大黃素固相脂質納米粒對大鼠帕金森模型的治療效果

王 霞，孟 敏，吳玉瓊，李金成，史彥斌

(1. 甘肅省人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2. 甘肅省第二人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000； 3. 蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000)

大黃素固相脂質納米粒對大鼠帕金森模型的治療效果

王 霞1，孟 敏1，吳玉瓊2，李金成3，史彥斌3

(1. 甘肅省人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2. 甘肅省第二人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000； 3. 蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000)

目的 評價大黃素固相脂質納米粒對大鼠帕金森模型的防治效果，為大黃素新制劑的研發提供參考。方法 采用乳化蒸發-低溫固化法，應用單硬酯酸甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40和聚山梨酯(吐溫-80)(3∶1，w/w)將大黃素制成固相脂質納米粒，通過口服給藥，調查其對6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘發的帕金森病模型大鼠的行為學、中腦組織中兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)和單胺氧化酶B(MAO-B)含量的影響，評價其對帕金森癥的防治作用。結果 大黃素固相脂質納米粒在透視電鏡下觀察，外觀呈圓球形，粒徑介于40～100 nm；與生理鹽水組帕金森模型大鼠比較，大黃素固相脂質納米粒能夠顯著降低帕金森模型大鼠的中腦組織中的COMT和MAO-B濃度，大黃素混懸液能顯著降低帕金森模型大鼠中腦組織中MAO-B濃度，但對COMT濃度無顯著影響。結論 大黃素固相脂質納米粒通過降低6-OHDA誘發的帕金森模型大鼠腦內的COMT和MAO-B水平發揮治療帕金森癥的作用，其效果優于混懸液。

帕金森障礙；大黃素；固相脂質納米粒

大黃素(1， 3， 8-三羥基-6-甲基蒽醌)是一種廣泛存在于蓼科植物大黃、首烏和虎杖中植物中的蒽醌類衍生物?，F代藥理學研究表明，大黃素具有瀉下[1]、抗腫瘤[2-4]、神經保護[5-6]、降脂降血糖[7]、抗感染[8]、抗微生物[9]等生物活性。

隨著我國人口的老齡化，帕金森癥的發病率呈現上升趨勢?，F代醫學認為帕金森癥可能與泛素-蛋白酶體系統功能障礙與蛋白分解障礙、神經遞質多巴胺減少、氧化應激、神經營養因子缺乏、細胞凋亡等多種因素有關[10-11]。單胺氧化酶B(MAO-B)和兒茶酚氧位甲基轉基酶(COMT)高表達均可使多巴胺減少，導致帕金森癥狀[12-13]。文獻報道大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均具有保護神經活性[6]。大黃素能顯著抑制腦缺血再灌注后細胞間黏附分子1的表達[14]，降低腦缺血組織中NF-κB mRNA表達水平，降低大腦皮層神經元β-淀粉樣蛋白誘導的神經毒性[15]，減少神經元凋亡和腦梗死體積而表現出神經保護活性[16]。由此可見，大黃素是一種具有潛在神經保護活性的天然蒽醌類化合物。

Liu[17]和Teng等[18]報道大鼠口服給藥后，大黃素進入體循環主要以葡萄糖醛酸化代謝產物的形式存在，首過效應明顯。大黃素與葡萄糖醛酸結合而使自身極性增強，進而排出體外，從而在一定程度上導致大黃素體內生物利用度低。為了克服大黃素口服生物利用度低的不足，一些藥物制劑新技術應用于大黃素的新型給藥系統，如大黃素納米粒[19]、脂質體[20]、聚合物膠束[21]、固相脂質納米粒[22]和納米乳[23]等。

本課題組采用乳化蒸發-低溫固化法，應用單硬酯酸甘油酯和聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40/吐溫-80(3∶1，w/w)將大黃素制成了固相脂質納米粒，通過口服給藥，調查其對帕金森模型大鼠的行為學、中腦組織的MAO-B、COMT含量的影響，探討其對帕金森癥的防治效果，為大黃素類藥物新制劑的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 大黃素對照品，純度>98%，批號：110757，規格：20 mg，購自中國食品藥品檢定研究院；單硬酯酸甘油酯，批號：20150217，規格：100 g，蘭州旋光化學技術有限公司；泊洛沙姆188，批號：P08978，規格：250 g，阿達瑪斯試劑(上海)有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，規格：1 kg，批號：81088756p0，德國BASF公司；6-羥基多巴胺(6-OHDA)，純度>98.5%，批號：083M4624V，規格：5 mg，美國Sigma公司；鹽酸阿撲嗎啡(APO)，純度>98.5%，批號：SLBG9333V，規格：100 mg，美國Sigma公司；大鼠單胺氧化酶-B(MAO-B)和兒茶酚氧位甲基轉基酶(COMT)ELISA試劑盒，批號：201608，武漢華聯科生物技術有限公司；甲醇(色譜純)，批號：20151106083，山東禹王實業有限公司化工分公司。

1.2 動物 Wistar大鼠，雄性，250～320 g，清潔級，購自蘭州大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(甘)2005-0007，使用許可證號:SYXK(甘)2005-0007。所有動物均食用全價營養配合飼料，自由攝食飲水。

1.3 儀器 Waters 2998 高效液相色譜儀(Waters Co.， Ltd， USA)、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)、RE-52AA 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)、JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、CR21GIII 日立高速離心機(株式會社日立制作所，日本)、CPA225D 數顯電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)、JEM-1200EX 型透射電鏡(JEOL公司，日本)； Zetasizer Nano 3600 激光動態散射儀(馬爾文儀器有限公司，英國)；大鼠腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

四要提升設施建設水平，積極整合渠道防滲、管道灌溉、水稻控灌、土壤墑情預報、大溝蓄水等節水農業灌溉技術，充分利用空中、地表、地下水資源，實現農田輸水節水、生態節水、生育節水，提高水份生產率，建設一批節水工程；緊緊圍繞現代化農田水利，分區建成滿足“堤固河暢，溝保渠硬，水清岸綠，生態農田，管理民主，良性運行”要求的流域性萬畝以上高標準農田水利小區，著力建設末級溝（渠）系工程，從溝渠路配置方式、渠道硬化、灌溉方法、農業生產等方面優化末級渠道建設和灌溉技術方案，解決農田“最后一公里”輸水問題。

1.4 試驗藥物制備

1.4.1 大黃素的提取與純化 甘肅掌葉大黃塊狀根莖，來源：甘肅禮縣，存樣憑證：No. 856002，鑒定人：李建銀(蘭州大學藥學院生藥學研究所)。掌葉大黃根莖粉碎，粉末按照1:5(w/v)與20%硫酸混合，70 ℃酸解，抽濾，濾渣水洗后干燥。按照1:30(w/v)加入90%乙醇，超聲提取，抽濾，濾液減壓濃縮，殘留水混懸液用氯仿萃取，有機層用氫氧化鈉溶液萃取，加入鹽酸調pH值至2.0，離心，沉淀用水洗至中性，真空干燥得大黃蒽醌粗提物。粗提物經硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，濃縮，重結晶得黃色至棕紅色產物。用對照品為參照，經薄層色譜法定性鑒別為大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、蘆薈大黃素及大黃酸。以大黃素對照品為參照， 反相高效液相色譜外標一點法定量分析，色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸(88:12，v/v)，流速1 ml/min，紫外檢測波長254 nm，柱溫40 ℃，進樣體積：20 μl。所得大黃素純度不低于95.0%。純化大黃素的高效液相色譜(HPLC)，見圖1。

圖1 大黃素的高效液相色譜圖

1.4.2 大黃素固相脂質納米粒的制備 采用乳化蒸發-低溫固化法制備固相脂質納米粒。準確稱取自制大黃素6.0 mg，單硬脂酸甘油酯60 mg，加入5 ml丙酮后，置于60 ℃水浴中加熱溶解；取適量聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40 和吐溫-80(3∶1，w/w)，加入20 ml去離子水，使得乳化劑濃度為15%(w/v)，于同樣溫度下加熱溶解。在上述水浴溫度下，將油相逐滴加入到水相中，滴注過程中以1 000 g的速度持續攪拌約2 小時，蒸發除去丙酮。剩余水混懸液快速置于冰水浴中持續攪拌2 小時，水相濾膜過濾，冷凍干燥，即得大黃素固相脂質納米粒。給藥前用純水稀釋至含大黃素質量濃度為1 mg/ml的固相脂質納米粒混懸液。用Sephadex G凝膠柱分離游離藥物和包封藥物，HPLC分析計算包封率和載藥量。

1.4.3 大黃素固相脂質納米粒的表征 透射電鏡下觀察大黃素固相納米粒的形態。馬爾文激光粒度儀分析其粒徑和Zeta電位。以葡聚糖凝膠Sephadex G-50色譜小柱分離大黃素固相脂質納米粒和未包封的大黃素，活化后上樣，用去離子水洗脫，收集帶有乳光的洗脫液，轉移至25 ml容量瓶，用甲醇定容。取同體積的同一批載藥納米粒，不經過凝膠過濾色譜分離，直接加入甲醇定容至25 ml，搖勻。

1.4.4 空白脂質納米粒的制備 按照大黃素固相脂質納米粒的制備方法制備不加大黃素的脂質納米粒。給藥前按與大黃素固相脂質納米粒稀釋相同倍數得混懸液。

1.4.5 大黃素混懸液的制備 配制含0.2%吐溫80和0.5%(w/v)羧甲基纖維素鈉的混合溶液，按每毫升混合溶液加入1.0 mg大黃素，磁力攪拌均勻，即得大黃素混懸液。

1.5 方法

1.5.1 大鼠帕金森模型的建立 Wistar大鼠，用10%水合氯醛按4.0 ml/kg劑量腹腔注射麻醉。之后將大鼠俯臥位固定于大鼠大腦立體定位儀上。剪毛后常規消毒，鈍性分離至暴露頭骨，30%雙氧水和生理鹽水清洗。依照Paxinos and Watson(1986)圖譜，以前囟為標準參考點，牙科鉆開顱，按硬膜下兩點將6-OHDA溶液定位注射于一側紋狀體內。每點注射1.5 μl 6-OHDA溶液(5 μg/μl)，注射速度為0.3 μl/min，留針5 min，術后大鼠置于安靜保溫處直至清醒，自由進食飲水。

1.5.2 分組與給藥 Wistar大鼠隨機分為5組，每組5～10只，其中1～4組進行6-OHDA立體定位注射造模，造模后次日分別口服給予大黃素固相脂質納米?；鞈乙?、空白脂質納米粒混懸液、大黃素混懸液和生理鹽水，單次口服劑量為10 ml/kg (10 mg/kg)，給藥間隔為12小時，連續給藥4周；第5組作為正常大鼠對照組，不給予任何藥物。各組大鼠分別于注射6-OHDA進行紋狀體損傷后第1、2、3和4周進行行為學評價。

1.5.3 取樣與檢測 第4周行為學評價后，處死大鼠，取出腦組織，分離出中腦，稱取重量，加入一定量的pH 7.4磷酸緩沖液，2～8 ℃的溫度下勻漿，3 500 g低溫離心20 分鐘，收集上清。按照試劑盒操作說明(酶聯免疫分析/ELISA)，分別檢測大鼠的中腦組織中單胺氧化酶B(MAO-B)和兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)含量，比較各組間酶含量的變化。含量測定時，先用純化的酶抗體包被微孔板，制成固相抗體。往包被單抗的微孔中加入待測酶對照液或樣品，37 ℃溫育30分鐘，再加入辣根過氧化物酶標記的待測酶抗體，37 ℃溫育30分鐘，經3次洗滌后加底物TMB顯色。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值，X)，分別通過標準曲線計算樣品中MAO-B和COMT的濃度(Y)。

2 結 果

2.1 大黃素固相脂質納米粒的性質 采用乳化蒸發-低溫固化法制備所得的大黃素固相脂質納米粒在透視電鏡下觀察，外觀呈圓球形，平均粒徑介于40～100 nm，與激光粒度分析儀測定結果基本相符。澤塔電位(ZP)值為(-25.2±0.5) mV。柱分離-HPLC法測得平均包封率為51.2%，載藥量為3.6%。見圖2。

圖2 大黃素固相脂質納米粒的透射電鏡圖

2.2 大鼠帕金森模型的評價

2.2.1 APO誘導的旋轉行為 從注射6-OHDA損傷紋狀體手術后第1周開始，大鼠正中頸部皮下注射APO 2.0 ml/kg(0.5 mg/kg)誘導旋轉行為。大鼠旋轉時以健側后肢為支點，原地逆時針旋轉，首尾相接360度為1轉，從皮下注射APO后5 分鐘開始記錄旋轉的次數，觀察30 分鐘；不完全損傷的大鼠會繞1個圈旋轉，也納入造模成功范圍。每周觀察1次，連續4周。至第4周時約90%的術后大鼠能夠發生連續旋轉行為。

2.2.2 大鼠懸空擺動試驗 經中后部尾巴提起大鼠，使大鼠頭處于向下垂直狀態，頭部距離地面約2 cm，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記為擺動1次，記錄提起20次中大鼠頭或上身向左擺動的次數。該指標判斷干擾因素多，但基本能確定有75%的大鼠向左擺動的頻率明顯高于其它方向。

2.2.3 行為學評價 預實驗中，APO誘導的大鼠旋轉行為隨6-OHDA損傷時間延長而加快。而在術后給予藥物干預后，第4周觀察時，大黃素固相脂質納米粒組大鼠旋轉行為與大黃素混懸液組和生理鹽水組相比，均得到一定程度的改善，正常組大鼠無規律性旋轉。

2.3 MAO-B和COMT含量檢測 通過ELISA實驗，得到COMT的標準曲線為Y(ng/g)=(0.0434-2958.12954)/(1+(x/4.70641E7)^(0.72237))+2958.12954，r2=0.98943，線性范圍為8.734～3 694.252 ng/g。同法得到MAO-B標準曲線為Y(ng/g)=(0.09316-3.32865)/[1+(x/58.58028)^(1.22077)]+3.32865，r2=0.99633，線性范圍為0.756～241.62 ng/g。

大黃素固相脂質納米粒與生理鹽水組比較，兩種酶含量均顯著降低；而大黃素混懸液組與生理鹽水組比較，僅MAO-B含量顯著降低。生理鹽水組與空白固相脂質納米粒組比較，兩種酶含量差異均無統計學意義，大黃素固相脂質納米粒組與正常對照組比較，兩種酶含量差異均無統計學意義，而大黃素混懸液組和正常對照組間比較，MAO-B含量差異無統計學意義，但大黃素混懸液組的COMT含量比正常對照組的含量顯著增高。見表1。

表1 考察大黃素及其制劑對6-OHDA誘發帕金森大鼠模型的中腦組織中COMT和MAO-B含量的影響

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與空白固相脂質納米粒組比較，#P<0.05；與大黃素混懸液組比較，△P<0.05

3 討 論

3.1 大黃素固相脂質納米粒的制備 課題組之前進行了大黃素納米乳的制備，雖然解決了大黃素水溶性差、口服生物利用度低的問題[23-24]。但發現所制納米乳長期貯存不穩定，主要表現為乳液由澄清變渾濁，提示乳滴發生聚集，進而會影響口服給藥的吸收。因此，選用生物相容性材料脂肪酸甘油酯類，將大黃素制成了固相脂質納米粒，既增加了穩定性，又避免了選用含氰基高分子材料制備納米粒的生物毒性。連續4周的口服給藥顯示大黃素的體重增加與正常對照組相似，提示大黃素固相脂質納米粒不會對大鼠造成明顯的毒性。

3.2 大鼠帕金森模型的建立 建立帕金森膜型的方法很多，一般選擇雄性大鼠進行造模。諸如大鼠6-OHDA模型、機械損傷大鼠帕金森模型、1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)帕金森模型、魚藤酮大鼠帕金森模型等[25]。其中最常用的是大鼠6-OHDA模型，其也是第一個選擇性破壞兒茶酚胺神經系統的工具藥。模型成功與否的評價手段很多，包括行為學異常、神經病理改變和神經遞質變化、神經毒性評價等。本研究基于預實驗的經驗和節約成本考慮，在挑選帕金森模型大鼠時僅采用了誘導旋轉和懸空擺動。主要依據單側紋狀體注射神經毒素6-OHDA后，皮下注射APO誘導旋轉的方法判斷造模是否成功。

3.3 防治效果的評價 ELISA實驗在加入待測樣本時，有雙抗體夾心一步法和兩步法[26]。預實驗采用雙抗體夾心一步法，即將對照液或樣本和辣根過氧化物酶標記的抗體同時加入到含有酶抗體的微孔板孔中，考察了大黃素固相脂質納米粒給藥模型組的中腦組織中的COMT和MAO-B表達量隨時間的變化趨勢。預實驗結果顯示大黃素固相脂質納米粒給藥模型組的中腦組織中的MAO-B濃度和COMT的OD值(COMT濃度低于檢測限)在4小時和36小時均達到谷值，36小時后又上升。為了能夠分別定量COMT和MAO-B濃度，本實驗采用兩步法(即待測樣本加入后溫育，再加HRP標記的抗體后溫育)，COMT和MAO-B最低檢測濃度分別達到7.834 ng/g和0.756 ng/g。由實驗結果可知，生理鹽水組MAO-B與COMT含量最高，與正常對照組相比差異有統計學意義，結合行為學結果，表明單側紋狀體內兩點注射6-OHDA能夠引起帕金森樣病變；大黃素固相脂質納米粒混懸液組與生理鹽水組間差異有統計學意義，表明大黃素固相脂質納米?？梢燥@著降低模型組腦內兩種酶含量，理論上可以降低兩種酶誘導的多巴胺降解反應。大黃素固相脂質納米粒混懸液組與空白固相脂質納米粒混懸液組間酶含量明顯差異，表明引起兩種酶表達量降低的為藥物大黃素。大黃素固相脂質納米?；鞈乙航M和大黃素混懸液組間的顯著差異顯示固相脂質納米粒劑型在降低COMT表達量作用優于混懸液。而兩種劑型對于MAO-B作用差異無統計學意義，這對進一步研究給藥劑量設計提供參考，也為將來的研究提供新的思路。

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Effect of emodin loaded solid lipid nanoparticles on Parkinson model in rats

Wang Xia1， Meng Min1， Wu Yuqiong2， Li Jincheng3， Shi Yanbin3
1.DepartmentofPhamaceutics，thePeople'sHospitalofGansuProvince，Lanzhou730000，China；2.DepartmentofPhamaceutics，theSecondPeople'sHospitalofGansuProvince，Lanzhou730000，China；3.CollegeofPharmacy，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China

Objective To evaluate therapeutic effect of emodin loaded solid lipid nanoparticles (EMO-SLN) on Parkinson model of rats. Methods EMO-SLN were prepared by applying emulsion evaporation-solidification at low temperature method with glyceryl monostearate and cremophor RH40 as well as polysorbate 80(tween 80) (3:1，w/w). To observe the influence of EMO-SLN in 6-OHDA induced the behavior of Parkinson model rats′， concentration of MAO-B and COMT in middle brain following oral administration， therapeutic effect of EMO-SLN on rats model of Parkinson disease.Results EMO-SLN was spherical in morphology and the diameter was in the range of 40-100 nm. Compared with Parkinson disease model rats divided into normal saline group， rotating behavior of rats in EMO-SLN group and emodin suspension group was improved. Concentrations of MAO-B and COMT in middle brain of Parkinson disease model rats for EMO-SLN group were significantly reduced，while MAO-B concentration in middle brain of emodin suspension group reduced significantly but COMT concentration showed no significant difference compared to normal saline control group. Conclusion EMO-SLN showed effect on 6-OHDA rat model of Parkinson disease by lowering concnentation of COMT and MAO-B， and its therapeutic efficiency is better than that of emodin suspension.

Parkinsonian disorders； emodin; solid lipid nanoparticles

甘肅省自然科學基金(1606RJZA147， 145RJZA026)；蘭州市人才創新創業科技計劃項目(2014-RC-71)

史彥斌， Email：shiyb@lzu.edu.cn

R745.7

A

1004-583X(2017)09-0782-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.09.012

2017-05-23 編輯:張衛國

Correspondingauther:ShiYanbin，Email：shiyb@lzu.edu.cn