待幼苗三葉期時開始鹽處理試驗，根據(jù)前期試驗結(jié)果，設(shè)置5種濃度梯度：0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，一次性將NaCl按試驗設(shè)計加入Hoagland營養(yǎng)液中，每處理重復3次。脅迫處理15 d后取樣，葉片相對電導率和葉綠素的測定取相同部位葉片，3次重復。

1.2.2測定指標與方法 苗高(cm)：用直尺測量植株垂直生長高度，于處理第一天和試驗結(jié)束時定株測定。

生長速度(cm·d-1)=(處理結(jié)束時苗高-處理第一天苗高)/處理天數(shù)

植株干重(g)：稱重法。脅迫處理結(jié)束后，取整株植株置于信封袋中，烘箱中烘干至恒重，稱其干重。

綠葉數(shù)：復葉葉片綠色為2/3以上即為綠葉。

存活率(%)= (脅迫處理后存活苗數(shù)/原幼苗總數(shù))×100%。

葉片相對電導率(%)：使用DDS-307型電導率儀測定。

葉綠素含量(mg·g-1鮮重)：直接浸提法(無水乙醇∶丙酮=1∶1溶液)。

1.3 數(shù)據(jù)分析及評價方法

1.3.1單項指標耐鹽系數(shù)

(1)

1.3.2紫花苜蓿各綜合指標的隸屬函數(shù)值

(2)

(3)

式中：μ(Xj)表示第j個指標的隸屬函數(shù)值；Xj表示第j個指標值；Xmin表示第j個指標最小值；Xmax表示第j個指標最大值，指標與耐鹽性成正相關(guān)用隸屬函數(shù)公式(2)計算隸屬函數(shù)值，指標與耐鹽性成負相關(guān)用反隸屬函數(shù)公式(3)計算隸屬函數(shù)值。

1.3.3各綜合指標的權(quán)重

(4)

式中：Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權(quán)重；Vj表示經(jīng)主成分分析所得各材料第j個綜合指標的貢獻率。

1.3.4耐鹽綜合評價值

(5)

式中：D值為各紫花苜蓿在鹽脅迫條件下由綜合指標評價所得的耐鹽性綜合評價值。

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行相關(guān)性分析和主成分分析，基于歐氏距離系統(tǒng)聚類法進行聚類分析，運用隸屬函數(shù)法和主成分賦予權(quán)重法計算各種質(zhì)的耐鹽性綜合得分，準確鑒定每份材料耐鹽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項指標的耐鹽系數(shù)及相關(guān)性分析

根據(jù)公式(1)計算紫花苜蓿種質(zhì)材料各單項指標的耐鹽系數(shù)，由表1可知，生長速度(GR)、綠葉數(shù)(NGL)、葉片葉綠素含量(Chl)、苗高(SH)、存活率(SR)、植株干重(DW)等6個指標與對照(0.0%)相比較均有所下降(ω<1)，相對電導率REC與對照相比有所增加。由表1可知，相同指標下不同材料的耐鹽系數(shù)不同，不同指標下相同材料的耐鹽系數(shù)也存在差異。從單項指標分析，例如，GR：48份紫花苜蓿耐鹽系數(shù)范圍為0.394～0.743，其中，耐鹽系數(shù)大于0.7的有4份材料，M-1380耐鹽系數(shù)最高；M-820材料的耐鹽系數(shù)最低;REC：耐鹽系數(shù)范圍為1.130～3.181，M-7876，M-603材料的耐鹽系數(shù)較高，值為分別為3.181，3.101，M-857，M-1380等4份材料耐鹽系數(shù)較低，均低于1.2；DW：耐鹽系數(shù)范圍為0.430～0.878，M-785，M-809等5份材料的耐鹽系數(shù)較高，均高于0.8，M-905，M-7843等7份材料的耐鹽系數(shù)較低，均低于0.5。M-1380材料在GR，SH，SR指標中耐鹽性表現(xiàn)較好，但在NGL，Chl中表現(xiàn)較差。M-244材料在NGL，SR，DW指標中耐鹽性表現(xiàn)較差，但在GR和Chl指標中耐鹽性表現(xiàn)較好。M-785材料的DW耐鹽性表現(xiàn)最好，但在GR，NGL，Chl，GR等指標中耐鹽性表現(xiàn)較差。

采用雙變量相關(guān)性分析法對48份紫花苜蓿種質(zhì)的7個指標耐鹽系數(shù)進行相關(guān)性分析，由表2可知：GR與NGL，SH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.381，0.602，GR與Chl呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.353；Chl與SH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.377；DW與SH呈顯著負相關(guān)、與REC呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。說明這7項指標之間均存在不同程度相關(guān)性，因此他們所提供的信息有一定的重復性，而耐鹽性是一種綜合性狀的表現(xiàn)，用單項指標來評價紫花苜蓿耐鹽性具有一定片面，不能準確鑒定出供試材料的耐鹽性。因此，為彌補單項指標進行耐鹽性評價的不足，需要進行其他多元統(tǒng)計分析。

表1 各單項指標的耐鹽系數(shù)ω值Table 1 ω value of saline tolerance coefficient of each indexs

表2 各單項指標的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 2 Correlation matrix of each index

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)；**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)

Note：*indicate significant correlation at the 0.05 level；**indicate significant correlation at the 0.01 level

2.2 供試紫花苜蓿耐鹽指標的主成分分析

通過SPSS 19.0軟件對供試紫花苜蓿各指標進行主成分分析，結(jié)果如表3所示。第1主成分的貢獻率是30.836%，第2主成分的貢獻率為21.649%，第3主成分的貢獻率為17.647%，第4主成分的貢獻率為11.371%，第5主成分的貢獻率為8.641%，五者累計貢獻率達90.144%>85%，基本代表了供試材料各指標的絕大部分信息，其余成分可以忽略不計，因此，可以將這5個主成分用于紫花苜蓿耐鹽性分析。另外，第1主成分中，SH，GR，NGL耐鹽系數(shù)的特征向量較高，分別為0.572，0.513，0.406，表明在第1主成分中，這3個耐鹽指標為主要的作用因子；在第2主成分中葉片Chl，SR耐鹽系數(shù)的特征向量較高，分別為0.675，-0.451，表明第2主成分中這兩者為主要作用因子；在第3主成分中，SR，NGL耐鹽系數(shù)特征向量較高，分別為0.624，0.559，表明第3主成分中這兩者為主要作用因子。

表3 供試紫花苜蓿苗期耐鹽指標的主成分分析Table 3 Principal component analysis of salt tolerance indexes at seedling stage of alfalfa germplasms

2.3 供試紫花苜蓿綜合指標值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值、預測值及耐鹽性評價

根據(jù)各單項指標耐鹽系數(shù)和各綜合指標的特征向量求出紫花苜蓿材料5個綜合指標值，根據(jù)隸屬函數(shù)公式(2)，(3)計算出相對應的隸屬函數(shù)值，由權(quán)重公式(4)計算各綜合指標的權(quán)重Wj。經(jīng)計算，5個綜合指標的權(quán)重分別為：0.342，0.240，0.196，0.126，0.096(表4)。用公式(5)計算各個紫花苜蓿材料的耐鹽性綜合評價值D值，并根據(jù)D值對其耐鹽性進行強弱排序(表4)，其中M-1409的D值最大，表明其耐鹽性最強；M-820的D值最小，表明其耐鹽性最差。

表4 各材料綜合指標值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值、預測值及綜合評價Table 4 The value of comprehensive index, index weight, subordinative function, D value, prediction and comprehensive valuation of each material

采用系統(tǒng)聚類法對D值進行聚類分析，可將48份材料劃分為4類：M-7876，M-7856、中苜一號等11份材料為第Ⅰ類，屬于強耐鹽性；M-7843，M-1498，M-1457等18份材料為第Ⅱ類，屬于中等耐鹽性；M-871，M-1053，M-1153等10份材料為第Ⅲ類，屬于弱耐鹽性；M-905，M-1026，M-857等9份材料為第Ⅳ類，屬于敏鹽性(圖1)。

圖1 48份紫花苜蓿材料聚類樹狀圖
Fig.1 The dendrogram of clusters for 48 alfalfa accessions

2.4 耐鹽性鑒定中耐鹽指標選擇及供試材料耐鹽性預測

以耐鹽性綜合評價D值為因變量，各單項指標耐鹽系數(shù)ω做自變量，采用多元逐步回歸分析法建立最優(yōu)回歸方程：D=-0.522+0.779GR+0.382SH+0.084REC+0.297SR，該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R=0.890，F(xiàn)=110.14，P=0.001，方程顯著。由方程可知，在7個單項指標中，上述4個指標對耐鹽性有顯著影響，因此在供試材料耐鹽性鑒定中可有選擇地測定這4個指標來簡單化耐鹽性鑒定。同時可在相同條件下測定其他紫花苜蓿種質(zhì)材料上述4個指標的耐鹽系數(shù)，利用該方程可預測其他種質(zhì)材料的耐鹽性。

通過回歸方程預測供試紫花苜蓿種質(zhì)材料苗期耐鹽性，得到耐鹽性預測值(表4)，對48份材料的耐鹽性綜合評價值與預測值做簡單相關(guān)分析可得相關(guān)系數(shù)R=0.944**，達極顯著水平。說明用此回歸方程對供試紫花苜蓿耐鹽性進行預測效果較好。

3 討論

不同研究者對于紫花苜蓿耐鹽性鑒定材料的脅迫方法、生長時期、耐鹽性鑒定指標等有不同的觀點，于卓等[12]認為紫花苜蓿苗期對鹽分反應較發(fā)芽期更為敏感，McCoy[13]研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿在苗期進行耐鹽性篩選評價更容易，岳明強等認為[6]營養(yǎng)液法與生產(chǎn)實踐基本一致，是苜蓿材料耐鹽性鑒定的最優(yōu)方法；因此，本試驗采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法，選擇苗期進行苜蓿種質(zhì)材料的耐鹽性鑒定。植物耐鹽性是一個受多種因素影響的復雜數(shù)量性狀，不同植物品種、不同種質(zhì)資源間耐鹽性存在較大差異，且耐鹽性機制也不相同，從而使得不同植物品種、不同種質(zhì)材料在鹽脅迫條件下對某一具體指標的反應也不盡相同[14-15]。因而，用單項指標難以全面準確地反映植物品種、種質(zhì)材料的耐鹽能力，應用多項指標綜合評價植物的耐鹽性[16-17]。本試驗選用較為簡單、便捷、直觀的7個指標進行測定，同時為消除試驗材料間的固有差異，選擇各指標的耐鹽系數(shù)(不同濃度處理下平均值和對照的相對值)來比較材料的耐鹽能力，在此基礎(chǔ)上應用多元統(tǒng)計分析方法對紫花苜蓿苗期的耐鹽性進行綜合評價。

通過對供試紫花苜蓿種質(zhì)材料7項指標的耐鹽系數(shù)進行相關(guān)分析和主成分分析，將原來的7個單項指標轉(zhuǎn)換成5個彼此獨立的綜合指標，再根據(jù)各綜合指標的貢獻率求出各材料每一個綜合指標值[CI(x)值]及相對應的隸屬函數(shù)值[μ(x)]，依據(jù)各綜合指標的權(quán)重進行加權(quán)后，得到試驗材料苗期耐鹽性的綜合評價值(D值)，比較客觀地反映了各材料的耐鹽能力。通過對D值聚類分析，將48份試驗材料劃分為強耐鹽性、中等耐鹽性、弱耐鹽性和敏鹽性4種類型。進一步利用逐步回歸法建立了紫花苜蓿種質(zhì)材料苗期耐鹽性預測回歸模型：D=-0.522+0.779GR +0.382SH +0.084REC+0.297SR，可考慮在相同的鹽脅迫條件下，以植株GR，SH，REC，SR這4個指標直接運用于D值計算并進行耐鹽能力評價，使苜蓿耐鹽性鑒定與利用研究預測更加快速、簡單，也可為抗逆性栽培、育種及種質(zhì)材料的鑒定與篩選提供依據(jù)。劉妍妍等[18]比較了16個小麥(TriticumaestivumL.)品種苗期的耐鹽性，指出苗高生長量可以作為小麥耐鹽性的篩選指標。張耿等[19]研究表明苗高能夠真實反映鹽脅迫下植株的生長狀況，可以直接鑒定牧草的耐鹽性；吳欣明等[20]研究指出苗高指標是羊茅(FestucaovinaL.)屬植物耐鹽性評價中最直觀有效的指標，王保平等[21]也研究指出苗高可以作為一表觀指標來衡量苜蓿苗期的耐鹽性。相對電導率的變化是反映植物細胞膜傷害程度的指標之一[10]，在鹽脅迫逆境下，植物細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)離子和可溶物大量外滲，使得細胞膜受到不同程度的破壞，通過電導法測定植物的相對電導率，可以反映植物受傷害的程度，是檢驗植物受逆境脅迫后細胞膜受損傷程度的重要指標[22-23]。王運琦等[24]研究表明細胞質(zhì)膜透性可以作為紫花苜蓿耐鹽性評價的指標之一。謝楠等[25]研究認為將飼用黑麥(Secalecereale)、小黑麥苗期鹽脅迫后的存活率作為評價指標對各試驗材料進行耐鹽性評價，不僅可以直接反映出各試驗材料間的耐鹽性強弱，而且與耐鹽指數(shù)法等結(jié)果大體趨勢一樣，劉春華等[8]研究指出存活率可以作為評價苜蓿品種間耐鹽性差異的指標。

雖然應用綜合指標評價植物的耐鹽性觀點已被研究者廣泛接受，但是怎樣對多項指標綜合應用且又定量的報道仍較少[15]，本文對48份紫花苜蓿種質(zhì)材料的耐鹽能力進行綜合評價，避免了單項指標帶來的片面性，且由于各種質(zhì)材料的耐鹽綜合評價值(D值)本身是一個[0,1]閉區(qū)間的無量綱系數(shù)[14]，使得各種質(zhì)材料間耐鹽性的差異具有可比性。由表4可知，供試紫花苜蓿種質(zhì)材料中，M-1409的綜合評價值D值最大，耐鹽性最強，但M-1409的5個綜合指標的隸屬函數(shù)值在不同綜合指標的隸屬函數(shù)值差異性較大，例如：在綜合指標CI(5)的隸屬函數(shù)值最大為1.000，而綜合指標CI(3)的隸屬函數(shù)值僅為0.435；而M-1380的CI(1)、M-325的CI(2)等的隸屬函數(shù)值最大，均為1.000，說明紫花苜蓿種質(zhì)材料不同其耐鹽機制也不相同。本試驗的材料為紫花苜蓿，且本試驗研究預測方程和篩選耐鹽指標是否適合于其他苜蓿材料的耐鹽性鑒定，則有待于進一步的研究與驗證。

4 結(jié)論

通過多元統(tǒng)計分析方法得出綜合評價D值可定量得知紫花苜蓿材料的耐鹽性大小。用系統(tǒng)聚類法對D值進行聚類分析，可將48份材料劃分為4個類群：第Ⅰ類為強耐鹽性：M-1409，M-325，M-7835，M-1380等11份種質(zhì)材料；第Ⅱ類是中等耐鹽性：M-832，M-653，M-1215，M-1445等18份種質(zhì)材料；第Ⅲ類為弱耐鹽性：M-712，M-7765，M-7823，M-785等10份種質(zhì)材料；第Ⅳ類為敏鹽性：M-1104，M-882，M-809，M-686等9份種質(zhì)材料。

通過逐步回歸分析方法建立了紫花苜蓿種質(zhì)材料苗期耐鹽性預測回歸模型：D=-0.522+0.779GR+0.382SH +0.084REC+0.297SR。在相同逆境條件下，可通過測定GR，SH，REC，SR等4個指標進行材料耐鹽性強弱的快速檢測和預測。